利用山梨醇長期保存馬鈴薯試管苗

吳京姬，康哲秀，郎賢波，許震宇，玄春吉

（延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林龍井133400)

利用山梨醇長期保存馬鈴薯試管苗

吳京姬，康哲秀，郎賢波，許震宇，玄春吉*

（延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林龍井133400)

試驗(yàn)以緩慢試管苗生長為策略，建立合理使用山梨醇保存試管苗慢性生長體系，通過適宜的培養(yǎng)溫度和合理的山梨醇濃度使用，使試管苗培養(yǎng)周期由原來的2～3個(gè)月延長至1年，為大規(guī)模保存馬鈴薯試管苗提供技術(shù)基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果表明：添加40 g/L山梨醇的培養(yǎng)基結(jié)合10℃培養(yǎng)室溫度，能夠使多數(shù)馬鈴薯試管苗保存延長至1年，從而能有效節(jié)省成本，減少由于頻繁轉(zhuǎn)接所引起的污染及品種混雜的發(fā)生。

馬鈴薯；試管苗；保存；山梨醇

馬鈴薯是茄科無性繁殖作物，傳統(tǒng)方法以塊莖方式保存，不僅耗費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力，也容易造成人為的種質(zhì)混雜和各種病害的不斷侵染以及病毒的積累，使品種資源優(yōu)勢退化。植物生長調(diào)節(jié)劑作為馬鈴薯種質(zhì)資源保存的添加劑受到廣泛的關(guān)注，并且植物生長調(diào)節(jié)劑在各個(gè)領(lǐng)域均取得了不同成功[1-3]。盡管生長調(diào)節(jié)劑的抑制效果明顯，但后作用時(shí)間長，而且容易導(dǎo)致遺傳變異的發(fā)生。最近幾年延邊農(nóng)業(yè)科學(xué)院選用低濃度的甘露醇來保存試管苗，但在保存過程中出現(xiàn)很多畸形苗。山梨醇單糖是甘露醇的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，其作用與甘露醇相似但副作用較弱，現(xiàn)已廣泛用于醫(yī)藥、食品和化工行業(yè)。Gopal等[4]以適量的山梨醇作為培養(yǎng)基添加劑在常溫下可保存馬鈴薯種質(zhì)資源達(dá)12個(gè)月之久。本研究以緩慢試管苗生長為策略，建立合理使用山梨醇保存試管苗慢性生長體系，通過適宜的培養(yǎng)溫度和合理的山梨醇濃度使用，使試管苗培養(yǎng)周期由原來的2～3個(gè)月延長至1年，為大規(guī)模保存馬鈴薯試管苗提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 甘露醇與不同山梨醇濃度對馬鈴薯試管苗抑制作用的比較

為了比較添加甘露醇與添加山梨醇的培養(yǎng)基對馬鈴薯試管苗生長的抑制效應(yīng)，以品種‘延薯4號’（中晚熟）為試管苗的材料，以常規(guī)保存培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)置20 g/L甘露醇，山梨醇20,30,40,50 g/L 5個(gè)處理，以不添加甘露醇和山梨醇的處理為對照（CK）。每個(gè)處理接種50個(gè)試管（180 mm×17 mm）時(shí)，每一管接種2個(gè)帶葉芽節(jié)段（不含頂芽）。置于溫度為20℃，光照16 h/d光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。6個(gè)月時(shí)隨機(jī)取5個(gè)試管測量試管苗的株高，取平均值。6個(gè)月后每個(gè)月統(tǒng)計(jì)試管苗的整體存活率。

1.2 山梨醇與不同溫度對馬鈴薯試管苗保存生長的影響

以馬鈴薯早熟品種‘費(fèi)烏瑞它’為試管苗材料，保存培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基加40 g/L山梨醇，溫度分別設(shè)為10,15,20℃。每個(gè)處理分別接種50個(gè)試管，光照16 h/d。從接種后第6個(gè)月開始每個(gè)月統(tǒng)計(jì)試管苗的存活率。

1.3 山梨醇對不同品種試管苗生長延緩的作用

選擇早熟品種‘費(fèi)烏瑞它’，中早熟品種‘尤金’，中晚熟品種‘延薯4號’為試管苗材料，保存培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基加40 g/L山梨醇，每個(gè)品種各接種50管試管苗，接種后置于溫度為10℃，光照16 h/d，光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。6個(gè)月后每個(gè)月統(tǒng)計(jì)試管苗的整體存活率。

1.4 保存一年后的試管苗恢復(fù)生長后形態(tài)異常情況鑒定

以添加40 g/L山梨醇培養(yǎng)期為一年的試管苗為材料，按照馬鈴薯試管苗繼代方法，接種于MS擴(kuò)繁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度20～25℃，光照16 h/d。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘露醇與不同山梨醇濃度對馬鈴薯試管苗抑制作用的比較

試驗(yàn)以馬鈴薯品種‘延薯4號’為材料，比較培養(yǎng)基中添加甘露醇與不同濃度山梨醇對試管苗的抑制效應(yīng)。觀察表明，CK試管苗培養(yǎng)1個(gè)月左右，主莖就達(dá)到株高最大值，接著試管苗開始分枝，分枝絕大部分發(fā)生在試管苗上部位，多而纖細(xì)。培養(yǎng)2個(gè)月左右時(shí)分枝長滿整個(gè)試管，試管苗基部莖和葉片出現(xiàn)枯黃，到第3個(gè)月時(shí)試管苗幾乎枯萎死亡，存活率只有32%。與CK相比，添加20 g/L甘露醇處理比對照生長速度緩慢，但培養(yǎng)時(shí)間超過3個(gè)月后，試管苗上部節(jié)位開始大量出現(xiàn)分枝，4個(gè)月后開始出現(xiàn)枯死現(xiàn)象，到第6個(gè)月時(shí)近40%的試管苗死亡。之后枯萎速度更快，到第9個(gè)月時(shí)，存活率僅有20%。由此可見，20 g/L甘露醇最長能保存6個(gè)月左右（圖1）。

添加山梨醇的培養(yǎng)基中馬鈴薯試管苗生長速度均有不同程度的延緩作用（圖2）。由圖1可以看出40 g/L山梨醇處理的試管苗存活率高于其它處理，培養(yǎng)12個(gè)月后存活率能達(dá)到80%，并且植株仍較健康。

2.2 山梨醇與不同溫度對馬鈴薯試管苗保存生長的影響

圖1 在20 g/L甘露醇與不同山梨醇濃度培養(yǎng)基中各培養(yǎng)時(shí)期試管苗的存活率Figure 1Survival rate of plantlets in vitro cultured on medium supplemented with 20 g/L mannitol and various levels of sorbitol for different times

圖2 在20 g/L甘露醇與不同山梨醇濃度培養(yǎng)基中各培養(yǎng)時(shí)期試管苗的株高Figure 2Height of plantlets in vitro cultured on medium supplemented with 20 g/L mannitoland various levels of sorbitol for different times

培養(yǎng)基中添加20 g/L甘露醇對馬鈴薯試管苗生長有一定的延緩作用，嚴(yán)格控制溫度在17～20℃，最多能保存5～6個(gè)月。而添加山梨醇的培養(yǎng)基對試管苗的延緩作用更明顯。為了進(jìn)一步確定山梨醇的使用濃度和適宜的培養(yǎng)溫度，建立試管苗保存培養(yǎng)周期至少為1年的培養(yǎng)體系，在前述研究的基礎(chǔ)上，選擇40 g/L山梨醇濃度和3個(gè)培養(yǎng)溫度，進(jìn)行試管苗保存培養(yǎng)。

結(jié)果顯示，試管苗在10℃處理中比在15℃和20℃處理中的生長速度明顯要慢。10℃處理時(shí)培養(yǎng)1年試管苗的存活率明顯高于15℃和20℃處理，存活率達(dá)到了70%以上，見圖3。

2.3 山梨醇對不同熟期品種試管苗生長延緩的作用

圖340 g/L山梨醇濃度培養(yǎng)基中不同培養(yǎng)溫度條件各培養(yǎng)時(shí)期試管苗的存活率Figure 3Survival rate of plantlets in vitro cultured on medium supptemented with 40 g/L sirbutik at different temperatures for different times

為了證明40 g/L山梨醇處理是否適合所有保存的品種，我們選擇了3個(gè)不同熟期品種做了比較。結(jié)果表明早熟品種‘費(fèi)烏瑞它’生長速度快于其他兩個(gè)品種，培養(yǎng)一個(gè)月的試管苗幾乎已經(jīng)滿瓶。‘延薯4號’生長速度慢于‘費(fèi)烏瑞它’和‘尤金’。3個(gè)品種培養(yǎng)12個(gè)月以后存活率都達(dá)到了60%以上。由此表明，40 g/L山梨醇處理對不同時(shí)期馬鈴薯試管苗都有一定的延緩作用且存活率都比較高（圖4）。

2.4 試管苗恢復(fù)生長后形態(tài)異常情況鑒定

試管苗培養(yǎng)一周后新芽很快長出，一個(gè)月以后植株生長旺盛健康，根部生長正常，未出現(xiàn)明顯的生理抑制現(xiàn)象（圖5）。

圖4 不同品種在添加40 g/L山梨醇培養(yǎng)基中各培養(yǎng)時(shí)期的存活率Figure 4Survival rate of plantletsin vitroof different varieties cultured on mediumsupplemented with 40%sorbitol for deferent times

圖5 試管苗恢復(fù)生長1個(gè)月后情況Figure 5Growth of preserved plantletsin vitroone month after recovery

3 討論

試管苗保存（或離體保存）是目前馬鈴薯資源保存中應(yīng)用最普遍的方式。緩慢生長保存是通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境條件以及培養(yǎng)基物質(zhì)組成，使試管苗慢性生長或停止生長，以達(dá)到長期保存的目的，而在需要利用時(shí)可迅速恢復(fù)正常生長。緩慢生長保存方式可以減少繼代次數(shù)，節(jié)約大量人力和物力，減少因頻繁操作導(dǎo)致的機(jī)械混雜或污染退化等問題。

甘露醇是一種不易被植物吸收的蔗糖醇，有報(bào)道顯示，馬鈴薯試管苗在添加甘露醇的培養(yǎng)基長期保存后，超過90%基因型會(huì)產(chǎn)生不同程度的變異。本試驗(yàn)的早期研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的效果不明顯，超過3%的濃度對植株生長有嚴(yán)重抑制作用，表現(xiàn)為試管苗頂部膨大結(jié)薯，大部分出現(xiàn)畸形苗。

在培養(yǎng)基中添加山梨醇可以降低培養(yǎng)基的水勢，從而造成不同程度的水分脅迫，進(jìn)而影響馬鈴薯試管苗的地上部莖段、葉片以及根系的生長和發(fā)育。試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，長期保存的試管苗的存活率與植株的生長速率有關(guān)聯(lián)，只有延緩試管苗的生長速度，才有可能使長期保存的試管苗得到較高的成活率。

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，添加40 g/L山梨醇的培養(yǎng)基結(jié)合10℃的培養(yǎng)室溫度，能夠使多數(shù)馬鈴薯試管苗保存延長至1年，從而能有效節(jié)省成本，減少由于頻繁轉(zhuǎn)接所引起的污染及品種混雜現(xiàn)象的發(fā)生。

[1]華婧,王關(guān)林,王靜,等.縮節(jié)胺在脫毒馬鈴薯組培快繁中的應(yīng)用[J].植物生理學(xué)通訊,2007,43(6):1113-1114.

[2]艾辛,夏志蘭,劉明月,等.植物生長調(diào)節(jié)劑對馬鈴薯試管苗生長和保存的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2005,31 (5):514-517.

[3]阮龍,王鈺,嚴(yán)平,等.多效唑在馬鈴薯試管苗上的應(yīng)用研究[J].雜糧作物,2005,25(1):32-34.

[4]Gopal J,Chamail A,Sarkar D.Slow-growth in vitro of potato germplasmatnormalpropagationtemperature[J]．PotatoResearch, 2002,45:203-213.

Long Term Conservation of Potato Plantlets in vitro by Using Sorbitol

WU Jingji,KANG Zhexiu,LANG Xianbo,XU Zhenyu,XUAN Chunji＊
(Yanbian Academy of Agricultural Sciences,Longjing,Jilin 133400,China)

The aim of this research was to establish slow growth system of plantlets in vitro by addition of sorbitol to medium based on the strategy of slow growth,and extend the subculture cycle from 2-3 months to 1 year by optimization of sorbitol concentration and culture temperature,thereby providing technique support for preservation of plantlets in vitro on large scale.The results indicated that use of medium supplemented with 40 g/L sorbitol,combined with 10℃culture temperature,could extend the subculture cycle to 1 year for some varieties tested,therefore reducing cost,and avoiding the contaminationandmixtureduetofrequentsubculture.

potato;plantlets in vitro;preservation;sorbitol

S532

B

1672－3635（2014）01-0014-04

2013-12-20

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金資助（CARS-10-ES07）。

吳京姬（1981-），女，碩士，助理研究員，主要從事馬鈴薯組織培養(yǎng)及病毒檢測研究。

玄春吉，研究員，主要從事馬鈴薯栽培及種薯生產(chǎn)研究,E-mail:xuanchunji@126.com。