蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）外套膜蛋白的分離提取及功能特性

梁姍姍，劉俊榮，馬永生，吳 忠，閆瑞霞，李 芳

（大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023）

貝類在中國漁業經濟活動中占有非常重要的地位，2007年底我國啟動了一項“農業產業技術體系建設”的科技支撐項目，貝類被納入其中[1]。2010年，全國海水貝類總產量達1 224.2萬 t，占水產品總產量的22.8%[2]，其中蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis）是我國北方的主要養殖經濟貝類之一。扇貝外套膜占扇貝總質量的8%左右[3]，是扇貝加工過程中產生的副產物。扇貝外套膜中含有大量的泥沙，極難去除，因為個體較小，加工比較困難，費時費力，因此直接加工制成的食用產品價格偏高，外觀和口感都較差，一直不被消費者所接受。只有少部分作為動物飼料低價出售，造成資源的浪費。

扇貝外套膜中含有豐富的營養物質，其中蛋白質的含量很高，是一種很有價值的蛋白質源[4]。近年來，國內外學者對扇貝外套膜生理活性物質的提取研究較多，研究發現扇貝外套膜的提取物具有降血脂、抗病毒、抗衰老等多種生理功能[5-6]，但從食用角度出發，對其蛋白質進行分離提取的研究較少。本研究以扇貝外套膜為原料，通過等電點絮凝法提取外套膜分離蛋白，以便進一步開發功能性食品蛋白質配料，進而為扇貝外套膜高附加值的開發應用探索新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活的蝦夷扇貝購自大連長興水產品市場，將新鮮原料去殼，取出扇貝柱，然后將扇貝全邊中的消化腺、生殖腺除去，用清水沖洗干凈，瀝干即得蝦夷扇貝外套膜。封裝標記后置于冰箱中-20 ℃凍存備用。

氫氧化鈉 天津市科密歐化學試劑有限公司；鹽酸北京北化精細化學品有限責任公司；硫酸銅 沈陽聯邦試劑廠；硫酸鉀 天津博迪化工股份有限公司；乙醚天津市津東天正精細化學試劑廠；十二烷基磺酸鈉、考馬斯亮藍R-250、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；721型分光光度計 上海光譜儀器有限公司；MV-Ⅲ垂直平板電泳槽 大連競邁生物科技有限公司；CR-410色彩色差儀 柯尼卡美能達投資有限公司；FJ-200高速分散均質機 上海標本模型廠。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質的溶解與回收

冷凍蝦夷扇貝外套膜置于室溫下解凍，在半解凍狀態下切碎后稱取200 g，按1∶9（m/V）的比例加入去離子水，攪拌均勻后倒入勻漿機中勻漿2 min。漿液溫度保持在10 ℃以下。勻漿液分裝22份，每份50 mL，以0.5個pH值為梯度，一部分用2 mol/L HCl依次調節pH 1.5（酸處理），另一部分用2 mol/L NaOH依次調節pH值到12.0（堿處理）。用高速冷凍離心機4 ℃、9 000 r/min離心20 min，取中層清液，用2 mol/L HCl或2 mol/L NaOH調節蝦夷扇貝外套膜溶出物至等電點沉淀蛋白質，4 ℃、9 000 r/min離心20 min，得到分離蛋白和未回收溶出物。

1.3.2 理化指標測定

水分測定采用GB/T5009.3—2003《食品中水分的測定》直接干燥法；粗脂肪測定采用GB/T5009.6—2003《食品中脂肪的測定》索氏抽提法；粗蛋白的測定采用GB/T5009.5—2003《食品中蛋白質的測定》微量凱氏定氮法；灰分的測定采用GB/T5009.4—2003《食品中灰分的測定》灼燒稱質量法。

1.3.3 蛋白質溶解度和回收率的測定

采用雙縮脲法測定總蛋白及上層清液中蛋白質的含量[7]，用721型分光光度計在波長540 nm測定其吸光度。蛋白質溶解度與回收率的計算公式參見傅潤澤等[8]的方法。

以0.5個pH值為梯度測定扇貝蛋白在pH值1.5～12.0范圍的蛋白質溶解度和回收率，計算公式如式（1）、（2）所示。

式中：m1為第1次離心中層清液蛋白質質量/g；m2為第2次離心上清液蛋白質質量/g；m3為總蛋白質質量/g。

1.3.4 蛋白質分子質量分析

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）對酸堿提取過程中各部分的蛋白質組成進行分析。選取pH 1.5、12.0兩個pH值點。分析的樣品包括勻漿液、分離蛋白、未溶解沉淀物及未回收溶出物。樣品與4×SDS樣品緩沖液以3∶1的體積比混合，加入5%的β-巰基乙醇，在95 ℃條件下水浴10 min，在5%濃縮膠、12%分離膠下進行電泳。電泳膠用考馬斯亮藍R250染色，脫色液脫色。

1.3.5 蛋白質功能特性

蛋白質的持水性測定方法為[9]，稱取0.5 g樣品（m）置于已知質量的離心管（m1）中，加入20 mL蒸餾水。在室溫下攪拌，使蛋白質溶液成漿狀；靜置30 min后，在3 000 r/min離心20 min；棄去上清液，再次稱量離心管（m2），按照公式（3）計算持水性。

蛋白質持油性的測定方法為[10]：稱取0.5 g樣品（m）置于已知質量（m1）的離心管中，加入10 mL大豆油，攪拌混合物使其均勻，靜置30 min后，在3 000 r/min下離心20 min，棄去上清液，再次稱離心管質量（m2），按照公式（4）計算持油性。

蛋白質的起泡性和泡沫穩定性的測定方法為[11]：將測試蛋白配制成5 g/100 mL的水懸液，取30 mL放入100 mL離心管中，用高速均質機均質2 min，立即記錄此時溶液上部泡沫體積，靜置30 min后，再次記錄其泡沫體積。按照公式（5）、（6）計算起泡性和泡沫穩定性。

乳化性和乳化穩定性的測定采用濁度法[12]。配制1 g/100 mL的蛋白液，取5 mL大豆油與15 mL待測溶液于均質機中均質2 min，分別于0、10 min時從底部取50 μL，用0.1%SDS稀釋100 倍后測OD500nm。按照公式（7）、（8）計算乳化性和乳化穩定性。

式中：n為稀釋倍數；A為500 nm波長處的吸光度；φ為油相所占的分數，本實驗中油相占1/4；ρ為0.01，即蛋白質的質量濃度/（g/mL）。

式中：A0為0 min時的乳化液500 nm波長處的吸光度；t為靜置時間（10 min）；A10為乳化液靜置10 min后的吸光度。

1.3.6 色度分析

使用CR-410色彩色差儀來確定分離蛋白及原料的顏色特性，每個樣品測量3次，得到L*、a*和b*值，其中L*值表示產品的亮度即從黑（0）到白（100）的顏色，a*值表示紅度（＋）或綠度（-）值，正值越大偏向紅色的程度越大，負值越大偏向綠色的程度越大；b*值表示黃度（＋）或藍度（-）值，正值越大偏向黃色的程度越大，負值越大偏向藍色的程度越大；白度則根據式（9）計算[13]。

1.4 統計分析

2 結果與分析

2.1 蝦夷扇貝外套膜蛋白溶解度的變化規律

蛋白質的溶出不僅是等電點絮凝回收的前提，而且，在溶出過程中還可以使色素、脂肪、灰分以及結締組織等成分與蛋白質分離[14-15]。在pH 1.5～12.0范圍內，蝦夷扇貝外套膜蛋白質的溶解規律如圖1所示。

圖1 扇貝外套膜蛋白質在不同pH值的溶解度變化曲線Fig.1 Solubility of Patinopecten yessoensis mantle proteins as a function of pH

由圖1可知，在酸性及堿性環境下，蛋白質最大溶解度均出現在極端pH值條件下，分別為pH 1.5和pH 12.0，在酸性的pH 4.0以下和堿性的pH 9.0以上時，蛋白質的溶解度均急劇增加，這要歸因于肌肉蛋白質分子所帶的凈正電荷或凈負電荷增加。帶同種電荷的蛋白質分子之間相互排斥，從而保證蛋白質分子處于分離狀態；同 時帶電的蛋白質分子與水分子之間形成離子-偶極作用而被溶劑化[16]。在pH 4.0～9.0內，蛋白質分子所帶凈電荷不足，與水分子間的作用較弱，蛋白質分子之間趨于相互作用，所表現出的溶解度也不高，這與Undeland[17]、Gehring[18]等的研究結果相似。在pH 4.5～5.0時溶解度最低，此為扇貝外套膜蛋白質的等電點。與之相比，通常魚肉蛋白質的等電點為pH 5.5，這可能是由于扇貝外套膜與魚肉蛋白質在蛋白質的組成與結構方面存在一定的差異性。

2.2 蝦夷扇貝外套膜蛋白質回收率的變化規律

圖2 蝦夷扇貝外套膜蛋白質在不同pH值的回收率變化曲線Fig.2 Recovery rate of Patinopect en yessoensis mantle proteins as a function of pH

圖3 蝦夷扇貝外套膜蛋白質溶解度與回收率的相關性分析Fig.3 Correlation analysis between Patinopecten yessoensis mantle protein solubility and recovery rate

由圖2可知，回收率變化規律與溶解度變化規律基本一致。由圖3可知，二者具有十分顯著的相關性，相關系數R2=0.998 7。無論是酸處理還是堿處理，蛋白質的最大回收率均發生在其溶解度最高的pH值點，分別為83.31%及90.75%。與魚類分離蛋白回收率（60%～80%）相比[8]，蝦夷扇貝外套膜蛋白質回收率相對較高。

2.3 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白分子質量分析

利用SDS-PAGE法對蝦夷扇貝外套膜分離蛋白及其制備過程中未回收部分 中各組分蛋白質的分子質量進行分析，結果見圖4、5。

圖4 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.4 SDS-PAGE of the protein isolates extracted from Patinopecten yessoensis mantle

圖5 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白制備過程中未回收部分的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.5 SDS-PAGE of unrecovered protein fractions during Patinopecten yes soensis mantle protein isolation

由圖4可知，蝦夷扇貝外套膜主要蛋白質組分有肌球蛋白、副肌球蛋白、肌動蛋白以及原肌球蛋白等，而酸分離蛋白和 堿分離蛋白的條帶與原料很相似。扇貝是無脊椎動物，其蛋白質的組成及結構與脊椎動物存在一定的 差異性，分布在100 kD附近的蛋白質條帶是副肌球蛋白，它是無脊椎動物特有的肌原纖維蛋白質[19]。由圖5可知，酸溶和堿溶過程有少量蛋白質未被溶出，堿處理未溶出沉淀中的蛋白條帶較酸處理的多，泳道3和4中酸處理和堿處理未回收溶出物的蛋白質分子質量都在40 kD左右。對比圖4、5可知，等電點絮凝法能夠有效回收大部分的蛋白質溶出物組分，使得未回收溶出物的蛋白含量很低，造成條帶的不清晰或無條帶。

2.4 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白基本成分分析

表1 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白的基本成分（ ±s，n=3）Table 1 Proximate composition ofPatinopecten yessoensis mantle protein isolateess ( ±s, n=3)

表1 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白的基本成分（ ±s，n=3）Table 1 Proximate composition ofPatinopecten yessoensis mantle protein isolateess ( ±s, n=3)

注：同列字母不同，表示差異顯著（P＜0.05）。下同。

產物 蛋白質含量/% 脂肪含量/% 灰分含量/%扇貝外套膜 77.78±0.79a 3.55±0.24a 3.17±0.06a酸分離蛋白 80.21±0.33b 1.02±0.06b 2.67±0.05b堿分離蛋白 84.28±0.95c 0.80±0.02b 1.81±0.18c

由表1可知，與原料扇貝外套膜相比，酸、堿分離蛋白均有較高的蛋白質純度，分別為酸分離蛋白的80.21%及堿分離蛋白的84.28%。酸法回收蛋白與堿法回收蛋白脂肪含量得到明顯降低，從原料的3.55%分別下降到1.02%及0.80%，脂肪含量較低，更利于貯存，這說明分離處理能夠有效去除原料中的脂肪。

2.5 蝦夷扇貝外套膜及其分離蛋白的色度分析

產品的色澤外觀是影響產品感官特性的第一因素，表2比較了酸法分離蛋白、堿法分離蛋白與原料扇貝外套膜的顏色差別。與原料相比，酸分離蛋白和堿分離蛋白均表現出較高的白度，其中酸分離蛋白的白度更高，對于魚類肌肉，通常其堿分離蛋白的白度要高于酸分離蛋白[20]，這可能是由于堿法能夠去除更多的血紅蛋白。堿法處理后，在等電點范圍內有大量的血紅蛋白處于溶解狀態，未被沉淀出來，從而與其他蛋白分離，而酸法處理則恰恰相反[13]，但也有相反的研究報道[21]。酸分離蛋白和堿分離蛋白的亮度L*均有顯著提升，a*和b*都為正值，且都有下降，a*值反映的是紅值，b*值反映的是黃值，紅值和黃值均減小說明兩種方法都能有效地去除部分的天然色素類物質，兩種蛋白的白度均大于原料，說明兩種蛋白的感官接受度較原料均有提高。

表2 蝦夷扇貝外套膜及其分離蛋白的色度值（ ±s，n=3）Table 2 Color values of Patinopecten yessoensis mantle and proteiinn isolates (±s, n =3)

表2 蝦夷扇貝外套膜及其分離蛋白的色度值（ ±s，n=3）Table 2 Color values of Patinopecten yessoensis mantle and proteiinn isolates (±s, n =3)

指標 扇貝外套膜 酸分離蛋白 堿分離蛋白L* 60.65±0.09a 68.55±0.16c 67.20±0.31b a* 4.97±0.20a 3.48±0.07c 2.78±0.06b b* 12.55±0.14a 11.02±0.28b 12.17±0.22a白度 58.40±0.04a 66.49±0.22b 6 4.91±0.26c

2.6 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白功能特性

表3 蝦夷扇貝外套膜分離蛋白的功能性質Table 3 Functional properties of Patinopecten yessoensis mantle protein isolates

由表3可知，與大豆蛋白相比，酸法與堿法分離蛋白除了持油性稍高，其他包括持水性、發泡性和乳化性都較差，因此需要進一步研究來提高蝦夷扇貝外套膜分離蛋白的功能性，從而增強其在食品中的應用性。

3 結 論

等電點絮凝法能有效地對蝦夷扇貝外套膜蛋白質進行分離回收。研究發現蝦夷扇貝外套膜蛋白質的等電點在pH 4.5～5.0范圍內；分離產物不僅蛋白質純度高，且有明顯的脫脂及脫色效果。總之，等電點絮凝法對于開發利用蝦夷扇貝外套膜蛋白質極具潛力。今后，就分離蛋白的功能性開發方面，有待進一步研究。

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