牛肉成熟過程中氧化對鈣激活酶活性及降解的影響

陳茜茜，黃 明，周光宏，徐幸蓮

(南京農業大學食品科技學院，肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095)

動物的肌肉組織在屠宰后的成熟過程中會發生結締組織松散、Z線降解和肌原纖維蛋白及細胞骨架蛋白水解等變化，使肌肉的僵直解除、持水力加強、嫩度提高，從而很大程度改善了肉的食用品質[1]。目前研究發現骨骼肌中內源酶與肉類的成熟嫩化過程聯系密切，主要包括鈣激活酶體系、溶酶體組織蛋白酶類和細胞凋亡酶體系[2-3]。其中鈣激活酶在肉類宰后成熟過程中的重要作用已被大量的研究報道所證實。有研究發現用鈣激活酶在體外孵育肌原纖維蛋白能完全模擬自然成熟條件下伴肌動蛋白、伴肌球蛋白、肌間線蛋白和肌鈣蛋白-T等蛋白的降解情況[4]。向雞肉中注射鈣激活酶抑制劑后，部分關鍵肌原纖維蛋白的降解顯著降低，雞肉的嫩度變差[5]。成熟過程中不同物種之間的嫩化程度差異與鈣激活酶抑制蛋白和鈣激活酶的表達量之比之間也被證實存在負相關性[6]。在肉類的宰后成熟過程中，鈣激活酶對部分關鍵肌原纖維蛋白如伴肌球蛋白、伴肌動蛋白、肌間線蛋白及肌鈣蛋白-T等的降解作用改善了肉的嫩度、風味、持水力等品質[7]。由此可知，鈣激活酶在肉類成熟機制中起著極為重要的作用[8]。

肌肉組織中富含亞鐵血紅素、不飽和脂肪酸、金屬催化劑等促氧化因子，因此在肉類宰后成熟、加工、運輸及貯藏過程中，肌肉組織極易被氧自由基攻擊。現有研究均集中于肌肉組織中的脂肪和蛋白質氧化對肉的食用品質如肉色、嫩度、持水力、風味及營養價值的影響。如脂肪氧化會造成紅肉的肉色褪色和酸敗，形成不良風味[9]；而添加一些抗氧化劑如VC、VE則可以抑制蛋白質氧化而使肉色保持鮮紅[10]；經過輻照處理的牛肉在宰后成熟過程中剪切力明顯高于對照組，即嫩度降低[11]；純化的肌原纖維蛋白在體外被H2O2氧化后持水力降低[12]；賴氨酸、精氨酸等必需氨基酸的結構在蛋白質氧化過程中會被不可逆轉的修飾，因此肉類蛋白質的營養價值也相應降低[13]。

但是，氧化引起這些品質變化的具體機制尚未被明確闡述，仍需要深入的研究。大部分研究主要圍繞氧化對肌原纖維蛋白降解的影響。有研究將純化的肌原纖維蛋白和純化 -鈣激活酶氧化后，再分別與 -鈣激活酶和肌原纖維蛋白孵育，結果顯示與嫩度密切相關的鈣激活酶-T的降解均被抑制[14-15]。鈣激活酶是一類半胱氨酸蛋白酶，其活性位點上的半胱氨酸殘基是各類氨基酸中最易被氧化的[13,16]，且與羥基自由基的反應活性較強[17]。據此推斷氧化是通過改變鈣激活酶的中心活性基團進而改變其對肌原纖維蛋白的降解作用，然而這方面的報道較少，因此研究氧化對鈣激活酶結構和活性的影響十分必要。本實驗對牛肉體外注射氧化劑，通過活性電泳(casein zymography)和蛋白免疫印跡（Western blotting）研究鈣激活酶在牛肉自然成熟過程中的活性及降解變化，旨在闡明氧化條件下的鈣激活酶和關鍵肌原纖維蛋白之間的作用機制，為全面闡述氧化對肉類成熟的影響機制提供科學依據，并為實際生產過程中肉類品質的改善提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取3頭年齡約2.5歲、活體質量約500 kg、宰后20 min內的魯西黃牛背最長肌，牛來源于安徽翰森荷金來屠宰場。

Clone 9A4H8D3鼠單克隆抗μ-鈣激活酶 美國Abcam公司；過氧化物酶標記的抗鼠免疫球蛋白 美國Bio-Rad公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜 美國Millipore公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒和酶放大化學發光免疫分析（ECL）試劑盒 美國Thermo公司：牛血清白蛋白 美國Promega 公司；酪蛋白 美國Sigma公司；FeSO4、H2O2、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）、乙二胺四乙酸（EDTA）、TritonX-100均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

U410型超低溫冰柜 日本日立公司；Spectramax M2酶標儀 美國MD公司；AUY120型電子分析天平日本Shimadzu公司；Ultra Turrax T25高速勻漿器 德國Basis公司；HANNA 211 型pH計 意大利Hanna公司；Beckman冷凍離心機 美國Avanti J-E公司；小型垂直電泳系統和凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

取3條背最長肌作為3組平行，每條背最長肌切出20塊，并將這20塊隨機平均分為4組，分別注射4個濃度的氧化劑：0 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl（O1組）、50 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl（O2組）、200 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl（O3組）、500 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl（O4組）。注射量為肉質量的5%。隨后立即真空包裝。另外兩條背最長肌作相同處理。將樣品置于4 ℃存放0、1、3、7、14 d后取樣，每個處理均取3個樣。

1.3.1 鈣激活酶提取與電泳樣品制備

參照Camou等[18]的方法，取1 g已剔除結締組織的肉樣，加入3倍體積的提取液（100mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、體積分數0.05%β-巰基乙醇，pH 8.3）。使用高速勻漿機在4 ℃、15 000 r/min條件下勻漿30 s，每隔10 s間隔10 s。然后在20 000×g、4 ℃條件下離心30 min。取上清液，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度并統一調整。

活性電泳樣品制定：按1∶1（V/V）的比例加入樣品處理液（150 mmol/L Tris-HCl、20%甘油、0.75%β-巰基乙醇、0.02%溴酚藍，pH 6.8），隨即放入-80 ℃冰箱備用。

SDS-PAGE電泳樣品制定：按1∶1（V/V）的比例加入樣品處理液（30 mmol/L Tris-HCl、3 mmol/L EDTA、3%SDS、20%甘油、8%巰基乙醇、0.04%溴酚藍，pH 8.0），50 ℃水浴20 min，隨即放入-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 活性電泳[19]測定鈣激活酶活性

本實驗中使用0.75 mm的膠板，12.5%的分離膠（1.5 mmol/L Tris-HCl、pH 8.8，丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺75∶1（m/m），0.05 g/100 mL過硫酸銨，0.05 g/100 mL四甲基乙二胺（TEMED），2.1 mg/mL酪蛋白）和4%的濃縮膠（125 mmol/L T r i s-H C l、p H 6.8，丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺75∶1（m/m），0.05 g/100 mL過硫酸銨，0.05 g/100 mLTEMED）。恒壓100 V預跑15 min后上樣40 μg蛋白，繼續跑5 h。電泳完成后，用孵育液洗膠3次，每次20 min，隨后將膠放入孵育液室溫下反應16 h。考馬斯亮藍R-250染色液染色1 h，脫色過夜后用GelDox凝膠成像系統獲取圖像。

1.3.3 蛋白免疫印跡法[20]分析鈣激活酶的降解

采用1.0 mm的膠板，10%的分離膠（1.5 mol/L Tris-HCl、pH 8.8，丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺37.5∶1（m/m），0.1 g/100 mL SDS，0.05 g/100 mL過硫酸銨，0.05 g/100 mL TEMED）和4%的濃縮膠（0.5mol/L Tris-HCl、pH 6.8，丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺37.5∶1（m/m），0.1 g/100 mL的SDS，0.05 g/100 mL過硫酸銨，0.05 g/100 mL TEMED進行SDS-PAGE電泳，上樣量為40 μ g，恒壓80 V跑20 min后，恒壓120 V繼續跑90 min。電泳結束后，采用濕法轉印，將凝膠置于轉印液（20 mmol/L Tris、192 mmol/L甘氨酸、15%甲醇）中恒流200 mA轉印90 min，待蛋白轉印到PVDF膜后，將PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉的TTBS溶液（500 mmol/L NaCl、30 mmol/L Tris-HCl、0.05%吐溫-20，pH 7.5）中于室溫封閉2 h。然后將膜與1∶500稀釋的鼠單克隆抗μ-鈣激活酶在4 ℃條件下反應過夜后，用Tris-吐溫鹽緩沖液（全稱，TTBS）漂洗4次，每次10 min。再與按1∶5 000稀釋的過氧化物酶標記的抗鼠免疫球蛋白溶液室溫反應2h，繼續用TTBS漂洗4次。最后用ECL法顯色。

1.3.4 μ-鈣激活酶的半定量分析

采用Quanity-One分析軟件對蛋白免疫印跡條帶光密度值進行半定量；μ-鈣激活酶免疫印跡條帶相對光密度值分別為目標條帶光密度值與宰后0 d未氧化處理組蛋白條帶光密度值的比值。

1.4 統計分析

每組樣品做3組平行，采用SPSS16.0統計軟件進行單因素方差分析，不同氧化處理組和不同成熟時間之間的差異使用鄧肯多重比較，P＜0.05為顯著水平。

2 結果與分析

2.1 體外氧化對牛肉自然成熟過程中鈣激活酶活性的影響

通過活性電泳分析在氧化條件下牛肉宰后成熟過程中鈣激活酶的活性變化（圖1），并對μ-鈣激活酶的活性條帶進行半定量，得到其相對光密度值（圖2）。宰后0 d和1 d時，氧化對μ-鈣激活酶和m-鈣激活酶的活性幾乎沒有影響，各氧化組的相對光密度值均無顯著差異（P＞0.05）。成熟3 d時，μ-鈣激活酶活性較0 d時有所降低，此時高氧化組的μ-鈣激活酶活性條帶的相對光密度值為68.38%，較未氧化組有顯著差異（P＜0.05）。7 d以后，活性電泳圖顯示，隨著氧化劑濃度的提高，μ-鈣激活酶活性受到抑制。當氧化劑濃度為50 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl和200 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl時，μ-鈣激活酶活性與未氧化組相比受到輕微抑制，而當氧化劑濃度為500 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl時，μ-鈣激活酶活性被顯著抑制，此時m-鈣激活酶活性條帶與0、1、3 d相比幾乎沒有變化。牛肉宰后成熟14 d后，活性電泳僅能檢測到μ-鈣激活酶的微弱活性，且μ-鈣激活酶活性隨著氧化劑濃度的提高而越來越弱，高氧化組的μ-鈣激活酶活性條帶的相對光密度值僅為5.97%，與其他各組相比均有顯著差異（P＜0.05）。結果顯示氧化能夠抑制牛肉宰后成熟過程中μ-鈣激活酶的活性，這與Carlin等[21]的研究結果一致，他們發現當pH值范圍為6.0～7.5，離子強度分別為165 mmol/L和295 mmol/L時，H2O2的加入能顯著抑制豬肉中μ-鈣激活酶的活性。同時，隨著牛肉宰后成熟時間的增長，未氧化組的鈣激活酶活性逐漸降低，尤其成熟14 d后的活性條帶非常微弱（圖1），因此宰后儲藏時間過長會對鈣激活酶活性產生較大影響。

圖2 不同氧化水平對牛肉宰后成熟過程中 -鈣激活酶活性條帶的相對光密度值的影響Fig.2 Relative optical density of μ-calpain activity under various oxidative conditions during beef postmortem ageing

圖1 不同氧化水平對牛肉宰后成熟過程中μ-鈣激活酶和m-鈣激活酶活性影響的活性電泳分析Fig.1 Casein zymography analysis showing the effect of variable oxidative conditions on the activity of μ-calpain and m-calpain during beef postmortem ageing

另外活性電泳結果顯示，牛肉宰后成熟14 d時，當氧化劑濃度為0 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl和50 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl時，出現了m-鈣激活酶降解片段的活性條帶，而氧化劑濃度升高后，此條帶消失，因此可以推測氧化抑制了m-鈣激活酶的降解。這與Rowe等[22]的研究結果類似，他們發現在其自然成熟過程中輻照組的m-鈣激活酶降解片段的活性條帶消失。

2.2 體外氧化對牛肉自然成熟中鈣激活酶降解的影響

圖3 不同氧化水平對牛肉宰后成熟過程中80 kD μ-鈣激活酶降解影響的Western blotting分析Fig.3 Western blotting analysis showing the effect of various oxidative conditions on μ-calpain autolysis during beef postmortem ageing

本實驗中使用的鼠單克隆抗μ-鈣激活酶能夠特異性識別80 kD的μ-鈣激活酶片段，通過蛋白免疫印跡法分析μ-鈣激活酶降解情況（圖2）；采用QuatityOne分析軟件對蛋白印跡條帶光密度值進行半定量，得到不同成熟時間各氧化組μ-鈣激活酶的相對光密度值（表1）。μ-鈣激活酶的Western-blotting結果（圖3）顯示牛肉在宰后0 d和1 d時，幾乎沒有發生降解；在宰后成熟3 d后，分子質量為80kD的μ-鈣激活酶條帶變淺，此時經高濃度氧化劑處理的μ-鈣激活酶的相對光密度值為76.42%。7 d以后，μ-鈣激活酶免疫印跡條帶隨氧化濃度升高而逐漸變淺，不同氧化處理組的相對光密度值分別為52.28%、49.64%、44.21%、37.56%；宰后成熟14 d時，μ-鈣激活酶發生了更大程度的降解，各組相對光密度值分別達到30.08%、27.73%、20.11%、9.75%，即當氧化劑濃度為200 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl和500 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl時，μ-鈣激活酶降解與未氧化組相比差異顯著（P＜0.05，表1）。以上結果表明當宰后自然成熟的時間相同時，經高濃度氧化劑處理的牛肉的 -鈣激活酶的相對光密度值均顯著高于未氧化處理組，因此高濃度氧化劑在牛肉的宰后成熟過程可以顯著促進μ-鈣激活酶的降解。而 -鈣激活酶的降解在牛肉的宰后成熟過程中持續進行，且隨著貯藏時間的延長而加強，表1顯示牛肉在自然成熟0、1、3、7、14 d時，相同氧化處理組之間的μ-鈣激活酶相對光密度值均有顯著性差異，這說明貯藏時間對鈣激活酶的影響大于氧化對其的影響。

結合活性電泳結果可知，μ-鈣激活酶的活性隨著其降解程度的增強而降低。曾有研究結果表明牛肉骨骼肌中μ-鈣激活酶的活性增強，同時其降解被抑制[11]，這與本實驗結果類似。μ-鈣激活酶的80 kD亞基包括蛋白酶活性結構域和鈣結合結構域，μ-鈣激活酶一旦發生降解，活性結構域便會被破壞，從而影響其活性。μ-鈣激活酶的激活所需的Ca2+濃度與自動降解所需濃度接近，因此μ-鈣激活酶由80 kD向更小亞基如78 kD和76 kD的自動降解為一直以來被認為是μ-鈣激活酶激活的標志，而μ-鈣激活酶被激活后的持續迅速降解導致了其活性的降低[23]。

表1 不同氧化水平對牛肉宰后成熟過程中 -鈣激活酶相對光密度值的影響Table 1 Relative optical density of -calpain under various oxidative conditions during beef postmortem ageing %

3 結 論

本實驗結果表明，在牛肉的宰后成熟過程中，氧化能促進80 kD的μ-鈣激活酶降解并抑制其活性，當氧化劑濃度為500 mmol/L H2O2＋5 mmol/L NaCl時，μ-鈣激活酶的活性和降解較未氧化組均有顯著差異；并且當牛肉宰后成熟7 d以后，氧化對鈣激活酶的影響較成熟1、3 d相比影響更大。這說明在肉類宰后成熟及貯藏過程中，輻照、冷凍解凍、高氧包裝等因素導致的氧化反應會促進μ-鈣激活酶降解并抑制其活性。同時本實驗還揭示了牛肉的宰后儲藏時間對鈣激活酶降解及活性影響大于注射氧化劑對其的影響。μ-鈣激活酶作為肉類宰后嫩度改善的主要貢獻者，它的活性變化必然對肉類宰后相關食用品質如嫩度、風味等產生不利影響。因此本實驗結果為肉類宰后成熟過程中食用品質的改善提供了科學依據。

[1]MOHRHAUSER D A, UNDERWOOD K R, WEAVER A D.in vitrodegradation of bovine myofibrils is caused by mu -calpain, not caspase3[J].Journal of Animal Science, 2011, 89(3): 798-808.

[2]SMUDER A J, KAVAZIS A N, HUDSON M B, et al.Oxidation enhances myofibrillar protein degradation via calpain and caspase-3[J].Free Radical Biology and Medicine, 2010, 49(7): 1152-1160.

[3]黃明, 黃峰, 黃繼超, 等.內源性蛋白酶對宰后肌肉嫩化機制研究進展[J].中國農業科學, 2011, 44(15): 3214-3222.

[4]GEESINK G H, KOOHMARAIE M.Effect of calpastatin on degradation of myofibrillar proteins by mu-calpain under postmortem conditions[J].Journal of Animal Science, 1999, 77(10): 2685-2692.

[5]HUANG M, HUANG F, MA H J, et al.Preliminary study on the effect of caspase-6 and calpain inhibitors on postmortem proteolysis of myofibrillar proteins in chicken breast muscle[J].Meat Science, 2012,90(3): 536-542.

[6]KOOHMARAIE M, WHIPPLE G, KRETCHMAR D H, et al.Postmortem proteolysis inlongissimusmuscle from beef, lamb and pork carcasses[J].Journal of Animal Science, 1991, 69(2): 617-624.

[7]KOOHMARAIE M, GEESINK G H.Contribution of postmortem muscle biochemistry to the delivery of consistent meat quality with particular focus on the calpain system[J].Meat Science, 2006, 74(1): 34-43.

[8]黃明, 湯曉燕, 黃峰.黃牛肉中鈣激活酶系統的動力學性質[J].中國農業科學, 2010, 43(8): 1664-1669.

[9]MONTGOMERY J L, PARRISH F C, OLSON D G, et al.Storage and packaging effects on sensory and color characteristics of ground beef[J].Meat Science, 2003, 64(4): 357-363.

[10]GANHAO R, MORCUENDE D, ESTEVEZ M.Protein oxidation in emulsified cooked burger patties with added fruit extracts: influence on colour and texture deterioration during chill storage[J].Meat Science,2010, 85(3): 402-409.

[11]ROWE L J, MADDOCK K R, LONERGAN S M, et al.Oxidative environments decrease tenderization of beef steaks through inactivation of mu-calpain[J].Journal of Animal Science, 2004,82(11): 3254-3266.

[12]BERTRAM H C, KRISTENSEN M, OSTDAL H, et al.Does oxidation affect the water functionality of myofibrillar proteins?[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(6): 2342-2348.

[13]PARK D, XIONG Y L.Oxidative modification of amino acids in porcine myofibrillar protein isolates exposed to three oxidizing systems[J].Food Chemistry, 2007, 103(2): 607-616.

[14]薛梅, 黃繼超, 錢釗.體外氧化μ-鈣激活酶對牛肉肌原纖維蛋白降解的影響[J].南京農業大學學報, 2012, 35(4): 121-125.

[15]XUE M, HUANG F, HUANG M, et al.Influence of oxidation on myofibrillar proteins degradation from bovine via mu-calpain[J].Food Chemistry, 2012, 134(1): 106-112.

[16]LAMETSCH R, LONERGAN S M, HUFF-LONERGAN E.Disulfide bond within -calpain active site inhibits activity and autolysis[J].Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 2008,1784(9): 1215-1221.

[17]SHARP J S, BECKER J M, HETTICH R L.Analysis of protein solvent accessible surfaces by photochemical oxidation and mass spectrometry[J].Analytical Chemistry, 2004, 76(3): 672-683.

[18]CAMOU J P, MARCHELLO J A, GOLL D E.Effects of postmortem storage on mu- and m-calpain in bovine skeletal muscle[J].Journal of Animal Science, 2006, 84: 38-38.

[19]MELODY J L, LONERGAN S M, ROWE L J, et al.Early postmortem biochemical factors influence tenderness and water-holding capacity of three porcine muscles[J].Journal of Animal Science, 2004, 82(4):1195-1205.

[20]HUANG F, HUANG M, ZHOU G H, et al.in vitroproteolysis of myofibrillar proteins from beef skeletal muscle by caspase-3 and caspase-6[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011,59(17): 9658-9663.

[21]CARLIN K R M, HUFF-LONERGAN E, ROWE L J, et al.Effect of oxidation, pH, and ionic strength on calpastatin inhibition of mu- and m-calpain[J].Journal of Animal Science, 2006, 84(4): 925-937.

[22]ROWE L J, MADDOCK K R, LONERGAN S M, et al.Influence of early postmortem protein oxidation on beef quality[J].Journal of Animal Science, 2004, 82(3): 785-793.

[23]GUTTMANN R P, ELCE J S, BELL P D, et al.Oxidation inhibits substrate proteolysis by calpain I but not autolysis[J].Journal of Biological Chemistry, 1997, 272(3): 2005-2012.