狼山雞腌制風(fēng)干成熟過(guò)程中蛋白質(zhì)分解及游離氨基酸變化規(guī)律

紀(jì)韋韋，臧明伍，張迎陽(yáng)

（1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400；2.中國(guó)肉類食品綜合研究中心，北京 100068；3.南通雙和食品有限公司，江蘇 南通 226352）

作為肉制品的主要組成成分之一，蛋白質(zhì)在風(fēng)干禽肉制品的加工過(guò)程中會(huì)發(fā)生水解，這一重要生化反應(yīng)對(duì)終產(chǎn)品的風(fēng)味及滋味都有重要的作用[1]。蛋白質(zhì)水解是影響肉制品產(chǎn)品品質(zhì)的重要生化反應(yīng)，在風(fēng)干雞加工過(guò)程中會(huì)發(fā)生不同程度的降解，不斷累積小分子風(fēng)味物質(zhì)及風(fēng)味前體物質(zhì)，如小分子肽、游離氨基酸、小分子醛有機(jī)酸和胺類物質(zhì)等[2-4]，并且參與后繼氨基酸Strecker反應(yīng)和Maillard反應(yīng)，由此產(chǎn)生特征風(fēng)味物質(zhì)[5]。有研究證實(shí)此類小分子有機(jī)風(fēng)味物質(zhì)主要來(lái)自于游離氨基酸的深度降解[6-7]。另外，蛋白質(zhì)的水解具體為肌肉內(nèi)部的內(nèi)源蛋白酶酶解肌漿蛋白、肌原纖維蛋白，主要表現(xiàn)為大分子蛋白質(zhì)及肽類物質(zhì)的減少，小分子肽類及游離氨基酸類物質(zhì)不斷累積[8-9]；肌肉蛋白質(zhì)分解主要是在內(nèi)肽酶的作用下進(jìn)行，小分子肽產(chǎn)生的主要原因是肌肉中內(nèi)肽酶的作用，而氨基端態(tài)肽酶是腌臘肉制品游離氨基酸產(chǎn)生的主要原因[10-11]。狼山雞是我國(guó)著名的肉蛋兼用型地方雞種，平均日齡為300～365 d，具有肉質(zhì)鮮美、濃郁的特點(diǎn)，其蛋白質(zhì)含量約為23%，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)狼山雞制作風(fēng)雞加工過(guò)程中不同階段的雞胸肉中蛋白質(zhì)分解及氨基酸釋放變化規(guī)律的分析，為傳統(tǒng)風(fēng)雞加工采用現(xiàn)代工藝方法調(diào)控產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

狼山雞（雞齡365 d） 南通雙和食品有限公司；消化片（5.5 g硫酸鉀和0.5 g無(wú)水硫酸銅 丹麥Foss分析儀器公司；乙二胺四乙酸（EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)、巰基乙醇、過(guò)硫酸胺 美國(guó)Sigma公司；尿素（分析純） 天津市化學(xué)試劑三廠；丙三醇（分析純） 天津市科盟化工工貿(mào)有限公司；三氯乙酸、硫酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、水楊酸、鹽酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-W420數(shù)顯三用恒溫水箱 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；Beckman Allegra 64R冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；2300型Kjeltec TM自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥Foss分析儀器公司；101-O-S電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；JA2203N電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司；602S穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一儀器廠；FR-980生物電泳圖象分析系統(tǒng) 上海復(fù)日科技有限公司；TY-80S脫色搖床 金壇市梅香儀器有限公司；SPX-250C 型恒溫恒濕箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 風(fēng)干成熟工藝流程

將宰殺適齡狼山雞、放血、拔毛、去內(nèi)臟、洗凈雞體、瀝干水分；取質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.6%的食鹽分3次均勻的涂在樣品的表面及腹腔內(nèi)，4 ℃腌制1.5 d；將腌制結(jié)束的雞體置入恒溫恒濕箱中進(jìn)行風(fēng)干：起始溫度12.5 ℃，升溫程序?yàn)闇囟? ℃/12 h，風(fēng)干時(shí)間為92 h，相對(duì)濕度在58%～62%。

1.3.2 取樣

取風(fēng)干成熟后的樣品，剔除可見脂肪和肌膜，-20 ℃貯藏。分別在原料肉（取樣點(diǎn)1）、腌制結(jié)束（取樣點(diǎn)2）、風(fēng)干成熟24 h（取樣點(diǎn)3）、48 h（取樣點(diǎn)4）、72 h（取樣點(diǎn)5）、風(fēng)干結(jié)束（取樣點(diǎn)6）點(diǎn)取樣。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 蛋白質(zhì)水解指數(shù)（proteolysis index，PI）的測(cè)定

總氮含量（total nitrogen，TN）測(cè)定：精確稱取解凍絞碎后的樣品1.000 g于消化管中，加12 mL濃硫酸及1片消化片于消化管中，于消化爐中420 ℃消化1.5 h，冷卻后用自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定其氮的含量。

非蛋白氮含量（non-protein nitrogen，NPN）測(cè)定：樣品解凍絞碎后，取1.000 g加入25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸（TCA），高速分散器勻漿3次（5 000 r/min，20 s/次），4 ℃放置過(guò)夜，冷凍離心（5 000×g，4 ℃，5 min），過(guò)濾，取濾液于消化管中，加5 mL濃硫酸于220 ℃烘水1 h，再加濃硫酸7 mL，420 ℃消化1.5 h，冷卻后用自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定。按照下式[12]計(jì)算PI。

1.3.3.2 游離氨基酸測(cè)定

參考Virzgil等[13]的方法，略作修改：準(zhǔn)確稱取樣品6.00 g，加入60 mL 0.2 mol/L、pH 6.5磷酸鹽緩沖液，勻漿（6 000 r/min，3 min），離心（10 000×g，4 ℃，20 min），定容至100 mL，取上清液5 mL，用3%水楊酸溶液調(diào)節(jié)pH 2.0，離心（15 000×g，4 ℃，20 min），用雙蒸水定容至10 mL，取溶液0.5 mL，使用0.02 mol/L鹽酸稀釋5倍，用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)。檢測(cè)條件：洗脫液為檸檬酸緩沖液（pH 3.3～4.9），顯色液為茚三酮-乙二醇甲醚-乙酸鈉緩沖液（2∶75∶25，V/V），除羥脯氨酸在波長(zhǎng)440 nm處檢測(cè)外，其余氨基酸均在波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)。

1.3.3.3 肌漿蛋白(sarcoplasmic protein)的提取測(cè)定

稱取2 g剪碎肉樣，加入20 mL 0.02 mol/L pH 6.5的磷酸緩沖液，高速分散器勻漿（6 000 r/min，3 min），冷凍離心（10 000×g，4 ℃，20 min），吸取上清液即為肌漿蛋白[14]。

1.3.3.4 肌原纖維蛋白（myofibrillar protein）的提取測(cè)定

上述離心沉淀物重新懸浮于0.03 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液中，在高速分散器中勻漿（6 000 r/min，4 min），然后離心（10 000×g，4 ℃，20 min），去除上清液，重復(fù)以上操作3次，目的是為了除去肌肉中的內(nèi)源蛋白酶，最終沉淀再次懸浮于8 mL 0.1 mol/L pH 6.5的PBS中，另加入碘化鉀和迭氮鈉使最終量分別為0.7 mol/L和0.02%，懸浮液在高速分散器中勻漿（7 000 r/min，3 min），然后離心（10 000×g，4 ℃，20 min），吸取上清即為肌原纖維蛋白[14]。

1.3.3.5 SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)

利用考馬斯亮藍(lán)法[15]測(cè)定蛋白濃度，必要時(shí)稀釋一定倍數(shù)。

SDS-PAGE電泳測(cè)定分子質(zhì)量分布：參照郭堯君[16]的方法，將酶解后的蛋白產(chǎn)物配制成蛋白樣品并與標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，10%分離膠，5%濃縮膠，用考馬斯亮藍(lán)G-250染色，Quantity-One分析蛋白質(zhì)分子質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用Origin 8.0進(jìn)行作圖分析。不同平均值（n=3）之間用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件的GLM程序中的鄧肯氏多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 狼山雞風(fēng)干過(guò)程中蛋白質(zhì)水解指數(shù)的變化

圖1 風(fēng)雞風(fēng)干過(guò)程中蛋白質(zhì)水解指數(shù)的變化Fig.1 Changes in the PI of dry-cured chicken during processing

PI可以反映蛋白質(zhì)的水解度以及風(fēng)干過(guò)程中蛋白質(zhì)分解的宏觀進(jìn)程。由圖1可知，隨著風(fēng)干過(guò)程的進(jìn)行，雞肉蛋白質(zhì)被逐漸分解，在腌制結(jié)束后，PI值呈現(xiàn)顯著的上升趨勢(shì)（P＜0.01），在風(fēng)干結(jié)束后，PI值達(dá)到（10.61±0.09）%，相比于原料升高了20.82%。在風(fēng)干成熟72 h后，PI值升高速率開始減慢。造成這一現(xiàn)象的原因可能是，隨著干腌肉制品的風(fēng)干成熟過(guò)程的推進(jìn)，水分活度的降低、離子濃度的相對(duì)升高、pH值環(huán)境的改變，使得內(nèi)源蛋白酶酶解作用及微生物的發(fā)酵作用逐漸降低，蛋白質(zhì)分解速率下降。

2.2 狼山雞風(fēng)干過(guò)程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的變化

圖2 風(fēng)雞風(fēng)干過(guò)程中蛋白質(zhì)組分變化Fig.2 Changes in protein fractions in dry-cured chicken during processing

肌漿蛋白和肌原纖維蛋白是影響干腌肉制品的風(fēng)味形成的主要降解蛋白質(zhì)[17]。由圖2可知，在原料肉中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白占總蛋白的50%左右，并且在整個(gè)風(fēng)干成熟過(guò)程中呈顯著的下降趨勢(shì)（P＜0.05）。肌漿蛋白易溶于低離子的中性鹽溶液，因此又稱可溶性蛋白質(zhì)，主要包括肌紅蛋白、肌粒中的蛋白質(zhì)、肌球蛋白X和即溶蛋白及一些磷酸化酶[18]，雞肉中肌漿蛋白主要與色澤、浸出物、呈味特性有關(guān)[19]，在腌制結(jié)束后，有顯著的下降趨勢(shì)（P＜0.05），相比于原料，風(fēng)干結(jié)束后雞肉中肌漿蛋白分解了4.36%，肌漿蛋白的分解對(duì)游離氨基酸和小分子肽的累積有重要作用；肌原纖維蛋白主要是由重酶解肌球蛋白、肌動(dòng)球蛋白、肌鈣蛋白、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白、α及β-輔肌動(dòng)蛋白構(gòu)成，該類蛋白易溶于高濃度的中性鹽溶液[20]。肌原纖維蛋白是構(gòu)成雞肉蛋白質(zhì)的重要組成成分，主要決定肌肉的質(zhì)構(gòu)和其他加工功能特性，如肉的熱凝膠形成能力、保水能力、脂肪乳化力等[21]。在狼山雞的風(fēng)干過(guò)程中，肌原纖維蛋白被逐漸分解，由原來(lái)的（15.08±0.07）%降低到（13.77±0.05）%。兩種蛋白的分解過(guò)程與蛋白質(zhì)水解指數(shù)的變化趨勢(shì)相似，都是在風(fēng)干結(jié)束后期風(fēng)干速度出現(xiàn)顯著的減緩過(guò)程（P＜0.05），變化趨勢(shì)在整個(gè)風(fēng)干過(guò)程中一致。

2.3 狼山雞風(fēng)干過(guò)程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白分子質(zhì)量變化

雞肉蛋白質(zhì)的空間組成是由不同分子質(zhì)量的肽鏈通過(guò)二硫鍵等相互作用折疊組成，在風(fēng)干過(guò)程中由于內(nèi)源蛋白酶特異性的作用，部分不同分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)被逐漸分解，產(chǎn)生肽類及游離氨基酸。在蛋白質(zhì)的分解過(guò)程中，通過(guò)SDS-PAGE可直觀的反應(yīng)蛋白的分子質(zhì)量分布。

圖3 風(fēng)雞風(fēng)干過(guò)程中肌漿蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE pattern of sarcoplasmic proteins in dry-cured chicken during processing

由圖3可知，肌漿蛋白的分子質(zhì)量主要集中在35～120 kD之間，并且隨著風(fēng)干過(guò)程的進(jìn)行有高分子蛋白的分解和小分子蛋白的累積。風(fēng)干24 h后，85 kD的條帶消失；與原料肉相比，在腌制結(jié)束后，35 kD處的條帶變亮，有蛋白片段和多肽的累積；在風(fēng)干48h后，50 kD處的條帶逐漸變暗，并且在低于25 kD處有部分條帶出現(xiàn)。在經(jīng)過(guò)風(fēng)干成熟48 h后，高分子的肌漿蛋白大量被分解，風(fēng)干過(guò)程中肌漿蛋白的含量變化也證明了這一點(diǎn)。在風(fēng)干結(jié)束后，肌漿蛋白的分子質(zhì)量主要集中在20～85 kD之間。研究表明，引起干腌肉制品的蛋白質(zhì)降解的主要酶類為組織蛋白酶和肌鈣蛋白酶[22]，尤其是組織蛋白酶B和L是對(duì)肌肉蛋白質(zhì)起主要作用的內(nèi)肽酶[9]，在狼山雞的風(fēng)干成熟過(guò)程中對(duì)肌漿蛋白的分解有關(guān)鍵的作用。

由圖4可知，風(fēng)干過(guò)程中有部分肌原纖維蛋白被分解，為風(fēng)干狼山雞蛋白質(zhì)降解的主要蛋白。狼山雞原料肉的肌原纖維蛋白分子質(zhì)量高于35 kD，在腌制結(jié)束后，20 kD及50 kD處條帶變亮，與原料肉相比，50～85 kD之間有蛋白條帶逐漸變暗；在風(fēng)干成熟24 h后大分子質(zhì)量肌原纖維蛋白被大量分解，50 kD附近條帶變亮；并且隨著風(fēng)干過(guò)程的繼續(xù)進(jìn)行，高于85 kD的條帶無(wú)明顯的而變化，但在風(fēng)干48 h后，25～35 kD之間有新的條帶出現(xiàn)，在風(fēng)干結(jié)束后又逐漸變暗。因此，風(fēng)干狼山雞的肌原纖維蛋白在風(fēng)干過(guò)程前期主要為大分子質(zhì)量的蛋白逐漸降解，風(fēng)干成熟后期主要為小分子質(zhì)量的降解過(guò)程。主要的原因可能是在腌制及風(fēng)干過(guò)程前期，肌鈣蛋白酶為主要的蛋白酶類，對(duì)肌原纖維蛋白的降解起主要作用，隨著風(fēng)干過(guò)程的進(jìn)行，水分逐漸散失及離子濃度的升高，使部分酶的活性降低；在風(fēng)干成熟后期，隨著溫度的升高，組織蛋白酶B對(duì)肌球蛋白的大量分解導(dǎo)致肌原纖維蛋白的分解。

圖4 風(fēng)雞風(fēng)干過(guò)程中肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE pattern of myofibrillar proteins in dry-cured chicken during processing

2.4 狼山雞風(fēng)干過(guò)程中游離氨基酸的變化

表1 風(fēng)干過(guò)程中主要游離氨基酸含量Table 1 Major free amino acids contents in dry-cured chicken during air drying-ripening

由表1可知，在整個(gè)風(fēng)干成熟過(guò)程中，游離氨基酸總量有顯著的上升趨勢(shì)（P＜0.05）。主要原因是，在風(fēng)干成熟中蛋白質(zhì)逐漸分解，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)水解指數(shù)不斷增加，具體為肌漿蛋白與肌原纖維蛋白等被逐漸分解，從而出現(xiàn)氨基酸等小分子物質(zhì)的累積。在風(fēng)干成熟結(jié)束后，該值為（1 588.1±4.33）mg/100 g，相比于腌制結(jié)束升高了2.25倍，并且所有的游離氨基酸在腌制風(fēng)干成熟中都有顯著的（P＜0.05）上升趨勢(shì)，其中甘氨酸、天冬氨酸、纈氨酸是增加倍數(shù)最多的游離氨基酸。在整個(gè)風(fēng)干過(guò)程中未檢測(cè)出半胱氨酸，可能的原因是狼山雞雞肉中半胱氨酸的組成較少在檢測(cè)過(guò)程中并未檢測(cè)到；在風(fēng)干狼山雞的游離氨基酸組成中，含量最多的是谷氨酸和賴氨酸，分別占總量的17.59%和19.93%，不同于趙改名等[5]研究得出的金華火腿中含量最多的是精氨酸的結(jié)果。另外，在風(fēng)干成熟后期天冬氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸等游離氨基酸出現(xiàn)下降趨勢(shì)，尤其是脯氨酸在風(fēng)干成熟結(jié)束后含量少于腌制結(jié)束后的量，Beriain等[23]將其歸因于參與了風(fēng)味物質(zhì)的合成。因此，這些游離氨基酸降低的主要原因是一部分參與了風(fēng)干成熟后期的美拉德反應(yīng)等一系列合成反應(yīng)，另一部分被微生物直接利用產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)。

3 結(jié) 論

狼山雞在風(fēng)干成熟過(guò)程中蛋白質(zhì)經(jīng)歷一個(gè)明顯的水解過(guò)程：蛋白質(zhì)水解指數(shù)顯著升高（P＜0.05），肌肉中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白在腌制結(jié)束后有顯著的分解（P＜0.05），分子質(zhì)量高于85 kD的蛋白被逐漸分解，而小分子蛋白（20～25 kD）逐漸累積，風(fēng)干過(guò)程中游離氨基酸的分析，產(chǎn)品中游離氨基酸總量呈顯著地（P＜0.05）上升趨勢(shì)，說(shuō)明蛋白質(zhì)分解形成了風(fēng)味前提物質(zhì)，其中谷氨酸和賴氨酸是含量最多的游離氨基酸；部分游離氨基酸在風(fēng)干成熟后期出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，說(shuō)明風(fēng)干成熟后期較高的溫度可以促進(jìn)游離氨基酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為風(fēng)味物質(zhì)。

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