狼山雞腌制風干成熟過程中蛋白質分解及游離氨基酸變化規律

紀韋韋，臧明伍，張迎陽

（1.江蘇農林職業技術學院，江蘇 句容 212400；2.中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068；3.南通雙和食品有限公司，江蘇 南通 226352）

作為肉制品的主要組成成分之一，蛋白質在風干禽肉制品的加工過程中會發生水解，這一重要生化反應對終產品的風味及滋味都有重要的作用[1]。蛋白質水解是影響肉制品產品品質的重要生化反應，在風干雞加工過程中會發生不同程度的降解，不斷累積小分子風味物質及風味前體物質，如小分子肽、游離氨基酸、小分子醛有機酸和胺類物質等[2-4]，并且參與后繼氨基酸Strecker反應和Maillard反應，由此產生特征風味物質[5]。有研究證實此類小分子有機風味物質主要來自于游離氨基酸的深度降解[6-7]。另外，蛋白質的水解具體為肌肉內部的內源蛋白酶酶解肌漿蛋白、肌原纖維蛋白，主要表現為大分子蛋白質及肽類物質的減少，小分子肽類及游離氨基酸類物質不斷累積[8-9]；肌肉蛋白質分解主要是在內肽酶的作用下進行，小分子肽產生的主要原因是肌肉中內肽酶的作用，而氨基端態肽酶是腌臘肉制品游離氨基酸產生的主要原因[10-11]。狼山雞是我國著名的肉蛋兼用型地方雞種，平均日齡為300～365 d，具有肉質鮮美、濃郁的特點，其蛋白質含量約為23%，是一種優質的蛋白質資源。本實驗通過對狼山雞制作風雞加工過程中不同階段的雞胸肉中蛋白質分解及氨基酸釋放變化規律的分析，為傳統風雞加工采用現代工藝方法調控產品風味品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

狼山雞（雞齡365 d） 南通雙和食品有限公司；消化片（5.5 g硫酸鉀和0.5 g無水硫酸銅 丹麥Foss分析儀器公司；乙二胺四乙酸（EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、溴酚藍、考馬斯亮藍、巰基乙醇、過硫酸胺 美國Sigma公司；尿素（分析純） 天津市化學試劑三廠；丙三醇（分析純） 天津市科盟化工工貿有限公司；三氯乙酸、硫酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、水楊酸、鹽酸等均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-W420數顯三用恒溫水箱 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；Beckman Allegra 64R冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；2300型Kjeltec TM自動凱氏定氮儀 丹麥Foss分析儀器公司；101-O-S電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫療器械廠；JA2203N電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；氨基酸自動分析儀 日本日立公司；602S穩壓穩流電泳儀 北京六一儀器廠；FR-980生物電泳圖象分析系統 上海復日科技有限公司；TY-80S脫色搖床 金壇市梅香儀器有限公司；SPX-250C 型恒溫恒濕箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 風干成熟工藝流程

將宰殺適齡狼山雞、放血、拔毛、去內臟、洗凈雞體、瀝干水分；取質量分數2.6%的食鹽分3次均勻的涂在樣品的表面及腹腔內，4 ℃腌制1.5 d；將腌制結束的雞體置入恒溫恒濕箱中進行風干：起始溫度12.5 ℃，升溫程序為溫度1 ℃/12 h，風干時間為92 h，相對濕度在58%～62%。

1.3.2 取樣

取風干成熟后的樣品，剔除可見脂肪和肌膜，-20 ℃貯藏。分別在原料肉（取樣點1）、腌制結束（取樣點2）、風干成熟24 h（取樣點3）、48 h（取樣點4）、72 h（取樣點5）、風干結束（取樣點6）點取樣。

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 蛋白質水解指數（proteolysis index，PI）的測定

總氮含量（total nitrogen，TN）測定：精確稱取解凍絞碎后的樣品1.000 g于消化管中，加12 mL濃硫酸及1片消化片于消化管中，于消化爐中420 ℃消化1.5 h，冷卻后用自動凱氏定氮儀測定其氮的含量。

非蛋白氮含量（non-protein nitrogen，NPN）測定：樣品解凍絞碎后，取1.000 g加入25 mL質量分數10%三氯乙酸（TCA），高速分散器勻漿3次（5 000 r/min，20 s/次），4 ℃放置過夜，冷凍離心（5 000×g，4 ℃，5 min），過濾，取濾液于消化管中，加5 mL濃硫酸于220 ℃烘水1 h，再加濃硫酸7 mL，420 ℃消化1.5 h，冷卻后用自動凱氏定氮儀測定。按照下式[12]計算PI。

1.3.3.2 游離氨基酸測定

參考Virzgil等[13]的方法，略作修改：準確稱取樣品6.00 g，加入60 mL 0.2 mol/L、pH 6.5磷酸鹽緩沖液，勻漿（6 000 r/min，3 min），離心（10 000×g，4 ℃，20 min），定容至100 mL，取上清液5 mL，用3%水楊酸溶液調節pH 2.0，離心（15 000×g，4 ℃，20 min），用雙蒸水定容至10 mL，取溶液0.5 mL，使用0.02 mol/L鹽酸稀釋5倍，用氨基酸自動分析儀檢測。檢測條件：洗脫液為檸檬酸緩沖液（pH 3.3～4.9），顯色液為茚三酮-乙二醇甲醚-乙酸鈉緩沖液（2∶75∶25，V/V），除羥脯氨酸在波長440 nm處檢測外，其余氨基酸均在波長570 nm處檢測。

1.3.3.3 肌漿蛋白(sarcoplasmic protein)的提取測定

稱取2 g剪碎肉樣，加入20 mL 0.02 mol/L pH 6.5的磷酸緩沖液，高速分散器勻漿（6 000 r/min，3 min），冷凍離心（10 000×g，4 ℃，20 min），吸取上清液即為肌漿蛋白[14]。

1.3.3.4 肌原纖維蛋白（myofibrillar protein）的提取測定

上述離心沉淀物重新懸浮于0.03 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液中，在高速分散器中勻漿（6 000 r/min，4 min），然后離心（10 000×g，4 ℃，20 min），去除上清液，重復以上操作3次，目的是為了除去肌肉中的內源蛋白酶，最終沉淀再次懸浮于8 mL 0.1 mol/L pH 6.5的PBS中，另加入碘化鉀和迭氮鈉使最終量分別為0.7 mol/L和0.02%，懸浮液在高速分散器中勻漿（7 000 r/min，3 min），然后離心（10 000×g，4 ℃，20 min），吸取上清即為肌原纖維蛋白[14]。

1.3.3.5 SDS-PAGE實驗

利用考馬斯亮藍法[15]測定蛋白濃度，必要時稀釋一定倍數。

SDS-PAGE電泳測定分子質量分布：參照郭堯君[16]的方法，將酶解后的蛋白產物配制成蛋白樣品并與標準分子質量蛋白進行SDS-PAGE，10%分離膠，5%濃縮膠，用考馬斯亮藍G-250染色，Quantity-One分析蛋白質分子質量。

1.4 數據統計分析

用Microsoft Excel進行數據整理，采用Origin 8.0進行作圖分析。不同平均值（n=3）之間用SAS 8.2統計軟件的GLM程序中的鄧肯氏多重比較法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 狼山雞風干過程中蛋白質水解指數的變化

圖1 風雞風干過程中蛋白質水解指數的變化Fig.1 Changes in the PI of dry-cured chicken during processing

PI可以反映蛋白質的水解度以及風干過程中蛋白質分解的宏觀進程。由圖1可知，隨著風干過程的進行，雞肉蛋白質被逐漸分解，在腌制結束后，PI值呈現顯著的上升趨勢（P＜0.01），在風干結束后，PI值達到（10.61±0.09）%，相比于原料升高了20.82%。在風干成熟72 h后，PI值升高速率開始減慢。造成這一現象的原因可能是，隨著干腌肉制品的風干成熟過程的推進，水分活度的降低、離子濃度的相對升高、pH值環境的改變，使得內源蛋白酶酶解作用及微生物的發酵作用逐漸降低，蛋白質分解速率下降。

2.2 狼山雞風干過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的變化

圖2 風雞風干過程中蛋白質組分變化Fig.2 Changes in protein fractions in dry-cured chicken during processing

肌漿蛋白和肌原纖維蛋白是影響干腌肉制品的風味形成的主要降解蛋白質[17]。由圖2可知，在原料肉中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白占總蛋白的50%左右，并且在整個風干成熟過程中呈顯著的下降趨勢（P＜0.05）。肌漿蛋白易溶于低離子的中性鹽溶液，因此又稱可溶性蛋白質，主要包括肌紅蛋白、肌粒中的蛋白質、肌球蛋白X和即溶蛋白及一些磷酸化酶[18]，雞肉中肌漿蛋白主要與色澤、浸出物、呈味特性有關[19]，在腌制結束后，有顯著的下降趨勢（P＜0.05），相比于原料，風干結束后雞肉中肌漿蛋白分解了4.36%，肌漿蛋白的分解對游離氨基酸和小分子肽的累積有重要作用；肌原纖維蛋白主要是由重酶解肌球蛋白、肌動球蛋白、肌鈣蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白、α及β-輔肌動蛋白構成，該類蛋白易溶于高濃度的中性鹽溶液[20]。肌原纖維蛋白是構成雞肉蛋白質的重要組成成分，主要決定肌肉的質構和其他加工功能特性，如肉的熱凝膠形成能力、保水能力、脂肪乳化力等[21]。在狼山雞的風干過程中，肌原纖維蛋白被逐漸分解，由原來的（15.08±0.07）%降低到（13.77±0.05）%。兩種蛋白的分解過程與蛋白質水解指數的變化趨勢相似，都是在風干結束后期風干速度出現顯著的減緩過程（P＜0.05），變化趨勢在整個風干過程中一致。

2.3 狼山雞風干過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白分子質量變化

雞肉蛋白質的空間組成是由不同分子質量的肽鏈通過二硫鍵等相互作用折疊組成，在風干過程中由于內源蛋白酶特異性的作用，部分不同分子質量的蛋白質被逐漸分解，產生肽類及游離氨基酸。在蛋白質的分解過程中，通過SDS-PAGE可直觀的反應蛋白的分子質量分布。

圖3 風雞風干過程中肌漿蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE pattern of sarcoplasmic proteins in dry-cured chicken during processing

由圖3可知，肌漿蛋白的分子質量主要集中在35～120 kD之間，并且隨著風干過程的進行有高分子蛋白的分解和小分子蛋白的累積。風干24 h后，85 kD的條帶消失；與原料肉相比，在腌制結束后，35 kD處的條帶變亮，有蛋白片段和多肽的累積；在風干48h后，50 kD處的條帶逐漸變暗，并且在低于25 kD處有部分條帶出現。在經過風干成熟48 h后，高分子的肌漿蛋白大量被分解，風干過程中肌漿蛋白的含量變化也證明了這一點。在風干結束后，肌漿蛋白的分子質量主要集中在20～85 kD之間。研究表明，引起干腌肉制品的蛋白質降解的主要酶類為組織蛋白酶和肌鈣蛋白酶[22]，尤其是組織蛋白酶B和L是對肌肉蛋白質起主要作用的內肽酶[9]，在狼山雞的風干成熟過程中對肌漿蛋白的分解有關鍵的作用。

由圖4可知，風干過程中有部分肌原纖維蛋白被分解，為風干狼山雞蛋白質降解的主要蛋白。狼山雞原料肉的肌原纖維蛋白分子質量高于35 kD，在腌制結束后，20 kD及50 kD處條帶變亮，與原料肉相比，50～85 kD之間有蛋白條帶逐漸變暗；在風干成熟24 h后大分子質量肌原纖維蛋白被大量分解，50 kD附近條帶變亮；并且隨著風干過程的繼續進行，高于85 kD的條帶無明顯的而變化，但在風干48 h后，25～35 kD之間有新的條帶出現，在風干結束后又逐漸變暗。因此，風干狼山雞的肌原纖維蛋白在風干過程前期主要為大分子質量的蛋白逐漸降解，風干成熟后期主要為小分子質量的降解過程。主要的原因可能是在腌制及風干過程前期，肌鈣蛋白酶為主要的蛋白酶類，對肌原纖維蛋白的降解起主要作用，隨著風干過程的進行，水分逐漸散失及離子濃度的升高，使部分酶的活性降低；在風干成熟后期，隨著溫度的升高，組織蛋白酶B對肌球蛋白的大量分解導致肌原纖維蛋白的分解。

圖4 風雞風干過程中肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE pattern of myofibrillar proteins in dry-cured chicken during processing

2.4 狼山雞風干過程中游離氨基酸的變化

表1 風干過程中主要游離氨基酸含量Table 1 Major free amino acids contents in dry-cured chicken during air drying-ripening

由表1可知，在整個風干成熟過程中，游離氨基酸總量有顯著的上升趨勢（P＜0.05）。主要原因是，在風干成熟中蛋白質逐漸分解，表現為蛋白質水解指數不斷增加，具體為肌漿蛋白與肌原纖維蛋白等被逐漸分解，從而出現氨基酸等小分子物質的累積。在風干成熟結束后，該值為（1 588.1±4.33）mg/100 g，相比于腌制結束升高了2.25倍，并且所有的游離氨基酸在腌制風干成熟中都有顯著的（P＜0.05）上升趨勢，其中甘氨酸、天冬氨酸、纈氨酸是增加倍數最多的游離氨基酸。在整個風干過程中未檢測出半胱氨酸，可能的原因是狼山雞雞肉中半胱氨酸的組成較少在檢測過程中并未檢測到；在風干狼山雞的游離氨基酸組成中，含量最多的是谷氨酸和賴氨酸，分別占總量的17.59%和19.93%，不同于趙改名等[5]研究得出的金華火腿中含量最多的是精氨酸的結果。另外，在風干成熟后期天冬氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸等游離氨基酸出現下降趨勢，尤其是脯氨酸在風干成熟結束后含量少于腌制結束后的量，Beriain等[23]將其歸因于參與了風味物質的合成。因此，這些游離氨基酸降低的主要原因是一部分參與了風干成熟后期的美拉德反應等一系列合成反應，另一部分被微生物直接利用產生風味物質。

3 結 論

狼山雞在風干成熟過程中蛋白質經歷一個明顯的水解過程：蛋白質水解指數顯著升高（P＜0.05），肌肉中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白在腌制結束后有顯著的分解（P＜0.05），分子質量高于85 kD的蛋白被逐漸分解，而小分子蛋白（20～25 kD）逐漸累積，風干過程中游離氨基酸的分析，產品中游離氨基酸總量呈顯著地（P＜0.05）上升趨勢，說明蛋白質分解形成了風味前提物質，其中谷氨酸和賴氨酸是含量最多的游離氨基酸；部分游離氨基酸在風干成熟后期出現降低的趨勢，說明風干成熟后期較高的溫度可以促進游離氨基酸進一步轉化為風味物質。

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