乳酸乳球菌KLDS4.0325的B族維生素生物合成途徑分析

楊曉春，王玉堂，霍貴成

（東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

維生素是所有生物體新陳代謝所必需的微量營養因子。它們一般作為細胞內輔酶的前體物質，可以調節細胞內重要的生化反應。人類自身只能合成少量的維生素，所以必須從外界獲取大量的維生素（例如飲食）[1-2]。盡管大多數維生素存在于各種食物當中，但是包括發達國家在內的許多國家和地區仍然存在著維生素缺乏的現象，這不僅僅是由于食物攝取不足，飲食不均衡也是一個非常重要的原因。常見的B族維生素包括硫胺素、核黃素、煙酸、吡哆醇、泛酸、生物素、葉酸和鈷胺素等。每一種B族維生素的化學性質明顯不同，它們可以在人體內協同作用來調節重要的新陳代謝過程，像能量的 產生和血紅細胞的形成等。

蔬菜和乳制品是人類B族維生素的主要來源[3]。牛乳中幾乎含有所有種類的維生素，尤其是B族維生素。研究發現，平均每升牛乳中葉酸含量為20～50 μg[4]，發酵乳制品，尤其是酸奶含有更多的葉酸。與蔬菜來源的B族維生素相比，乳制品和其他發酵產品中的B族維生素具有一定的優勢。另外，許多發酵乳制品比原料乳中含有更高濃度的B族維生素（葉酸、核黃素等）。這就很好的解釋了一些作為乳制品起始發酵劑的菌株，例如嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌等，在從頭合成一定量的B族維生素后，能夠釋放出更多的B族維生素到培養基中的原因[5-7]。

乳酸乳球菌KLDS4.0325是由東北農業大學“教育部乳品重點實驗室”從中國新疆牧民家庭自制的酸馬奶中分離得到的1株乳酸乳球菌。經常規實驗發現，該菌株具有較強的葉酸合成能力。為了在基因水平上挖掘該菌株的B族維生素合成潛力，對該菌株進行了全基因組鳥槍法測序，并利用生物信息學手段對其B族維生素合成途徑進行了比較分析。乳酸菌代謝可以產生B族維生素的這一性質不僅可以為發酵乳制品中添加一系列天然B族維生素提供了良好的方式[8]，同時也為菌株功能的挖掘提供了新的研究思路[9]。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

乳酸乳球菌KLDS4.0325來自于東北農業大學教育部重點實驗室工業微生物菌種保藏中心（KLDS-DICC）。它是從中國新疆牧民家庭自制的酸馬奶中分離得到的1株乳酸乳球菌。

脫脂乳培養基：脫脂乳100g，蒸餾水1L，pH值自然。

1.2 試劑

脫脂乳 Nordmilchag公司；乙醇、異丙醇 德州康泰消毒制品有限公司；細菌基因組提取試劑盒 天根生物技術（北京）有限公司；蛋白胨、酵母粉、胰蛋白胨 英國Oxoid公司；葡萄糖、吐溫 美國Sigma公司；磷酸氫二鉀、檸檬酸二氫鉀、乙酸鈉 天津市科密歐試劑公司；硫酸鎂、硫酸錳 天津市天力化學試劑公司；瓊脂粉、溶菌酶 Solabiro公司；純凈水哇哈哈集團有限公司。

TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA，pH 8.0，于121 ℃、20 min滅菌備用。

1.3 儀器與設備

HVE-50電熱蒸汽自動滅菌鍋 Hirayama公司；CJ-2D超凈工作臺 天津泰斯特儀器有限公司；全系列Eppendorf移液器 德國Eppendorf公司；SPX-150B生化培養箱 上海佳勝實驗設備有限公司；GL-20G-II離心機 上海安亭科學儀器廠；DYY-10C電泳儀 北京六一儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 菌株的培養及總DNA的提取

將冷凍干燥保藏的乳酸乳球菌KLDS4.0325以體積分數1%的接種量轉接至脫脂乳中進行培養24 h[10]。再將菌株于MRS培養基轉接兩次，使菌株活力得到充分恢復。

菌株總基因組DNA的提取參照細菌基因組提取試劑盒說明進行。DNA提取完成后，取2～5 L DNA進行0.8%瓊脂糖電泳，以檢測提取DNA的完整性和質量。最后，送至深圳華大基因科技服務有限公司進行全基因組序列的測定。

1.4.2 基因組的測序、組裝及注釋

乳酸乳球菌KLDS4.0325經全基因組鳥槍法進行測序后，利用SOAOdono軟件進行序列拼接。所有的操作都按照標準程序進行操作[11-15]。利用GeneMark和Glimmer軟件進行基因預測[16-17]。將獲得的全基因組序列利用BLAST[18-19]工具掃描相應的蛋白數據庫（例如非冗余數據庫和全球通用蛋白數據等）進行序列的注釋。乳酸乳球菌KLDS4.0325的全基因組序列已經上傳到了GenBank數據庫中，登錄號為：CP006766。

1.4.3 生物信息學分析

利用ORFfinder預測開放閱讀框[20]。維生素的一般合成途徑是從京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數據庫中獲得的。從Uniport蛋白數據庫獲得了B族維生素合成途徑的蛋白序列后，在Linux操作系統內針對乳酸乳球菌KLDS4.0325全基因組序列建庫，使用BLASTp本地比對程序將這些獲得的蛋白序列針對數據庫進行比對搜索[21]。9株參考菌株在B族維生素合成途徑中涉及的酶的序列信息是從GenBank數據庫中獲得的。這些菌株包括Lactococcus lactissubsp.lactisIL1403（縮寫LLA，登錄號AE005176）、Lactococcus lactissubsp.lactisKF147（LLK，CP001834）、Lactococcus lactissubsp.lactisCV56 （LLT，CP002365）、Lactococcus lactissubsp.lactisIO-1 （LLS，AP012281）、Lactococcus lactissubsp.cremorisSK11 （LLC，CP000425）、Lactococcus lactissubsp.cremorisMG1363（LLM，AM406671）、Lactococcus lactissubsp.cremorisA76（LLR，CP003132）、Lactococcus lactissubsp.cremorisNZ9000（LLN，CP002094）、Lactococcus lactissubsp.cremorisUC509.9（LLI，CP003157）。

2 結果與分析

2.1 乳酸乳球菌KLDS 4.0325的葉酸（VB11）生物合成途徑分析

有兩條關于葉酸合成的途徑。其中，第一條合成途徑由嘌呤代謝（purine metabolism）途徑中所產生的GTP，即鳥嘌呤核苷三磷酸作為整個合成途徑的最初底物，經一系列酶的催化形成葉酸；第二條途徑是由苯基丙氨酸合成（phenylalanine biosynthesis）途徑中形成的分支酸（chorismate）也可以進入葉酸合成途徑葉酸。

乳酸乳球菌的葉酸生物合成途徑中涉及的酶在各乳酸乳球菌中的分布如表1所示。在第一條葉酸合成途徑中，KLDS4.0325、LLA、LLC和LLM 4株乳酸乳球菌除了不含[EC3.6.1.-]編碼基因外，它們的基因組中包含有整個合成途徑中其他酶類的編碼基因。因此，這4株菌在發酵過程中可正常產生葉酸。而其他6株菌株因不含關鍵性GTP環化水解酶Ⅰ[EC3.5.4.16]，同時也不含另一途徑中的關鍵性酶[EC3.6.1.-]和堿性磷酸酶[EC3.1.3.1]，因而不能通過該途徑產生葉酸。在該途徑中，KLDS4.0325和LLM的基因組中編碼的整個葉酸合成途徑的所涉及的酶的編碼基因拷貝數完全相同，特別是堿性磷酸酶的編碼基因拷貝數都為2，而菌株LLA和LLC所涉及的酶的編碼基因均為單拷貝基因。另外，KLDS4.0325和LLM的基因組中都同時編碼了二氫葉酸合成酶（dihydrofolate synthase）和葉酸多聚谷氨酸合成酶（folylpolyglutamate synthase），而菌株LLA和LLC基因組中只編碼了葉酸多聚谷氨酸合成酶。因此，在第一條葉酸合成途徑中，KLDS4.0325和LLM在基因水平上表現出了較強的合成能力。

表1 葉酸生物合成途徑中涉及的酶在10株乳酸乳球菌基因組中的分布Table 1 Distribution of enzymes involved in folate biosynthetic pathway in the genomes of 10Lactococcus laccttiiss

此外，乳酸乳球菌KLDS4.0325和9株參考菌株還可以通過苯基丙氨酸合成途徑中形成的分支酸（chorismate）進入葉酸合成途徑生成葉酸。由表1可知，包括KLDS4.0325在內的10株乳酸乳球菌都含有該途徑的完整編碼基因。因此，這10株菌株都可以由該途徑產生葉酸。但是，各菌株基因組中相關酶的編碼基因的分布情況存在一定差異。例如，關于能夠催化分支酸形成4-氨基-4-脫氧分支酸的帕拉-對氨基苯甲酸甲酯合成酶的編碼基因，菌株KLDS4.0325、LLK、LLT、LLS、LLR以及LLN的基因組中該酶的編碼基因拷貝數均為2，而其他菌株都為1。此外，關于二氫葉酸合成酶（ihydrofolate synthase）和葉酸多聚谷氨酸合成酶（folylpolyglutamate synthase）的基因在各菌株基因組中的存在情況的差異也比較大，其中KLDS4.0325、LLK、LLM、LLR、LLN以及LLI的基因組中同時編碼這兩種基因，其他菌株只編碼了葉酸多聚谷氨酸合成酶基因。

2.2 乳酸乳球菌KLDS4.0325的核黃素生物合成途徑分析

在核黃素（riboflavin）代謝通路中有兩條核黃素的合成支路：第一條支路是來自于嘌呤代謝（purine metabolism）途徑產生的鳥嘌呤核苷三磷酸腺苷（guanosine 5’-triphosphate，GTP）經過一系列酶的催化產生核黃素；另一條支路是由磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway）產生的D-核酮糖5-磷酸經一系列酶催化產生核黃素。

表2 核黃素合成途徑中相關酶在10株乳酸乳球菌中的分布Table 2 Distribusion of enzymes involved in riboflavin biosynthetic pathway in the genomes of 10Lactococcus laccttiiss

由表2可知，10株菌株都不含有第一條支路中的關鍵酶的編碼基因[EC3.1.3.-]。因此，10株菌株全都不能通過該支路完成核黃素的合成。在另一條核黃素合成支路中，10株菌的基因組中都含有編碼該途徑上的所有相關酶類的基因，且編碼酶的基因個數完全相同，均為單拷貝基因。因此，10株菌都可以通過該途徑進行VB2的生物合成，并且在基因水平上，乳酸乳球菌KLDS4.0325的核黃素合成能力與這9株菌相比無明顯差異。

2.3 乳酸乳球菌KLDS4.0325的其他B族維生素合成途徑分析

表3 乳酸乳球菌KLDS4.0325在VB1、VB3、VB5、VB6、VB7和VB12的生物合成途徑中缺失的關鍵酶Table 3 The key enzymes absent from biosynthetic pathways for VB1V,B3V,B5V,B6V,B7 andd VB1122 iinn L.lactiiss KLDS4..00332255

應用同樣的方法對乳酸乳球菌KLDS4.0325進行其他常見B族維生素的代謝途徑分析。如表3所示，該菌株基因組中缺乏編碼VB1、VB3、VB5、VB6、VB7和VB12等生物合成途徑關鍵酶的基因，因此不具備合成這些B族維生素的潛力。

3 結 論

對乳酸乳球菌KLDS4.0325的B族維生素生物合成途徑進行生物信息學分析的結果表明，該菌株基因組中編碼了較為完整的葉酸和核黃素合成途徑的基因。與其他9株參考菌株相比，乳酸乳球菌KLDS4.0325在基因水平上表現出了較強的葉酸合成潛力，而核黃素合成能力與參考菌株差別不大。由于該菌株基因組中缺乏編碼其他B族維生素合成的關鍵性酶基因。因此，在基因水平上表現出不能合成其他B族維生素的能力。葉酸是人類膳食中所必需的化合物，但是葉酸在個別群體中甚至較為發達國家的人群中是缺乏的，人體中缺乏葉酸可能會導致神經管缺陷病，冠心病和某些癌癥的發生。因而，獲得一系列具有高產葉酸能力的發酵劑是十分必要的。目前，基因工程技術發展速度較快，在后續的研究中，可以嘗試應用基因工程的方法對該菌株的某些葉酸合成基因進行過度表達以獲取更多的葉酸。

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