基于混合培養和高通量測序分析云南傳統發酵豆豉中活性細菌群落

李曉然，龔福明,2，李 潔，羅義勇，柳陳堅,

（1.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明 650500；2.德宏職業學院基礎系，云南 芒市 678400）

發酵食品是指利用益生微生物加工制造而成的一類具有獨特風味與營養價值的食品，其中，豆豉是以大豆或黃豆為主要原料，經由原料處理、制曲及后發酵三階段釀制而成，它不僅風味獨特，而且還富含多種生理活性物質。由于云南省獨特的地理位置、氣候條件和民族文化傳統，生物資源繁多，發酵食品中具有獨特和寶貴的微生物資源，由于缺乏對這些微生物全面的了解，這些寶貴的資源仍未得到很好的開發。

在過去的幾十年中，大多數的微生物生態學家都在致力于分離和鑒定特殊環境中的微生物類群，通過這種方法已經獲得了許多非常有用的信息。然而，由于許多微生物無法在實驗室中通過常規培養得到，這使得可培養微生物的范圍非常有限。基于分子生物學技術的針對rRNA基因的探索極大地促進了環境中微生物群落多樣性的研究。rRNA基因在細胞中相對穩定，同時含有保守序列及高可變序列，是微生物系統分類的一個重要指標[1-2]。2008年，Hamady等[3]展示了一種使用焦磷酸測序可以同時平行分析多個樣品的策略，在對不同的樣品進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增時在引物的5’末端加上由8個堿基組成的標記（barcode），在同一次測序反應中同時分析了286個環境樣品，由于使用高通量測序，每一個樣品都可以得到較多的序列。這一方法在分析多個樣品微生物群落多樣性領域得到了極為廣泛的應用。

然而，在對微生物群落進行DNA提取的過程中，游離于細胞外的DNA以及已經死亡的細胞的DNA依然會被提取出來并進行后續的實驗，因此，基于DNA的分子生物學方法往往會因為這些非活性的DNA的存在而高估樣品的微生物多樣性。另外，在發酵食品中，并非所有的細菌都對食品發酵起作用，尤其是傳統發酵方法制作的食品，其微生物來源于發酵基質和發酵環境，很多的微生物可能是死亡或者不起作用。

因此，在本研究中，對豆豉樣品先采用富集細菌的液體培養基進行混合培養，對其中活著的細菌進行富集培養，然后對培養液提取總的DNA，再進行16S rRNA基因的擴增和焦磷酸測序，以此來分析豆豉中具有活性的細菌群落。將混合培養和16S rRNA基因高通量測序的方法結合起來可以分析發酵食品中具有活性的主要細菌種類及其相對豐度，為研究發酵食品中微生物群落提供更加全面而準確的信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆豉 云南省迪慶自治州（香格里拉）菜市場，為傳統發酵制成的加辣椒等調料的發酵大豆，兩個樣品分別命名為XG_1和XG_2。購買后置于冰盒中運送到實驗室，－80℃保存。

DNA提取裂解緩沖液：0.1 mol/L Tris-HCl、0.1 mol/L EDTA、0.75 mol/L蔗糖。

1.2 儀器與設備

Labnet230V EU渦旋儀 美國Labnet公司；ABI 7200PCR儀 美國ABI公司；羅氏GS-FLX測序儀 瑞士Roche公司；Nanodrop ND-1000分光光度計 美國Thermo公司；Sigma 3-18K離心機、玻璃珠（直徑212～300 m） 美國Sigma公司；Premix Ex Taq?日本TaKaRa公司；QIAquick gel Extraction Kit 德國Qiangen公司。

1.3 方法

1.3.1 預培養

在無菌培養下稱取豆豉樣品1.0 g，置于5 mL生理鹽水中進行研磨和振蕩，取混合液體20 μL接種至5 mL NA培養基中，置于35 ℃培養24 h。

1.3.2 DNA提取

DNA提取參考Schmidt等[4]的方法并做了部分改變，步驟如下：取1 mL混合培養液離心收集菌體，加入450 μL裂解緩沖液和10 μL 50 mg/mL溶菌酶，37 ℃水浴30 min。加入25 μL 20% SDS和5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，55 ℃水浴2 h以上后，加入0.1 g玻璃珠，于渦旋儀上以最高轉速振蕩5 min，之后將離心管放置于研缽中，加入液氮凍融3次。加入80 μL 5 mol/L NaCl和60 μL 10 g/100 mL CTAB，小心混勻，65 ℃水浴20 min。分別用等體積苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）和氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）抽提一次。加入0.6倍體積的異丙醇于－20 ℃沉淀DNA，最后加入50 L TE（0.01 mol/L Tris-HCl，pH 8.0；0.001 mol/L EDTA，pH 8.0）緩沖液溶解DNA。提取好的DNA保存于－20 ℃。

1.3.3 細菌16S rRNA基因擴增和焦磷酸測序

使用細菌的16S rRNA基因V3～V5高變區通用引物對提取的DNA進行擴增。擴增使用通用引物338F（5’-ACH YCT ACG GGA GGC HGC-3’）和907R（5’- CCG TCA ATT CMT TTG AGT TT-3’），并在引物338F的5’末端添加8個堿基的標記。為了減少PCR產物中非特異性擴增的異源雙鏈DNA的含量，將PCR產物稀釋10倍作為模板后按照原來的條件再做5個循環[5]。PCR擴增采用Premix Ex Taq?具體體系及程序如下。在50 μL 的PCR反應體系中：ddH2O 18 μL，正向引物（5 μmol/L） 2 μL，反向引物（5 μmol/L）2 μL，Premix Ex Taq? 25 μL，模板（15 ng）3 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，共30個循環；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

將PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳后將凝膠浸泡于含有20 g/mL EB的TAE緩沖液中10 min后在紫外燈（216 nm）照射下呈現橙色的條帶，目標條帶割下后使用QIAquick gel Extraction Kit回收PCR產物。使用Nanodrop ND-1000分光光度計將純化好的PCR擴增產物定量。由國家人類基因組南方研究中心使用焦磷酸測序對DNA進行測序。

1.3.4 測序結果分類鑒定

對于焦磷酸測序的測序結果分析質量文件，去掉含有“N”的序列，并對序列長度進行篩選，刪掉長度小于300 bp的序列，根據Barcode將序列確定各個本樣品的序列，并去除Barcode和引物序列，得到有效的序列文件。使用Mallard v1.02[6]來檢測PCR產物序列中的嵌合體。使用mothur v1.25.1[7]的classify.seqs命令，采用Silva的核糖體小亞基RNA（SSU rRNA）序列數據庫V102[8]的分類信息，得到序列的分類信息，分別采用80%的置信區間。

1.3.5 多樣性指數和系統發育分析

對所有序列使用Mothur v1.25.1[7]進行比對，以0.02和0.05為Cutoff值劃分可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。計算Cutoff為0.02和0.05時的ACE和Chao1值，并繪制Rarefaction曲線。從細菌16S rRNA基因序列中每個OTU選取代表序列，將其在NCBI的GenBank進行BLAST比對，將結果中具有確定分類信息的序列用ClustalX 1.83[9]進行比對，將比對的結果用Mega v4.0[10]中的鄰接法（Neighbour-Joining）方法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 序列信息和多樣性指數

對焦磷酸高通量測序的結果進行分析，通過添加的Barcode將序列分到兩個樣品中，XG_1有478條序列，XG_2有437條序列，對兩個序列文件進行長度和質量刪選，去掉含有“N”的序列，將大于350 bp的序列用來做后續分析，XG_1有417條序列，XG_2有384條序列。

為了消除不同序列數目對多樣性指數的影響，在兩個樣品中都隨機選取380條序列來分析其多樣性指數，分別以0.02和0.05為Cutoff，OTU數目、Singleton（有2條序列的OTU）、Doubleton（有2條序列的OTU）數目以及多樣性指數ACE和Chao1值如表1所示。所有多樣性指數均顯示，樣品XG_1的豐度遠遠大于XG_2，在Cutoff為0.02時，即大約相當于種的分類水平時，兩個樣品均顯示了較高的多樣性，然而在Cutoff為0.05，即大約相當于屬的分類水平時，XG_1的多樣性還較高，而XG_2的多樣性已經很低。圖1顯示了OTU數目隨著序列數增長情況的Rarefaction曲線，在Cutoff為0.05時，兩個樣品的曲線均呈現出了接近平臺的趨勢，而在Cutoff為0.02時，兩個曲線的上升趨勢還很明顯，說明在種的水平上，測序量可能還不能完全反映兩個樣品的多樣性。

表1 基于Cutoff 0.02和0.05的細菌豐度Table 1 Bacterial richness with cutoffs of 0.02 and 0.05

圖1 根據Rarefaction方法估計豆豉樣品細菌的多樣性Fig.1 Estimated OTU numbers according to the rarefaction method depending on OTU identification with the cutoffs of 0.02 and 0.05

2.2 細菌群落結構

根據Silva的SSU rRNA序列數據庫對序列進行分類，兩個樣品中所有的序列都屬于厚壁菌門（Firmicutes）。對于XG_1，厚壁菌門中包含了3個目，分別是乳酸桿菌目（Lactobacillales，264條序列，63%），芽孢桿菌目（Bacillales，149條序列，36%）和候選目432-1（Candidate order 432-1，4條序列，1%）。在乳酸桿菌目中，146條序列屬于腸球菌科（Enterococcaceae），88條序列屬于乳酸桿菌科（Lactobacillaceae），21條序列屬于肉桿菌科（Carnobacteriaceae）；在芽孢桿菌目中，全部序列都屬于芽孢桿菌科（Bacillaceae）。另一個樣品XG_2的細菌群落則更為簡單，厚壁菌門中包含了2個目，分別是芽孢桿菌目（367條序列，96%）和候選目432-1（17條序列，4%）。芽孢桿菌目中所有序列全部屬于芽孢桿菌科。可見，在XG_1中，具有活性的優勢菌為乳酸菌，而在XG_2中則為芽孢桿菌。

將在Cutoff為0.02時兩個樣品共81個OTU進行分析，去除Singleton和Doubleton后的23個OTU用來構建系統發育樹，如圖2所示。兩個樣品中具有活性的細菌種類是不一樣的，大多數的OTU都屬于芽孢桿菌科，尤其是XG_2，全部的OTU都在這個科中，豐度最高的OTU為XG_2_M4，有267條序列（70%），它與枯草芽孢桿菌亞種（Bacillus subtilissubsp.subtilis6051-HGW）（CP003329）呈現出較高的相似度。在XG_2中，豐度第二高的OTU為XG_2_DT，有47條序列（12%），其16S rRNA基因序列與甲基營養型芽孢桿菌（B.methylotrophicusstrain CBMB205）（EU194897）顯示出較高的相似度，同時，在XG_1中豐度第二高的OTU XG_1_AF也可鑒定為這一細菌。OTU XG_2_0X包含27條序列（7%），經過鑒定，與炭疽桿菌（B.anthracisstrain g9B-2）（HQ238757）相似度較高，這株菌是在小麥發酵食品的生產房間中檢測到的。

圖2 細菌的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences and their phylogenetic relationships

在樣品XG_1中，樣品的均一度與XG_2也不一樣，豐度最高的OTU XG_1_EJ僅有103條序列，占25%，這個OTU屬于腸球菌科，其16S rRNA基因序列與多株腸球菌如耐久腸球菌（Enterococcus durans）、蒙氏腸球菌（E.mundtii）和海氏腸球菌（E.hirae）均顯示了較高的相似度，并和從米糠中分離到的16S rRNA基因序列也呈現了較高的相似度（AB671280）。豐度第三的OTU為XG_1_NA，有58條序列，占14%，在系統發育樹上與乳酸片球菌（Pediococcus acidilacticistrain Ni1001）（AB598949）聚類在一起。此外，從系統發育樹上可以看出，有部分序列不能與已知分類信息的細菌16S rRNA基因序列完全聚類在一起，也暗示了在這兩個樣品中，有部分細菌是未培養細菌，值得更為深入的研究。

3 討 論

本研究使用了培養和分子生物學高通量測序方法的結合，對傳統發酵食品的主要種類之一豆豉中具有活性的細菌群落進行了分析。這種方法既規避了實驗室傳統培養方法對微生物種類的限制，同時由于在DNA提取之前進行了富集培養的步驟，使得在樣品中具有活性的細菌得到富集生長，也避免了直接使用分子生物學方法分析而受到樣品中死細胞的干擾從而高估了細菌多樣性。

在樣品XG_1中，豐度最高的OTU與耐久腸球菌或蒙氏腸球菌的序列具有明顯的相似性。在以前的研究中，耐久腸球菌被認為有抗真菌活性，在發酵食品中，真菌尤其是霉菌的污染和增殖是食品變質的重要方面，因此，耐久腸球菌的這一特性無疑為食品提供了保鮮成分，延長其保存時間。而蒙氏腸球菌則有產生細菌素的能力[11]，細菌素也是乳酸菌產生的具有生物防腐的物質之一。其次為可鑒定為枯草芽孢桿菌的OTU，這一OTU也是樣品XG_2中的優勢菌。枯草芽孢桿菌雖然在自然界中廣泛存在，如土壤[12]、空氣[13]等，近年來，也在人體腸道樣品中多次檢出[14]，被認為是正常的腸道菌群，與人類共生。枯草芽孢桿菌在食品發酵中也發揮著重要作用，如日本納豆中就是由納豆枯草芽孢桿菌（B.subtilis natto）發酵而成，可以釋放胞外蛋白酶來消化大豆蛋白[15]。甲基營養型芽孢桿菌也同樣遍布在土壤[16]和海水[17]中，也有研究證明一株分離自土壤的該菌可以產纖維素酶[18]，在大豆發酵中也起到降解纖維素的作用。豐度第三高的OTU被鑒定為乳酸片球菌，這是食品發酵中重要的乳酸菌之一，也是主要的益生菌之一，可以用于發酵蔬菜、乳制品和肉類。乳酸片球菌還可以保護腸道，使病原體如痢疾桿菌、沙門氏菌等在腸道定殖[19]。在以前的研究中，尚未有任何研究證明乳酸片球菌有毒性作用，因此非常適合作為益生菌用于發酵食品。在樣品XG_2中另一個主要的OTU被鑒定為炭疽桿菌，研究證明，在多種食品相關樣品中都檢測到了炭疽桿菌的孢子[20-21]。然而，值得注意的是，芽孢桿菌可以形成內生孢子，能夠承受極端的環境條件。因此，在兩個樣品中存在的具有活性的芽孢桿菌，并不能準確判斷其來源及作用，若要了解其在豆豉發酵中的具體作用，還需要進一步的活性測試和基于RNA的相關分析。

本研究分析的兩個豆豉樣品培養液的細菌多樣性，其中一個樣品不具有明顯的優勢菌，主要的細菌為腸球菌、乳酸片球菌和甲基營養型芽孢菌，另一個樣品主要的優勢菌為枯草芽孢桿菌。作為乳酸菌的重要組成部分，腸球菌和乳酸片球菌在發酵食品中的作用非常重要和明顯，然而，芽孢桿菌由于其廣泛的環境適應能力，也可以在食品發酵中發揮作用，因此在本研究中很難明確其作用，這一點仍需結合功能基因的表達進行更為深入的研究。

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