迷迭香酸的提取及抗氧化活性測定

馬志剛，鄭永雯，楊保濤，馮益青，楊 磊，曹秋娥

（云南大學化學科學與工程學院，云南昆明 650091）

·科學研究·

迷迭香酸的提取及抗氧化活性測定

馬志剛，鄭永雯，楊保濤，馮益青，楊 磊，曹秋娥*

（云南大學化學科學與工程學院，云南昆明 650091）

研究了用乙醇從迷迭香中提取迷迭香酸的工藝，同時，利用Fonton方法測定了迷迭香酸的抗氧化活性。結果表明，乙醇提取迷迭香酸的最佳體積分數為50%，迷迭香酸具有很好的抗氧化活性。該工藝為工業化、大規模生產迷迭香酸提供了一定的實驗基礎和借鑒。

迷迭香；迷迭香酸；乙醇；抗氧化活性

迷迭香酸（Rosmarinic acid，RosA）是一種含多酚羥基的有機酸，最早由Ellis從迷迭香（Rosmarnus officinalis L）植物中發現［1］。1958年，由Scarpati和Oriente等人確定了其結構，見圖1所示［2］。

圖1 迷迭香酸的結構Figure1 Rosemary acid structure

迷迭香酸（分子式：C18H16O8）是一分子咖啡酸和一分子3，4－二羥基苯基乳酸（即丹參素）的縮合物，為水溶性的多酚類化合物，其化學名為［R （E）］α－｛［3－（3，4－二羥基苯基）－l－氧代－2－丙烯基］氧基｝－3，4－二羥基苯丙酸。

迷迭香是一種多用途的經濟作物，1981年首次引入我國并栽培成功，在云南、湖南、四川、貴州、廣西等地都有種植。迷迭香酸的合成成本高，步驟復雜，難于實現大規模工業化生產［3］。從迷迭香中提取的迷迭香酸可作為抗氧化劑、迷迭香精油和醫藥中間體，廣泛應用于食品、功能食品、香料、調味品及日用化工等領域中［4］。在各種文獻資料中，對迷迭香中迷迭香酸的分離提取工藝進行優化的報道比較少。為此，本文探討了乙醇－水超聲波提取工藝，并采用大孔樹脂對初提物進行分離純化，為下一步有效地開發和利用迷迭香酸提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀，帶DAD檢測器；XMTD－4000數顯恒溫水浴鍋（上海科析試驗儀器廠）；Thermo Nicolet AVATAR 360紅檢測器；UV－1700紫外可見分光光度計；超聲波提取器；旋轉蒸發儀；抽濾裝置；AR214分析天平等。

迷迭香酸標準品（阿拉丁試劑）；甲醇（HPLC）；1，1－二苯基－2－苦肼基（北京百靈威科技有限公司）；迷迭香，采自云南大學呈貢校區，洗凈、烘干、粉碎成粉末后備用；其它試劑均為分析純；實驗用水為超純水。

1.2 色譜方法

色譜柱：Waters XTerra ODS2 5 μm（4.6 mm ×250 mm）；流動相：甲醇－0.5%磷酸水溶液（55 ∶45，體積比）；流速1.0 mL／min；柱溫25℃；檢測波長330 nm；進樣量10 μL。標準品和提取樣品的色譜圖見圖2。

圖2 迷迭香酸對照品（A）和提取樣品（B）的色譜圖Figure 2 Chromatography of the rosmarinic acid reference（A）and sample（B）

儲備液迷迭香酸（1.00 mg／mL）用10%乙醇水溶液配制，4℃下避光保存。對照品的工作溶液由儲備液用10%乙醇水溶液稀釋得到。方法的線性范圍、回歸方程、檢出限、重現性見表1。

表1 迷迭香酸的工作曲線及檢出限Table 1 Calibration curve and limit of detection rate

1.3 迷迭香酸提取條件的優化

準確稱取5.0 g迷迭香粉末8份，分別置于不同圓底燒瓶中。依次加入（體積分數）10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇水溶液20ml，震蕩混勻。在40℃下，在超聲波提取器里提取60min。提取完畢后，用抽濾裝置減壓過濾。將過濾所得母液置于旋轉蒸發儀中，調節溫度至65℃，濃縮至3～5 mL，再次過濾；濾去沉淀后，母液置于試管中，分別編號為1，2，3，4，5，6，7，8。分別用大孔樹脂純化濃縮后，用HPLC測定不同體積分數乙醇水溶液提取后的迷迭香酸含量。結果見圖3。

從圖3看出，乙醇提取迷迭香酸的最佳體積分數為50%。

1.4 迷迭香酸抗氧化活性的測定

本實驗采用亞鐵離子催化過氧化氫產生羥自由基（Fonton）的方法，考察迷迭香酸對羥自由基的清除作用。取0.75 mmol／L鄰二氮菲1 mL、磷酸鹽緩沖溶液2 mL和蒸餾水1 mL，充分混勻后，加0.75 mmol／L硫酸亞鐵溶液1 mL，搖勻；加0.01%過氧化氫1 mL，于37℃保持60 min。在536 nm處測其吸光度，記為AP。用1 mL 30%乙醇代替1 mL過氧化氫，測得吸光度為AB。用1 mL迷迭香酸代替1 mL蒸餾水，測得吸光度為AS。羥自由基的清除率（d）按下式計算：d＝（AS－Ap）／（AB－Ap）×100%。測定結果見表2。

圖3 乙醇體積分數對迷迭香酸提取率的影響Figure 3 The effect of the proportion of ethanol for rosemary acid extraction

表2 迷迭香酸對羥自由基的清除率Table 2 Hydroxyl radical scavenging rate

從表2看出，隨著加入迷迭香酸質量濃度的提高，其對羥自由基的清除率也逐漸提高。

2 結果與討論

2.1 HPLC檢測波長的選擇

迷迭香酸乙醇溶液的紫外可見吸收光譜表明，其在220 nm和330 nm處均有較大吸收。為避開紫外區的干擾并獲得較高的檢測靈敏度，實驗選擇了330 nm作為迷迭香酸的HPLC檢測波長。

2.2 HPLC流動相的選擇

由于迷迭香酸中有共軛結構存在，在選用流動相時，應注意保持流動相的低pH值，防止色譜峰的拖尾現象，可以選用甲酸、醋酸或磷酸的水溶液來實現。所以實驗選用甲醇－0.5%H3PO4水溶液為流動相。

2.3 提取方法的應用價值

從提取實驗來看，迷迭香酸的提取采用50%的乙醇是提取率最好的。該工藝選用無毒、易揮發的乙醇作為提取溶劑：來源便捷，容易除去，且實驗環境友好，為工業化、大規模生產迷迭香酸提供了一定的實驗基礎和借鑒。

［1］ 陳蕙芳，馬永華，卞學偉.植物活性成分辭典：第二冊［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2001：888.

［2］ Scarpati M L，Orient G.Isolation and constitution of rosmarinic acidfromRosmarinusofficinalis［J］.Ricerca Sci，1958，28（3）：2329－2333.

［3］ Maike Petersen，Monique S.J.Simmonds.Molecules of Interest Rosmarinic acid［J］.Phytochemistry，2003，62 （2）：121－125.

［4］ 韓宏星，宋志宏，屠鵬飛.迷迭香水溶性成分研究［J］.中草藥，2001，32（10）：877－878.

［5］ 張春艷.迷迭香酸的提取與分離純化工藝研究［J］.中國釀造，2009，7：75－77.

［6］ 周平，呂曉玲，胡淳罡.大孔吸附樹脂分離純化迷迭香酸的研究［J］.離子交換與吸附，2011，27（4）：304－314.

［7］ 黃宏妙，郭占京，甄漢深，等.迷迭香中迷迭香酸提取工藝的優化［J］.湖北農業科學，2012，51（12）：2568－2569.

［8］ 張玉杰，徐文清，沈秀.迷迭香酸的提取分離及藥理學新發現［J］.中國新藥雜志，2013，22（4）：433 －437.

［9］ 謝芳芳，曾和平.迷迭香酸的純化［J］.廣東化工，2013，40（17）：1－2.

Rosmarinic Acid Extraction and Antioxidant Activity Determination

MA Zhi－gang ZHENG Yong－wen，YANG Bao－tao，FENG Yi－qing，YANG Lei，CAO Qiu－e

（School of Chemical Science and Technology，Yunnan University，Kunming 650091，China）

A method was studied for the extraction process of rosmarinic acid from rosemary with ethanol－water system，while the extract antioxidant activity was determined using Fonton method.The results showed that the optimum ratio of ethanol－water system extract of rosemary is 50%and the rosemary acid has good antioxidant activity.This extraction process can provides some experimental basis and reference for the industrialization and mass production of rosemary acid.

Rosmarinic Acid；Extraction；Antioxidant Activity；Determination

O658

A

1004-275X（2014）06-0001-03

12.3969／j.issn.1004-275X.2014.06.001

收稿：2014-09-01

國家自然科學基金（20964005）；國家大學生創新創業訓練計劃（121067309）。

馬志剛（1978-），男，云南安寧人，碩士，實驗師，主要研究方向：中草藥活性成分的分離分析。

*通信聯系人：曹秋娥（1967-），女，湖南人，博士，教授，主要研究方向：中草藥活性成分的分離分析。