高效液相色譜柱后衍生法測定中藥材中的黃曲霉毒素

王婭玲，李維峰，劉 寶，劉 香，何維紅

（1.云南熱帶作物職業學院熱帶作物生產與技術系，云南普洱 665000；2.普洱淞茂制藥股份有限公司，云南普洱 665000）

高效液相色譜柱后衍生法測定中藥材中的黃曲霉毒素

王婭玲1，李維峰1，劉 寶2，劉 香2，何維紅2

（1.云南熱帶作物職業學院熱帶作物生產與技術系，云南普洱 665000；2.普洱淞茂制藥股份有限公司，云南普洱 665000）

檢測普洱城區僵蠶、陳皮、桃仁、胖大海4種中藥材的黃曲霉毒素，了解其污染狀況。樣品經70%甲醇提取、免疫親和柱凈化后，用HPLC-柱后衍生-熒光檢測器進行分析測定藥材中的黃曲霉毒素（G2、G1、B2、B1）含量。檢測的80個樣品中，共有7個樣品檢出黃曲霉毒素，黃曲霉毒素B1的含量最高為1.89μg／kg，黃曲霉毒素總量最高為3.57μg／kg。盡管未超出國家藥典規定范圍，但是普洱城區4種中藥材存在一定的黃曲霉毒素污染的風險。

僵蠶；陳皮；桃仁；胖大海；黃曲霉毒素；高效液相色譜柱后衍生法

黃曲霉毒素，是黃曲霉、寄生曲霉及溫特曲霉等產毒株的代謝產物，是一類結構類似的化合物［1］。黃曲霉毒素是劇毒化合物，其毒性比氰化鉀還高，也是最強的化學致癌物質［2］。黃曲霉毒素主要污染糧油及其制品，而部分中藥材及其制劑在儲存過程中也會發生霉變，產生黃曲霉毒素［3］。2010版《中國藥典》一部規定陳皮、胖大海、桃仁、僵蠶等中藥材需檢測黃曲霉毒素，其中黃曲霉毒素B1的限量為5μg／kg，黃曲霉毒素（B1＋B2＋G1＋G2）的限量為10μg／kg。黃曲霉毒素的檢測有多種方法，目前應用較多的是高效液相色譜法［4，5］。筆者通過對普洱城區市場上上述4種中藥材抽樣進行黃曲霉毒素檢測，以期評估當前普洱市場上這4種藥材存在的黃曲霉毒素污染風險。

1 儀器、試劑與藥材

主要儀器：LC200／UV高效液相色譜儀（美國PE）；熒光檢測器；柱后衍生系統Vector PCX（美國Ameritech）；國華HY-3數顯多功能振蕩器；電子分析天平（上海奧豪斯貿易有限公司）；純水／超純水系統（韓國HUMAN PowerI）。

主要試劑：甲醇（AR，上海國藥）；甲醇（色譜純，德國MERCK）；乙腈（色譜純，德國MERCK）；碘（AR，上海國藥）；超純水；黃曲霉總量免疫親和柱ToxinFast?AFT HCM0125（華安麥科），黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合對照品（美國supelco公司，批號：46304-U，質量濃度依次為1μg／m L、7.5 μg／m L、1μg／m L、0.3μg／mL）。

僵蠶、陳皮、桃仁、胖大海樣品其中各有5份由普洱松茂制藥股份有限公司提供，其余各從普洱城區藥材市場采購15份，共得到樣品80份。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱為Agilent Lichrosper C18（4.6 mm× 250mm，5μm），流動相為甲醇-乙腈-水（1∶1∶2），流速0.8 mL／min；柱后衍生試劑為0.05%的碘液，衍生試劑流速0.3mL／min，反應溫度70℃，以熒光檢測器檢測，激發波長為360 nm，發射波長為450 nm；柱溫20℃；運行時間為35min。

2.2 待測溶液的制備

對照品溶液：精密量取黃曲霉毒素混合溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，作為混合對照品儲備液；然后精密量取上述儲備液1mL，置于25 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得到混合對照品溶液（黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2質量濃度依次為4 ng／mL、30 ng／mL、4 ng／mL、1.2 ng／mL）。

樣品溶液：取適量樣品粉碎，過2號篩，精確稱取樣品25 g，置于250 mL具塞錐形瓶，加入氯化鈉5 g，加70%甲醇125mL，蓋好塞子，在振蕩器上高速震蕩25 min，震蕩完畢，靜置20 min，精密移取10 m L上清液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻。將上述溶液用微孔濾頭（0.22 μm）過濾，取10 mL濾液過黃曲霉毒素免疫親和柱，流速控制1～2滴／s，待濾液全部通過免疫親和柱，用10mL純水沖洗免疫親和柱，流速控制為2～3滴／s，待純水流凈之后加入2 mL甲醇，控制流速為1滴／s，使結合在免疫親和柱上的黃曲霉毒素沖洗下來，洗脫液直接裝入小瓶供檢測用。

2.3 方法適用性試驗

標準曲線的考察：在前述色譜條件下，用自動進樣器分別進樣5、10、15、20、25μL，記錄色譜圖，以黃曲霉毒素進樣體積為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，通過軟件計算得到回歸方程，見表1。

精密度實驗：標準對照品溶液，在進樣體積10 μL處連續進樣6次，結果黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2各峰面積RSD分別為0.3%、0.5%、0.4%、0.5%，表明儀器精密度良好。

表1 黃曲霉毒素的線性回歸方程、相關系數及線性范圍Table 1 Regression Equation，Correlation Coefficient and Line Range of Aflatoxins

穩定性實驗：混合標準對照品溶液，在配制0、5、15、25 h后分別取2010μL進樣，每次進樣得到的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2各峰面積RSD分別為1.4%、0.8%、1.1%、1.5%，表明對照品溶液在25 h內基本穩定。

回收率實驗：稱取4種空白藥材各3份，分為3組，每組分別加入混合對照儲備液1、2、3mL，然后按照前述樣品處理方法進行相同處理，制備得到供試品溶液，進樣測定黃曲霉毒素含量。計算平均回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率實驗結果（n＝3）Table 2 The Sam p le Added Recovery Determ ination（n＝3）

檢出限：在空白樣品中加入對照品，按照樣品處理流程處理，進樣，測定黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的信噪比（S／N），用S／N＝3的計算方法計算檢出限，得到黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢出限分別是0.2μg／kg、0.15μg／kg、0.1μg／kg、0.2μg／kg。

2.4 樣品檢測

按照前面建立的檢測方法測定4種藥材，共計80個樣品。結果表明，檢出率比較低，其中桃仁樣品未檢出，陳皮檢出率為15%，僵蠶檢出率為20%，胖大海未檢出。檢出的樣品中，黃曲霉毒素B1的含量最高為1.89μg／kg，黃曲霉毒素總量最高為3.57μg／kg，以國家藥典規定限量（黃曲霉毒素B1為5μg／kg，黃曲霉毒素（B1＋B2＋G1＋G2）為10μg／kg）判定，樣品合格率為100%。陽性樣品結果見表3。

?表3 中藥材中黃曲霉毒素陽性結果Table 3 Total positive result of the 4 kinds of T raditional Chinese M edicines from Puer Downtown Areas μg／kg

3 結論

曲霉毒素被世界衛生組織（WHO）的癌癥研究機構（IARC）劃定A組，即“人類致癌物，人們已經對這些毒素在食品中的存在進行了廣泛而深入的研究，卻對這些毒素在中藥中的存在有所忽略。中藥材及其制劑在儲存過程中經常會發生霉變現象，從而會產生很多對人體有害的霉菌毒素。通過本次分析檢測結果顯示，由普洱松茂制藥股份有限公司提供的5個樣品中均未檢測到黃曲霉毒素，而在普洱城區市場中采購的樣品中僵蠶、陳皮兩種中藥材存在一定的黃曲霉毒素污染，這與夏季普洱氣候比較濕熱，小的公司或攤販貯存條件不當，導致藥材發生霉變有關。雖然此次檢測結果低于國家限定水平，但是應當引起重視。

［1］ 張愛婷.中藥黃曲霉毒素含量測定及限度標準的研究［J］.光明中醫，2008，23（11）：1668-1669.

［2］ 楊美華.藥用植物及其產品中真菌及真菌毒素污染研究進展［J］.貴州農業科學，2008，36（6）：59-63.

［3］ 劉曉霞，傅武勝，吳錦忠.植物藥中黃曲霉毒素現代分析方法概況［J］.海峽預防醫學雜志，2010，15（2）：28-31.

［4］ 李軍，于一茫，田苗，等.免疫親和柱凈化－柱后光化學衍生－高效液相色譜法同時檢測糧谷中的黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A［J］.色譜，2006，24（6）：581-581.

［5］ 鄭榮，毛丹，王柯，等.HPLC法測定中藥中黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1的含量［J］.藥物分析雜志，2005，26（6）：5-8.

Determ ination of A flatoxins in 4 Kinds of Traditional Chinese M edicines in Puer Downtown Areas by HPLC w ith Post－colum n Derivatization

WANG Ya-ling1，L IW ei-feng1，LIU Bao2，LIU Xiang2，HE W ei-hong2

（1.Yunnan Vocational College of Tropical Crops，Puer 665000，China；2.Puer Songmao Pharmaceutical Co.，Ltd，Puer 665000，China）

Objective：To determine aflatoxins in 4 kinds of Traditional Chinese Medicines including Bombyx batryticatus，dried tangerine peel，Persicae Semen，Sterculia lychnophora from Puer Downtown Areas.Method：After being extracted by 70%methanol and purified by immunoaffinity columns，4 aflatoxins（G2，G1，B2，B1）from 80 samples of 4 kinds of Traditional Chinese Medicines were analyzed by HPLC with post－column derivatization and fluorescence detector.Result：The aflatoxinswere found in 5 samples，with positive rate of8.75%in all.The highest content of aflatoxin B1 is1.89μg／kg，and the highest content of aflatoxins is3.57μg／kg。Conclusion：The aflatoxins pollution exists among the 4 kindsof Traditional Chinese Medicines from Puer Downtown Areas，although it is lower than the national standard.

Bombyx batryticatus；dried tangerine peel；Persicae Semen；Sterculia lychnophora；aflatoxins；

R927.11

： A

： 1004-275X（2014）01-0042-03

12.3969／j.issn.1004-275X.2014.01.011

收稿：2013-05-27

王婭玲（1985-），女，云南宣威人，助教，主要從事環境化學和食品化學方面研究。

post－column derivatization