響應面法優化蛹蟲草菌固體發酵五味子藥渣發酵條件

賀曉玉，羅 杰，李英倫

(四川農業大學動物醫學院，四川雅安625014)

隨著中醫藥事業的迅速發展，中藥渣廢棄量日益增加。這些藥渣被視為廢物，采取堆放、填埋、焚燒等方式處理，不僅資金投入大，污染環境，更是一種極大的資源浪費［1］;更為嚴重的是，部分中藥藥渣再次進入藥材市場，以次充好，真偽難辨，損害藥品生產企業以及消費者的利益。中藥主要有植物、動物以及部分礦物藥，其中植物類藥材占87%以上。植物類中藥渣中含有大量粗纖維、粗蛋白、粗脂肪、糖類、氨基酸等營養物質，以及鈣、鎂、鐵、磷等多種無機元素［2］;而且由于中藥提取工藝比較單一，許多藥用活性成分仍殘留在藥渣中［3］。據報道，中藥制藥過程中有效成分的提取率一般為30%～70%，大量活性成分仍殘留在藥渣中［4］。

目前，有關中藥渣綜合利用技術的研究很多，例如作為食用菌(平菇，香菇等)的培養基［5-6］、栽培蔬菜［7］、制造絮凝劑或吸附劑處理廢水［8］、用作動物飼料添加劑［9-11］，發酵生產乙醇［12］等，但大多屬于探索性研究，真正能夠投入實際應用的技術不多，能夠大規模的消化中藥渣，變廢為寶，減輕環境壓力的技術更少。

鑒于此，本實驗采用藥用真菌雙向固體發酵技術［13］，以蛹蟲草菌為發酵菌種，發酵五味子藥渣，并采用響應面法優化發酵條件，旨在尋求一條綜合利用五味子藥渣的有效途徑，為中藥渣的回收再利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛹蟲草菌［Cordycepsmilitaris(L.)Link］ 山東省東方蟲草科技園提供，并經中國科學院微生物研究所鑒定;五味子藥渣 雅安三九藥業有限公司提供;蟲草素標準品(批號:MUST-11072701) 四川省藥品檢驗所，含量≥98%;甲醇 北京京科瑞達生物科技有限公司，色譜純;葡萄糖、重蒸酚、濃硫酸 國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

HZS-H水浴振蕩器 哈爾濱市東明醫療器械廠;SPX型生化培養箱 寧波東南儀器有限公司; LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;SHB-3循環多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠; HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司; UV-2000型紫外可見分光光度計 優尼柯上海儀器有限公司;高效液相色譜儀(LC-2010C HT) SHIMADZU CORPORATION;pHS-25型酸度計 成都方舟科技開發公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥渣處理 將五味子藥渣置于烘箱中，50℃烘干至恒重，粉碎過20目篩，備用。

1.2.2 培養基制備 菌種活化培養基(PDA):馬鈴薯20%(煮后過濾取汁)，葡萄糖2%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%，瓊脂2%，蒸餾水1000m L，pH自然［14］。液體菌種培養基:葡萄糖2%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%，蒸餾水1000m L，pH自然［15］。

1.2.3 菌種活化 在超凈工作臺上按無菌操作，將蛹蟲草菌種接種到PDA斜面培養基上，置于生化培養箱中25℃避光培養6d，制成活化菌種［16］。

1.2.4 種子液制備 在裝有200m L液體種子培養基的500m L三角瓶中，放入6粒直徑為3～6mm的玻璃珠，按照無菌操作，接入大小約為5mm×5mm的經活化后的蛹蟲草斜面菌塊，25℃，120r/min振蕩避光培養6d，制成種子液［17］。

1.2.5 單因素實驗確定因素水平范圍 將發酵基礎條件定為:水料比［蒸餾水體積(m L):五味子藥渣重量(g)］為2m L/g、基質(五味子藥渣)重量為40g、接種量［種子液體積(m L):五味子藥渣重量(g)］為10%、發酵溫度為25℃、發酵時間為9d［18］。在此基礎條件下，分別考察各因素的變化對發酵產物中蟲草素和多糖含量的影響。按照以下因素水平設計實驗:水料比:0.5、1、1.5、2、2.5、3m L/g;基質重量:10、20、30、40、50、60g;接種量:5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%;發酵溫度:20、22、24、26、28、30℃;發酵時間:5、7、9、11、13、15、17、19d。上述各處理組均用蟲草瓶盛裝培養基，并按照無菌操作方法，接種蛹蟲草菌種子液后，置于生化培養箱中避光培養。發酵終止后將各組發酵產物(整個培養基質)置于烘箱中，50℃下烘干至恒重，粉碎，并充分混勻，用于檢測蟲草素及多糖含量。

1.2.6 響應面法優化發酵條件 在單因素實驗的基礎上，采用Box-Benhnken(BBD)實驗設計，以水料比(A)、基質重量(B)、接種量(C)、發酵溫度(D)4個顯著性因素為考察變量，以發酵產物中蟲草素含量為響應值(Y)，進行4因素3水平實驗，實驗因素及水平見表1。并應用Design-expert V8.0.5b軟件進行數據分析，建立數學回歸模型確定最佳發酵條件。

表1 Box-Benhnken實驗設計因素及水平Table1 Factor-levels for Box-Benhnken

1.2.7 蟲草素及多糖含量測定 多糖含量測定:稱取5g經烘干后的發酵產物樣品，采用水熱回流提取法提取多糖，即加10倍量水，80℃熱回流提取1.5h，重復3次。合并提取液，過濾、濃縮至1∶1(g/m L)，加3倍量的分析純乙醇沉淀，離心，傾出上清液，再用乙醇洗沉淀2次，離心，低溫干燥，即得多糖粗品［19］。采用濃硫酸-苯酚法［20］測定多糖含量，以分析純葡萄糖為多糖標準品繪制標準曲線，得回歸方程Y= 0.0078X-0.061(R2=0.9992)，根據該方程計算發酵產物中多糖含量。

蟲草素含量測定:稱取2.5g經烘干后的發酵產物樣品，加入90%甲醇50m L，70℃ 回流提取40m in后，過濾取濾液，再加入90%甲醇定容至50m L。采用高效液相色譜法(HPLC)測定蟲草素含量，色譜條件為:Diamonsil C18柱(4.6mm×150mm，5μm)，以磷酸鹽緩沖液(pH6.5)(取0.01mol/L磷酸二氫鈉68.5m L與0.01mol/L磷酸氫二鈉31.5m L，混合)-甲醇(17∶3)為流動相，流速為1m L/m in，檢測波長為260nm，進樣量為10μL，柱溫為30℃［21-22］。以蟲草素標準品繪制標準曲線，得回歸方程Y=34473X+34135(R2=0.9988)，根據該方程計算發酵產物中蟲草素含量。

1.2.8 數據統計與分析 本實驗數據均為5個平行樣的平均值，采用 Excel 2003及 Design Expert V8.0.5b數據分析軟件分析。

2 結果及分析

2.1 單因素實驗結果及分析

由圖1a～圖1e可以看出，水料比、基質重量、接種量、發酵溫度4個因素對蛹蟲草菌固體發酵五味子藥渣產物中蟲草素含量的影響較大(成倍增減);而各因素對發酵產物中多糖含量的影響相對較小(變化不大)，這是由于蛹蟲草菌在生長過程中一方面要分解利用培養基中多糖，另一方面又代謝產生多糖的緣故，進而發酵基質中多糖含量比較穩定。

由圖1a可知，水料比對蟲草素含量的影響很大，當水料比為1.5m L/g時，發酵產物中蟲草素含量最高。水料比在0.5～1.5m L/g范圍內，發酵產物中蟲草素含量迅速增加;當水料比高于1.5m L/g時，蟲草素含量顯著降低，可能是由于過高的含水量導致培養基黏度增加，多孔性降低，減少了培養基質內氣體的交換，造成局部缺氧，不利于蛹蟲草菌對中藥渣的降解利用。

圖1 各因素對發酵產物中蟲草素及多糖含量的影響Fig.1 Effects of various factors on the production of cordycepin and polysaccharide

由圖1b可知，當基質重量為30g時，發酵產物中蟲草素含量最高。當基質重量低于30g時，蟲草素含量降低，原因在于培養基中營養物質較少，不能滿足蛹蟲草菌的生長需要;當基質重量高于30g時，蟲草素含量顯著降低，究其原因可能是培養基厚度增加，導致培養基底層缺氧，蛹蟲草菌不能滲入培養基底部生長。

由圖1c可知，當接種量為20%時，發酵產物中蟲草素含量最高。接種量在5%～20%范圍內，蟲草素含量隨著接種量的增加而增多，上升趨勢明顯。當接種量超過20%時，蟲草素含量明顯下降，原因在于菌量較多時，對營養物質的需求也多，而培養基中的營養物質有限，當生長到一定程度后就不能繼續滿足微生物的正常生長了，同時由于接種量增多，過早進入衰亡期，出現自溶現象，使菌株的正常生長繁殖受到抑制。

由圖1d可知，當培養溫度為24℃時，發酵產物中蟲草素含量最高。溫度影響酶的活性，從而影響蛹蟲草菌對培養基中營養物質的分解利用。溫度太高或者太低，都不利于蛹蟲草菌生長繁殖。

由圖1e可知，當發酵時間為15d時，發酵產物中蟲草素含量最高。之后，蟲草素含量幾乎不變，原因在于隨著發酵時間的延續，培養基質中營養物質越來越少，以致不能維持蛹蟲草菌生長，因此發酵時間定為15d。

2.2 響應面法確定最佳發酵條件

2.2.1 響應面實驗設計及結果 根據Box-Benhnken實驗設計原理，結合上述單因素實驗結果，將發酵時間固定為15d，選取水料比(A)、基質重量(B)、接種量(C)、培養溫度(D)四個顯著因素為考察變量，以發酵產物中蟲草素含量(Y)為響應值，進行四因素三水平實驗設計，實驗設計方案及結果見表2。

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗 利用 Design Expert V8.0.5b軟件對表2實驗數據進行回歸分析，得到回歸方程為Y=4.76+0.89A+0.32B+0.31C+0.13D+0.23AB-0.09AC+0.42AD+0.26BC+0.24BD +0.091CD-1.05A2-0.70B2-0.37C2-0.43D2(R2= 0.9799，Ad j-R2=0.9598)。回歸方程的方差分析結果見表3。由表3可知，模型(p＜0.0001)極顯著，相關系數R2=0.9799，說明該模型擬合度好，實驗誤差小;失擬項(p=0.372＞0.05)不顯著，表明未知因素對實驗結果干擾小。因此，可用此模型來分析和預測蛹蟲草菌發酵五味子藥渣的發酵條件。

2.2.3 蛹蟲草菌發酵五味子藥渣最佳發酵條件的預測及驗證實驗 通過回歸模型預測分析，在實驗的因素水平范圍內，最佳發酵條件:水料比為2m L/g、基質重量為36.68g、接種量為23.15%、發酵溫度為25.78℃，模型預測發酵產物中蟲草素含量為5.0962mg/g。考慮到實驗操作的可行性，將此最佳發酵條件稍作修改:水料比為2m L/g、基質重量為37g、接種量為23%、培養溫度為26℃。在此條件下進行重復驗證實驗，10個重復驗證實驗所得發酵產物中蟲草素含量平均值為5.1202mg/g，與模型預測值相差0.47%。可見，模型預測值和實測值之間具有良好的擬合性，從而響應面法優化的發酵條件可為今后蛹蟲草菌發酵五味子藥渣生產和開發利用提供必要的理論依據。

3 結論與討論

3.1 由于實驗條件限制，本實驗僅考察了水料比、基質重量、接種量、發酵溫度四個主要因素對蛹蟲草菌固體發酵五味子藥渣的影響。各因素對發酵產物中蟲草素含量的影響均較大，響應面法優化得出最佳發酵條件為:水料比2m L/g，基質重量37g，接種量23%，發酵溫度26℃。在最佳發酵條件下發酵所得產物中蟲草素含量為5.1202mg/g。這是因為蛹蟲草菌在生長代謝過程中產生多種酶，如纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶等，可分解利用五味子藥渣中大分子營養物質［23］生長繁殖，進而產生蟲草素。經測定，發酵前五味子藥渣中多糖含量為22.95mg/g，而發酵產物中多糖含量為28.68mg/g，比發酵前的五味子藥渣高24.97%，這可能是蛹蟲草菌產生了蟲草多糖，或是五味子藥渣經蛹蟲草菌產生的各種分解酶作用后，殘留其中的多糖溶出，亦或是二者相加的結果。

表2 Box-Benhnken實驗設計方案及結果Table2 Results of four factors，Box-Benhnken experimental design

3.2 五味子中含有木脂素、多糖、揮發油等多種活性成分，但目前對五味子的利用主要集中在木脂素，其他藥用活性成分仍部分殘留在藥渣中。蛹蟲草菌產生的纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶等，可使五味子藥材細胞破裂，促使活性成分更多的溶出，而大部分這類物質是不被蛹蟲草菌生長所利用的，如五味子木脂素等，這些物質便在發酵基質中富集［24］。本實驗僅研究了發酵前后培養基質中蟲草素和多糖的含量變化，五味子有效活性成分，如木脂素等的含量變化有待進一步研究。

表3 回歸模型的方差分析Table3 Analysis of variance(ANOVA) for the quadratic polynomialmodel

3.3 蟲草素具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤等廣泛的生物學活性［25］，而多糖亦是一種作用廣泛的免疫促進物質。因此，發酵產物有望用于動物保健藥或治療藥物的開發、提取分離蟲草素等，具有廣闊的應用前景。將五味子藥渣用作蛹蟲草菌固體發酵培養基，提高了五味子藥渣的利用價值，為中藥渣的回收再利用提供了參考。

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