重組大腸桿菌產青霉素酰化酶的發酵動力學研究

韋曉菊，黎繼烈*，朱曉媛

（中南林業科技大學生命科學與技術學院經濟森林培育與保護教育重點實驗室，湖南長沙410004）

重組大腸桿菌產青霉素酰化酶的發酵動力學研究

韋曉菊，黎繼烈*，朱曉媛

（中南林業科技大學生命科學與技術學院經濟森林培育與保護教育重點實驗室，湖南長沙410004）

對產青霉素酰化酶重組大腸桿菌M3進行分批發酵動力學研究。根據Logistic和Luedeking-Piret方程，擬合出重組大腸桿菌M3

青霉素酰化酶；分批發酵；發酵動力學模型

青霉素酰化酶（penicillinacylase）是一種具有重要應用價值的工具酶，既能廣泛應用于半合成β-內酰胺抗生素，又能反向催化水解青霉素，生產合成β-內酰胺抗生素的中間體6-氨基頭孢烷酸（6-amino-cephalosporanicacid，6-ACA）和7-氨基脫乙酰頭孢烷酸（7-amino desacetoxy cephalosporanic acid，7-ADCA）；同時在手性藥物的拆分和多肽合成等方面也有不俗表現[1-5]。近年來抗生素生產市場已形成以DSM-GB公司為首（約占34%），中國、印度、韓國等亞洲公司（約25%）和荷蘭Duchefa Biochemie B.V.公司（約18%）、上海Antibioticos國際貿易有限公司（約10%）等歐美公司并存的格局[6-7]。在市場需求的催生下，工藝流程簡單，反應條件溫和，清潔無污染的酶法合成抗生素應運而生。目前，青霉素酰化酶促合成β-內酰胺抗生素及制備6-ACA等中間體的新工藝和新技術不斷涌現[8-10]，使綠色環保的酶法合成抗生素替代化學法得以大規模推廣，必將對抗生素產業發展產生深遠影響。

發酵過程中菌體生長、產物生成、基質消耗的動態平衡及其內在規律構成的動力學模型即為發酵動力學模型的3個組成部分[11]。因而建立重組大腸桿菌產青霉素酰化酶的動力學模型，并對發酵過程的數據進行分析能更好的認識菌體的生長及產物形成的機制，為進一步放大實驗以及工業化優化與調控提供理論依據。且重組大腸桿菌發酵原料廉價，產酶周期短[12]，既適合多次重復驗證試驗以得出最優結果，又為大規模工業化生產提供了便利。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

重組大腸桿菌M3：本實驗室保藏。

1.1.2 培養基

種子培養基（LB培養基）：蛋白胨1.0%，酵母浸粉0.5%，氯化鈉1.0%，pH 7.0。121℃滅菌20 min。

發酵培養基：蛋白胨2.0%，酵母浸粉1.0%，氯化鈉1.0%，甘油2.0%，卡那霉素50μg/mL，泡敵0.05%，pH 7.0。

1.1.3 試劑

蛋白胨（分析純）：北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母浸粉（分析純）：上海研生生化試劑有限公司；氯化鈉（分析純）：天津大茂化學試劑廠；甘油（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；卡那霉素（分析純）：鵬程生物技術有限公司；異丙基硫代半乳糖苷（優級純）：上海勵瑞生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

B型SL5L全自動控制發酵罐：上海保興生物設備工程有限公司；SZK-730紫外可見分光光度計：深圳歐克儀表科技有限公司；S-250D型超聲波細胞破碎儀：美國Branson公司；AvantiJ-E高速冷凍離心機：美國BeckmanCoulter公司。1.3實驗方法

1.3.1 種子液培養

每瓶50mL分裝于250mL，錐形瓶中，滅菌后加入100μg/mL卡那霉素，接入甘油保藏菌液，在30℃、160r/min條件下振蕩培養24h。

1.3.2 分批發酵過程

分批發酵采用5L發酵罐，裝料系數0.6，即加入3L發酵培養基，121℃實罐滅菌20min，冷卻至30℃后接入100mL種子液。發酵過程中，保持罐內壓為0.02～0.03MPa之間，并使用溶氧電極和pH電極實時監測溶氧和pH的變化情況。通過調節轉速和通氣量使溶氧保持在20%～60%。培養至10h，測定菌體濃度，降溫至24℃，加入30μg/mL異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）進行誘導。

1.3.3 發酵過程中參數的測定

菌體濃度的測定：采用濕重法。取發酵液1mL用高速離心機離心10min棄上清液稱質量，減去離心管的質量并求得菌體濕質量。

青霉素酰化酶酶活的定義：在37℃時，單位體積的青霉素酰化酶在單位時間內催化青霉素鉀鹽水解生成1μmol的6-APA所需的酶量定義為1個活力單位，U/L。根據定義采用堿滴定法[13]測定酶活力。

甘油含量的測定：用甘油銅比色法[14]。

1.3.4 數據的獲取及處理

從發酵開始計時取樣，再每3h取樣測定不同時期的菌體濕質量、青霉素酰化酶酶活力以及甘油濃度，以上實驗每組做3次平行實驗，取平均值，并用Origin 8.0繪圖軟件對動力學方程進行非線性擬合，繪制動力曲線，以獲得最佳動力學模型參數[15]。

2 結果與分析

2.1 重組大腸桿菌產青霉素酰化酶發酵過程中代謝變化規律

重組大腸桿菌M3代謝變化特征如圖1所示。由圖1可知，該菌體生長延遲期為0～3h，在該階段菌體基質消耗較少，菌體濃度增長不明顯，青霉素酰化酶產量為零。進入對數期后，菌體生長加快，基質消耗增加，甘油含量顯著下降，青霉素酰化酶產量也隨之增長。進入穩定期后菌體濕質量幾乎不再增長，甘油消耗量也逐漸減少，但青霉素酰化酶酶活力持續升高，酶活力在27h時達到最高值33.5U/mL，由此判斷該菌種產的青霉素酰化酶的合成方式屬于生長部分偶聯型。

圖1 重組大腸桿菌M3產青霉素酰化酶發酵進程曲線Fig.1 Fermentation curve of penicillin acylase produced by Escherichia coliM3

2.2 動力學模型

2.2.1 菌體生長動力學模型

細胞生長動力學普遍使用Logistic方程，其能較好描述分批發酵過程中因菌體濃度的增加對菌體自身存在的抑制作用。該方程被看作是一個表現細胞生長于營養物質之間非線性關系的經驗方程[16-17]。本實驗中大腸桿菌的生長曲線為較標準的S型，故采用Logistic方程作為研究重組大腸桿菌M3的菌體生長動力學模型。

Logistic方程：

式中：X為菌體濃度，mg/L；Xm為最大菌體濃度，mg/L；μm為菌體最大比生長速率，h-1；t為時間，h。

將式（1）積分為代數方程：

式中：X為菌體濃度，mg/L；X0為初始菌體濃度，mg/L；Xm為最大菌體濃度，mg/L；μm為菌體最大比生長速率，h-1；t為時間，h。

參照公式（2），使用Origin 8.0繪圖軟件對菌體生長實驗數據進行非線性擬合，結果如圖2所示。

圖2 菌體生長的試驗值與模型計算值的比較Fig.2 Comparison of experimental data with calculated data on cell growth

菌體濕質量（X）隨發酵時間變化的函數為：

式中：X為菌體濃度，mg/L；μm=0.224 42，X0=7.604 27mg/L，Xm=41.751 49mg/L；t為發酵時間，h。

由圖2可知，實驗數據與公式（3）的計算值基本吻合，R2=0.995 5，結果表明實驗值與動力學模型基本相符，因而大腸桿菌產青霉素酰化酶優化調控可參考依據該動力學模型。

2.2.2 青霉素酰化酶合成動力學模型

由于微生物在發酵的動態過程中細胞內的生物具有十分復雜的合成途徑，且其代謝調節機制又特點各異，于是依據產物生成速率與細胞生長速率之間的關系，將產物的形成與微生物細胞生長關系的動力學模型分為3類：Ⅰ生長偶聯型；Ⅱ部分生長偶聯型或稱混合型；Ⅲ非生長偶聯型[15，18]，常用Luedeking-Piret方程[19-20]描述產物形成與細胞生長的關系如下：

式中：X為菌體濃度，mg/L；P為青霉素酰化酶酶活，U/mL；

α為生長偶聯系數；β為非生偶聯聯系數。

α≠0、β=0表示第Ⅰ類發酵；α≠0、β≠0表示第Ⅱ類發酵；α＝0、β≠0表示第Ⅲ類發酵。從大腸桿菌產青霉素酰化酶分批發酵試驗結果可以推斷該菌體的發酵過程屬于第Ⅱ類，即產物形成與細胞生長呈部分偶聯型。聯合公式（2）、（4），Luedeking-Piret方程可積分為代數方程：

式中：X為菌體濃度，mg/L；X0為初始菌體濃度，mg/L；Xm為最大菌體濃度，mg/L；μm為菌體最大比生長速率，h-1；t為時間，h。P為青霉素酰化酶酶活，U/mL；P0為初始青霉素酰化酶酶活，U/mL；α為生長偶聯系數；β為非生偶聯聯系數。

由于P0=0，X0對產物的影響可以忽略不計，式（5）可簡化為：

式中：μm為菌體最大比生長速率，h-1；X0為初始菌體濃度，mg/L；Xm為最大菌體濃度，mg/L；t為時間，h。P為青霉素酰化酶酶活，U/mL；P0為初始青霉素酰化酶酶活，U/mL；α為生長偶聯系數；β為非生偶聯系數。

參照公式（6），采用Origin 8.0繪圖軟件對大腸桿菌產青霉素酰化酶發酵實驗數據進行非線性擬合，結果如圖3所示，得到青霉素酰化酶合成量（P）隨發酵時間變化的函數：

式中：P為青霉素酰化酶酶活，U/mL；t為時間，h。

其中α=-0.22052，β=0.05306，青霉素酰化酶活的實驗值與模型計算值的比較見圖3。由圖3觀察得出公式（7）較好的擬合了所得的實驗數據，R2=0.993 0，也驗證了該方程很好的描述出發酵過程中青霉素酰化酶的合成情況，但受到發酵液中蛋白酶以及其他限制性因素的影響，青霉素酰化酶酶活力在合成后期的增長受到了抑制。若及時補充底物，則可促進酶的繼續合成，工業生產上可參考這一規律。

圖3 青霉素酰化酶活的試驗值與模型計算值的比較Fig.3 Comparison of experimental data with calculated data on penicillin acylase activity

2.2.3 基質消耗動力學模型

大腸桿菌產青霉素酰化酶發酵過程中，甘油的消耗一方面用于菌體生長，同時又用于其菌體細胞的維持和產物的合成及代謝，因此基質消耗速度可以由與Luedeking-Piret相似的方程表示：

式中：S為甘油濃度，g/L；X為菌體濃度，mg/L；t為時間，h；YX/S為碳源用于菌體生長得率常數；γ為碳源用于產物積累得率常數。

結合方程式（2）、式（8）積分可得：

式中：S為甘油濃度，g/L；S0為初始甘油濃度，g/L；X為菌體濃度，mg/L；X0為初始菌體濃度，mg/L；Xm為最大菌體濃度，mg/L；μm為菌體最大比生長速率，h-1；t為時間，h；YX/S為碳源用于菌體生長得率常數，λ=1/YX/S；γ為碳源用于產物積累得率常數。

按照公式（9）對發酵過程中甘油消耗的實驗值進行非線性擬合，結果如圖4所示，得到基質消耗量隨發酵時間變化的方程：

式中：S為甘油濃度，g/L；t為時間，h。

其中S0=21.085 37g/L，λ=0.449 28，λ=-0.004 67，由圖4可以看出，式（10）能夠很好的擬合了所得的實驗數據，R2= 0.997 1，證明該模型能夠很好的描述青霉素酰化酶合成過程中基質消耗情況。

圖4 基質消耗的動力學模型與實驗數據的比較Fig.4 Comparison of kinetic model data with experimental data on substrate consumption

3 結論

根據重組大腸桿菌M3發酵產青霉素酰化酶過程中各個參數的變化，采用Logistic方程和Luedeking-piret方程模擬出發酵的動態過程，建立了重組大腸桿菌M3產青霉素酰化酶的發酵動力學方程，分別為：

（1）菌體生長動力學模型

（2）青霉素酰化酶合成動力學模型

（3）基質消耗動力學模型

經過3個實驗值與模型值的比對，發現所建立的動力學模型很好的擬合了實驗數據，得出該菌株發酵動力學中菌體生長、青霉素酰化酶合成以及基質消耗的相關系數分別為：0.995 5、0.993 0、0.997 1。綜上所述，3個模型的建立可以解釋重組大腸桿菌M3產青霉素酰化酶的發酵動力學規律，為工業生產提供了可行的參考依據。

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Fermentation kinetics of penicillin acylase produced by recombinantEscherichia coli

WEI Xiaoju,LI Jilie*,ZHU Xiaoyuan
(Ministry of Education Economic Forest Cultivation and Conservation of Education Ministry Key Laboratory,College of Life Science and Technology,Central South University of Forestry and Technology,Changsha 410004,China)

The fermentation kinetics for penicillin acylase production by the recombinantEscherichia coliM3 was studied in this paper.Based on the Logistic and Luedeking-Piret equation,the kinetic models of recombinantE.coliM3 about microorganism growth,penicillin acylase formation,substrate consumption and model parameter were proposed.The result showed that the fermentation process of penicillin acylase produced by recombinantE.coliM3 could be well expressed by the model.

penicillin acylase;batch fermentation;fermentation kinetics model

TQ920.1

A

0254-5071（2014）03-0032-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.009

2014-01-25

國家林業局“948”項目（NO.2011-4-17）

韋曉菊（1987-），女，碩士研究生，研究方向微生物工程。

*通訊作者：黎繼烈（1959-），女，教授，博士，研究方向農產品生物加工。

分批發酵過程中菌體生長、青霉素酰化酶合成、基質消耗的動力學模型及模型參數。結果表明，重組大腸桿菌M3產青霉素酰化酶的發酵動態過程能很好的被該模型所表達。