內生黑曲霉產脂肪酶條件研究及其粗酶酶學特性

何茹，劉婭*，謝曉霞，王陳強

（1.石河子大學食品學院，新疆石河子832000；2.新疆冠農果茸集團股份有限公司技術中心，新疆庫爾勒841000）

內生黑曲霉產脂肪酶條件研究及其粗酶酶學特性

何茹1，劉婭1*，謝曉霞2，王陳強2

（1.石河子大學食品學院，新疆石河子832000；2.新疆冠農果茸集團股份有限公司技術中心，新疆庫爾勒841000）

針對新疆釀酒葡萄中獲得的1株產脂肪酶的內生黑曲霉菌株C2J6，研究了該菌株的產酶條件及酶學特性。結果表明，該菌適宜的產酶條件為1%的乳糖為碳源，1%的蛋白胨為氮源，培養基初始pH值為8.0，培養溫度35℃，培養時間約72h，此時所產脂肪酶的活力可達18.75U/mL。該菌所產脂肪酶粗酶液的最適反應溫度為40℃，最適反應pH值為7.0，為中溫中性酶；在50℃保溫1h酶活力保留54.55%，具有良好的熱穩定性；在pH值3.0～7.0范圍內較穩定，有一定的耐酸性。金屬離子Mn2+對酶活力有促進作用，Zn2+、Fe2+、Cu2+對酶活力有抑制作用，K+、Ca2+、Na+、Mg2+對酶活力影響不大。該酶在以葵花油和谷物調和油為底物時，酶活分別為228%和180%，明顯高于橄欖油和油煙機廢油。

內生黑曲霉；脂肪酶；產酶條件；酶學特性

脂肪酶（EC3.1.1.3）又稱三酰基甘油酰基水解酶，可將甘油三酯分解成脂肪酸和甘油或進行其逆反應，在油-水界面及非水介質中催化酯的水解和合成，酯交換，催化生物表面活性劑、高聚合物、多肽和手性藥物的有機合成反應等[1]。目前，脂肪酶已廣泛應用于食品、香料、醫藥、化妝品、洗滌劑、皮革、藥物合成、有機合成等領域[2-4]。微生物脂肪酶因其具有較動植物脂肪酶更好的穩定性、選擇性、底物特異性、更廣的作用pH值和溫度范圍，且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，便于工業化大生產和獲得高純度樣品，因此成為工業脂肪酶的最重要來源。由于植物內生環境這個微生態體系的特殊性，其中的微生物脂肪酶也可能表現出與眾不同的特性。已有研究表明，植物內生菌脂肪酶不僅具有普通脂肪酶的一些性質，而且有一些特殊的性質（如耐熱、耐有機溶劑、耐堿等），是挖掘和分離新型工業用脂肪酶的潛在理想源泉[5]。新疆地處祖國西部邊陲，多樣化的氣候和環境條件勢必造成新疆葡萄內生菌資源的特異性和多樣性[6]。本研究針對從新疆釀酒葡萄內生菌中篩選獲得的一株產脂肪酶的高活力菌株——黑曲霉（Aspergillus niger）C2J6，了解其產脂肪酶條件，并對其粗酶學特性進行研究[7-14]，從而為該菌的開發利用奠定扎實理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）C2J6：新疆釀酒葡萄內生菌，石河子大學食品學院分離獲得。

1.1.2 主要試劑

蛋白胨：北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖：天津市致遠化學試劑有限公司；橄欖油：上海嘉里食品工業有限公司；乳糖、KH2PO4、NaOH、酚酞、（NH4）2SO4、NH4Cl、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、KCl、FeSO3·7H2O、聚乙烯醇、95%vol乙醇等均為分析純：天津市北辰方正試劑廠。

1.1.3 培養基

斜面培養基采用固體馬鈴薯培養基：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂15～20g，水（加至）1 000mL，pH自然，121℃滅菌20min，。

液體種子培養基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，定容至1L，pH值7.0，121℃滅菌20min。

發酵培養基：橄欖油乳化液10g，NaCl10g，NH4Cl0.5g，KH2PO40.5g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl20.1g，KCl 0.1g，FeSO4·7H2O 0.01g，定容至1L，pH自然，121℃滅菌20min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D型超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；FA1004型電子天平：上海精科天平儀器廠；LXJ-IIB型低速大容量多管離心機：上海安亭科學儀器廠；JJ-2型組織搗碎儀：江蘇省金市榮華儀器廠；HHS-216型恒溫水浴槽：常州國華電器有限公司；722可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；ZHWY-111B型恒溫培養振蕩器、ZXSD-1160型培養箱：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養方法

（1）斜面培養：采用固體馬鈴薯培養基，滅菌后將保藏的C2J6菌株接種在斜面上，在30℃恒溫培養箱中培養72h。

（2）種子培養：250mL的三角瓶裝50mL液體種子培養基，用接種環從斜面培養基上取1環菌，接種在液體種子培養基中（菌懸液中約107個孢子/mL），30℃、150r/min搖床振蕩培養48h。

（3）產酶培養：250mL的三角瓶裝50mL發酵培養基，接種種子液，接種量2%，30℃、150r/min搖床振蕩培養72h。

1.3.2 產酶條件研究

采用液體搖瓶培養，主要研究培養時間、碳源、氮源、誘導物、培養溫度等條件對黑曲霉產脂肪酶酶活的影響。

1.3.3 粗酶液的制備

產酶培養后的發酵液在5 000r/min條件下離心10min，取上清液，即為粗酶液。

1.3.4 脂肪酶活力測定

采用施巧琴[15]的脂肪酶活力測定方法進行檢測。脂肪酶活力計算公式如下：

式中：V為滴定樣液消耗的NaOH體積，mL；V0為滴定空白樣消耗的NaOH體積，mL；t為反應時間，min；n為酶液體積，mL；M為滴定用的NaOH溶液的濃度，mol/mL。

相對酶活是指所測得的酶活力值與橄欖油乳化液作為底物時酶液不經過處理的酶活力值的百分比。

1.3.5 菌絲體干質量的檢測

將黑曲霉C2J6進行發酵搖瓶培養，每隔12h從三角瓶中取樣，用干燥至質量恒定的定量濾紙過濾獲得菌絲體，將菌絲體置于105℃烘箱中干燥脫水至質量恒定，測定菌絲體干質量。

1.3.6 脂肪酶酶學特性研究

對以最佳產酶條件所產脂肪酶的粗酶液進行主要酶學特性研究，包括最適pH、pH穩定性、最適溫度、熱穩定性、金屬離子以及底物等對脂肪酶活力的影響。

2 結果與分析

2.1 產酶條件研究

不同菌株產生的脂肪酶具有不同的酶學特性和用途，為研究C2J6菌株產脂肪酶的酶學性質，首先對其產酶條件進行初步探究。

2.1.1 菌株生長曲線的測定

將黑曲霉C2J6進行發酵產酶培養，每隔12h取樣，測定菌絲體干質量及不同培養時間下的脂肪酶活，結果見圖1。由圖1可知，24～48h菌體生長緩慢，酶活較低；培養72h時酶活力最高，此時菌株處于對數生長期；90h之后菌體生長延遲，酶活迅速降低。

圖1 C2J6的生長曲線與酶活變化Fig.1 Growth curve and enzyme activity of stain C2J6

2.1.2 碳源對產酶的影響

碳源是微生物生長的重要營養素，是給菌體提供生命活動所需要的能量以及構成菌體的細胞和代謝產物的物質基礎。以發酵培養基為基礎，分別以1%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、糊精、可溶性淀粉作為碳源，進行發酵培養，所產脂肪酶活性見圖2。由圖2可知，乳糖更有利于產酶，酶活力為6.50U/mL。

圖2 碳源對產酶的影響Fig.2 Effect of carbon source on lipase production

2.1.3 氮源對產酶的影響

氮源是構成菌體的重要物質，對菌體所產酶的酶活有重大影響。以發酵培養基為基礎，1%乳糖為碳源，分別以1%的牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、黃豆粉、尿素、（NH4）2SO4、NaNO3、NH4Cl作為氮源，進行發酵培養，所產脂肪酶活性見圖3。由圖3可知，有機氮源比無機氮源更有利于菌株產酶，蛋白胨為氮源時，脂肪酶活力最高，酶活力為17.25U/mL。

圖3 氮源對產酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on lipase production

2.1.4 初始pH值對產酶的影響

以1%乳糖為碳源、1%蛋白胨為氮源的發酵培養基為基礎，設定不同的pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），進行發酵培養，所產脂肪酶活性見圖4，可知當pH為8.0時菌株產酶最高，酶活力可達18.25U/mL，且pH在7.5～8.5的范圍內適宜產酶。

2.1.5 發酵溫度對產酶的影響

培養溫度不僅影響菌體的生長，而且影響微生物體內酶的合成。以1%乳糖為碳源、1%蛋白胨為氮源、初始pH值為8.0的發酵培養基為基礎，設定不同的發酵溫度（25℃、30℃、35℃、40℃、45℃），進行發酵培養，所產脂肪酶活性見圖5。由圖5可知，發酵溫度對該菌產酶有較大影響，發酵培養30～40℃時產酶活性比較高，低溫或高溫發酵時酶活顯著降低，因此確定最佳搖瓶發酵溫度為35℃，酶活力可達18.75U/mL。

圖4 初始pH值對產酶的影響Fig.4 Effect of initial pH on lipase production

圖5 發酵溫度對產酶的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on lipase production

2.2 酶學特性研究

2.2.1 酶反應最適溫度

為了測定酶反應的最適溫度，將反應溫度設置為10個梯度：4℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃。在反應組里加入1mL酶液，分別置于10種溫度條件下進行水解反應15min，測定酶活。由圖6可知，酶反應的最適溫度為40℃，且在20～50℃條件下仍有較高的活力。

圖6 溫度對脂肪酶活的影響Fig.6 Effect of temperature on lipase activity

2.2.2 酶的熱穩定性

將恒溫水浴溫度設置為6個梯度：4℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃。取5mL酶液分別置于不同溫度的恒溫水浴鍋中保溫1h，測定脂肪酶的酶活力。由圖7可知，該酶具有較好的熱穩定性，在20～40℃的條件下，保溫1h，其相對酶活力仍保持在60%以上；溫度高于50℃時，酶活性迅速下降；在60℃時，相對酶活力下降至不足5%。

圖7 溫度對脂肪酶穩定性的影響Fig.7 Effect of temperature on lipase stability

2.2.3 酶反應的最適pH值

分別將不同pH值（2.0～8.0）的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液與底物充分混和，加入1mL酶液在最適溫度40℃條件下反應15min，測定酶活力。由圖8可知，該酶在pH值7.0時的酶活力最高，可知該酶為中性脂肪酶。

圖8 pH對脂肪酶活的影響Fig.8 Effect of pH on lipase activity

2.2.4 酶的pH穩定性

將酶液與不同pH值（2.0～9.0）的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液等體積混合，然后于室溫條件下放置1h，在40℃、pH值7.0的條件下反應15min，測定酶活力。由圖9可知，在pH值5.0～7.0的范圍內，相對酶活力仍保持在70%以上，酶活性較為穩定。

2.2.5 金屬離子對酶活力的影響

在酶液中加入金屬鹽類，分別使待測金屬離子K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+的濃度為5mmol/L，以未加金屬離子的酶液作為對照，然后于室溫放置1h，以對照組酶活力為100%，再測定其酶活力。由圖10可知，金屬離子Mn2+對酶活力有促進作用，Zn2+、Fe2+、Cu2+對酶活力有抑制作用，K+、Ca2+、Na+、Mg2+對酶活力影響不大。

圖9 pH對脂肪酶穩定性的影響Fig.9 Effect of pH on lipase stability

圖10 不同金屬離子對脂肪酶活力的影響Fig.10 Effect of metal ions on lipase activity

2.2.6 底物對酶活力的影響

用葵花油、谷物調和油、油煙機廢油的乳化液作為酶液的反應底物，以橄欖油乳化液為底物的反應作為對照，以對照組酶活力為100%，再測定其酶活力。由圖11可知，該酶在以葵花油和谷物調和油為底物時，相對酶活分別為228%和180%，明顯高于橄欖油和油煙機廢油。

圖11 不同底物對脂肪酶活力的影響Fig.11 Effect of substrates on lipase activity

3 結論

通過產酶條件的初步探究得出黑曲霉C2J6產脂肪酶的適宜培養條件為：在含有50mL培養基的250mL三角瓶中，以1%的乳糖為碳源，1%的蛋白胨為氮源，初始pH為8.0，在35℃培養72h，此時脂肪酶活力可達18.75U/mL。

粗酶酶學特性研究表明，黑曲霉C2J6所產脂肪酶的最適作用溫度為40℃，最適作用pH為7.0，為中溫中性酶。該酶在溫度20～40℃，pH為5.0～7.0的范圍內表現穩定。此外，Mn2+以及葵花油乳化液對酶活力有一定的促進作用。

[1]張曉鷗，周健，劉巧瑜，等.有機相脂肪酶催化合成技術在食品及相關領域的應用[J].食品生物技術學報，2006，25（1）：120-126.

[2]JAEGER K E,EGGERT T.Lipases for biotechnology[J].Curr Opin Biotech,2002,13(4):390-397.

[3]喬紅群，徐虹，付閃雷，等.脂肪酶產生菌的篩選及其酶性質[J].南京化工大學學報，1998，20（1）：1-3.

[4]SHARMA A K,TIWARI R P,HOONDAL G S.Properties of a thermostable and solvent stable extracellular lipase from a Pseudomonas sp. AG-8[J].J Basic Microb,2001,41:363-366.

[5]TREICHEL H,DE OLIVEIRA D,MAZUTTI M A,et al.A review on microbial lipasesproduction[J].Food Bioprocess Tech,2010,3(2):182-196.

[6]時永杰，祁付云，安婷，等.釀酒葡萄中內生霉菌的分離與初步鑒定[J].食品工業科技，2013（3）：185-191.

[7]張衛國.一株毛霉菌產脂肪酶特性及發酵條件研究酶活測定[J].中國釀造，2011，30（7）：134-137.

[8]李治林，李迅，王麗麗，等.米根霉產脂肪酶的條件及酶學性質[J].南京林業大學學報：自然科學版，2009，33（6）：103-107.

[9]陳貴元，季秀玲，林連兵，等.低溫脂肪酶產生菌篩選與鑒定、產酶條件及酶學性質研究[J].云南大學學報：自然科學版，2010，32（1）：108-113.

[10]李俊峰，李紅芳，段效輝，等.耐有機溶劑脂肪酶產生菌的篩選及其粗酶酶學性質[J].食品科學，2012，33（3）：116-120.

[11]趙春雷，閆麗娟，謝振榮，等.一株耐熱脂肪酶產生菌的篩選及酶學性質研究[J].生物技術通報，2010（2）：184-188.

[12]周晶.一株脂肪酶產生菌的篩選鑒定、發酵條件優化及其酶學性質研究[D].杭州：中國計量學院碩士論文，2012.

[13]李楠.耐冷假單胞菌Pseudomonassp.G6產脂肪酶條件優化及其酶學性質研究[D].哈爾濱：黑龍江大學碩士論文，2012.

[14]袁靜.耐有機溶劑脂肪酶產生菌篩選及粗酶性質研究[D].南京：南京工業大學碩士論文，2008.

[15]施巧琴.堿性脂肪酶的研究[J].微生物學通報，1998，8（3）：108-110.

Conditions of lipase production by endophyticAspergillus nigerand enzymatic properties of the crude enzyme

HE Ru1,LIU Ya1*,XIE Xiaoxia2,WANG Chenqiang2
(1.College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832000,China; 2.Technology Center,Xinjiang Guannong Fruit&Antler Group Co.,Ltd.,Korla 841000,China)

A lipase-producing strainAspergillus nigerC2J6 was screened from Xinjiang wine grape.The conditions for enzyme production and enzymatic properties of C2J6 were studied.The results showed that the suitable conditions for enzyme production were as follows:lactose 1%as carbon source,peptone 1%as nitrogen source,initial pH 8.0,culture temperature 35℃,incubation time 72 h.Under the optimal condition,the lipase activity reached 18.75 U/ml.The enzyme was medium temperature amylase,and the optimal reaction temperature,pH of crude enzyme produced by the strain was 40℃and 7.0,respectively.It had good thermal stability,54.55%of the enzyme activity could be reserved after being kept at 50℃for 1 h. Its activity was stable between pH 3.0-7.0,and it had some acid-resisting features.Mn2+could boost up enzyme activity,whereas Zn2+,Fe2+,Cu2+would restrain its activity,and K+,Ca2+,Na+,Mg2+have little effect on its activity.When the enzyme was in sunflower oil and grain as substrate,the enzyme activity was 228%and 180%,respectively,which was significantly higher than the olive oil and smoke lampblack machine oil.

endogenousAspergillus niger;lipase;enzyme producing condition;lipase properties

TQ925

A

0254-5071（2014）03-0052-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.014

2014-01-19

新疆石河子大學高層次人才啟動項目（RCZX20109）

何茹（1987-），女，碩士研究生，研究方向為果蔬加工。

*通訊作者：劉婭（1974-），女，副教授，博士，研究方向為農產品貯藏與加工。