黃柄曲霉ASD菌株抑菌譜測定及抑菌物質初探

謝小平 劉長遠 趙奎華 王 輝 關天舒 梁春浩 賈 姝 張 里

（1 沈陽農業大學植物保護學院，遼寧沈陽110866；2 遼寧省農業科學院植物保護研究所，遼寧沈陽110161）

辣椒疫病（Phytophthora capsiciLeonian）是北方設施辣椒生產上的重要土傳病害，在防治上主要以化學防治為主，因化學防治存在農藥殘留問題，因此，生物菌劑研究已逐漸成為防治辣椒疫病的熱點。黃柄曲霉（Aspergillus flavipes）屬于曲霉屬，研究發現黃柄曲霉對植物病害真菌有較好的抑制作用。李淑彬等（2001）從大亞灣海底沉積物中分離出1株具有廣譜抗真菌作用的黃柄曲霉，對辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）、新月彎孢霉（Curvularia lunata）、棉炭疽菌（Colletotrichum gossypii）等多種植物病原真菌有強烈抑制作用。王輝等（2012）研究表明黃柄曲霉ASD菌株對辣椒疫病有較好的防治效果，其防效優于化學藥劑代森錳鋅和烯酰嗎啉，但對抑菌物質種類和結構未作深入研究。本試驗以黃柄曲霉ASD菌株為研究對象，主要開展了抑菌譜測定和抑菌物質的提取，以期為該菌株生防菌劑研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 黃柄曲霉ASD菌株，由遼寧省農業科學院植物保護研究所園藝作物病害研究室提供。

1.1.2 供試病原菌 辣椒疫病菌、番茄晚疫病菌（Phytophthora infestans）、黃瓜蔓枯病菌（Mycosphaerella melonis）、甜瓜蔓枯病菌（Didymella bryoniae）、黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）、葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinereaPers.）、梨輪紋病菌（Physalospora piricolaNose）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、茄子根腐病菌（Fusarium solani），均由遼寧省農業科學院植物保護研究所園藝作物病害研究室提供。

1.1.3 供試培養基 PDA 培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉12 g，蒸餾水1 000 mL。

PD 培養液：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 ASD菌株抑菌譜的測定 采用對峙培養法（Getha & Vikineswary，2002），在直徑為9 cm 的PDA 平板上相距2.5 cm 的位置放置直徑為0.6 cm的ASD菌餅及供試病原菌菌餅，于25℃培養4 d，測量抑菌帶寬度。

1.2.2 ASD菌株的發酵培養 ASD菌株在PDA 平板上27℃培養5 d后，取菌體接種于裝有100 mL PD 培養液的250 mL 三角瓶中，27℃、150 r·min-1搖床振蕩培養5d（王輝，2012）。

1.2.3 ASD菌株發酵液的制備 發酵培養后的發酵原液，12 000 r·min-1離心30 min，取上清液用微孔濾膜去除菌體，即為ASD菌株的發酵液（Ji et al.，2007），采用牛津杯法檢測其抑菌活性。

1.2.4 硫酸銨分段鹽析條件確定 取發酵液用不同飽和度的硫酸銨（10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%）分級沉淀，4℃靜止過夜后，12 000 r·min-1離心30 min 棄上清液，分別收集每一個飽和度的沉淀物（陳雪麗 等，2006）。沉淀物用少量體積的0.01 mol·L-1磷酸緩沖液（PBS）（pH 7.2）溶解，裝入透析袋中，用雙蒸水透析去鹽并用聚乙二醇6000 包埋濃縮后即得到抑菌物質粗提物。

1.2.5 抑菌活性的測定 采用含毒介質法（全鑫 等，2010；唐琳和趙輝，2011）檢測抑菌物質粗提物的抑菌活性。將抑菌物質粗提物與PDA 培養基按照1∶10的比例混合倒平板，以PDA 培養基作為對照，在平板的中心放置1個辣椒疫病菌菌餅，3次重復，置于27℃恒溫培養箱培養5 d，觀察辣椒疫病菌的生長情況。

1.2.6 蛋白酶對抑菌物質抑菌活性的影響 取50%硫酸銨飽和度提取的抑菌物質粗提物與按1∶1∶1的比例混合的胰蛋白酶、蛋白酶 K 和蛋白酶E 發生反應，蛋白酶濃度為1 mg·mL-1，在恒溫 37℃下反應 1 h（高小寧，2012）。采用含毒介質法檢測經酶解后抑菌物質粗提物的抑菌活性，以辣椒疫病菌為指示菌，每處理3次重復。

2 結果與分析

2.1 黃柄曲霉ASD菌株抑菌譜測定

由表1可知，黃柄曲霉ASD菌株對辣椒疫病菌、番茄晚疫病菌、甜瓜蔓枯病菌、黃瓜蔓枯病菌、黃瓜炭疽病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄灰霉病菌、梨輪紋病菌、小麥赤霉病菌、茄子根腐病菌均有抑制作用，抑菌譜較廣，其抑菌帶的寬度為2.9～11.8 mm，其中對辣椒疫病菌、番茄晚疫病菌有較強的抑制作用（圖1）。

表1 黃柄曲霉ASD菌株的抑菌譜及抑菌帶寬度

圖1 黃柄曲霉ASD菌株對辣椒疫病菌和番茄晚疫病菌的抑制效果

2.2 黃柄曲霉ASD菌株發酵液的抑菌活性檢測

從平板抑菌活性試驗可以看出，黃柄曲霉ASD菌株的發酵液對辣椒疫病菌有很強的抑菌活性，ASD菌株200 μL 發酵液對辣椒疫病菌的抑菌帶寬度為7.4 mm（圖2）。

圖2 黃柄曲霉ASD菌株發酵液對辣椒疫病菌的抑菌活性

2.3 黃柄曲霉ASD菌株抑菌物質粗提物對辣椒疫病菌的抑制作用

試驗結果顯示（表2），經10%～90%飽和硫酸銨沉淀后的抑菌物質粗提物對辣椒疫病菌均有抑制活性，其中經50%飽和硫酸銨沉淀后的抑菌物質對辣椒疫病菌的抑制活性最強（圖3），抑制效果達到80.78%。由此說明，經50%飽和硫酸銨沉淀的物質是具有抑菌效果的抑菌物質。

表2 經不同飽和度硫酸銨沉淀后的ASD菌株抑菌物質粗提物對辣椒疫病菌的抑制作用

圖3 經50%硫酸銨飽和度沉淀的抑菌物質對辣椒疫病菌的抑菌效果

2.4 黃柄曲霉ASD菌株抑菌物質粗提物經酶解后對辣椒疫病的抑制作用

抑菌活性檢測結果表明，50%硫酸銨飽和度沉淀的抑菌物質粗提物經胰蛋白酶、蛋白酶 K 和蛋白酶 E處理后，對辣椒疫病菌幾乎無抑制作用，由此說明，經50%硫酸銨飽和度沉淀提取的抑菌物質為蛋白類物質。

3 結論與討論

黃柄曲霉ASD菌株是從土壤中分離得到的，該菌對辣椒疫病具有較好的防治效果。本試驗結果表明黃柄曲霉ASD菌株對多種植物病原真菌有不同程度的抑制作用，特別對辣椒疫病菌、番茄晚疫病菌有較強的抑制作用，采用硫酸銨分級沉淀的方法可得到黃柄曲霉ASD菌株的抑菌物質粗提物，50%硫酸銨飽和度沉淀出的抑菌物質粗提物對辣椒疫病菌的抑制活性最強，抑菌效果達到80.78%，并確定其為蛋白類物質。

黃柄曲霉是一種分布廣泛的土壤真菌，在防治植物病害方面報道較少。該菌在代謝過程中能夠產生細胞壁水解酶，抑制一些病原真菌生長（郭雷 等，2013）。蔣亭等（2002）從黃柄曲霉中分離得到7種化合物，大部分有抑菌活性；李淑彬等（2001）從海底沉積物中分離得到的黃柄曲霉可產生一種廣譜抗真菌抗生素179M。本試驗通過對ASD菌株抑菌物質的初步研究，明確了其具有潛在的植物病害生物防治價值。

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