煙草及煙草制品中霉菌數(shù)量檢驗用培養(yǎng)基的開發(fā)與應用

林華清，曾令杰，王嘉樂，沙云菲，戚大偉，吳達

上海煙草集團有限責任公司，上海市楊浦區(qū)長陽路717號 200082

煙草及煙草制品中霉菌數(shù)量檢驗用培養(yǎng)基的開發(fā)與應用

林華清，曾令杰，王嘉樂，沙云菲，戚大偉，吳達*

上海煙草集團有限責任公司，上海市楊浦區(qū)長陽路717號 200082

為開發(fā)適用于煙草及煙草制品中霉菌數(shù)量檢驗用的培養(yǎng)基，以煙草及煙草制品中8種常見的污染霉菌（黃曲霉、黑曲霉、局限曲霉、桔青霉、產(chǎn)黃青霉、總狀毛霉、匍枝根霉和綠色木霉）為試驗菌種，采用5種常見的霉菌培養(yǎng)基（孟加拉紅瓊脂、察氏瓊脂、高鹽察氏瓊脂、含20%蔗糖的高滲察氏瓊脂和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）及4種研發(fā)的新型培養(yǎng)基進行煙草及煙草制品中霉菌數(shù)量檢驗用培養(yǎng)基的初篩和復篩研究。結果表明：與其他培養(yǎng)基相比，Ⅰ號改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，NaCl 30.0 g，瓊脂16.0 g，氯霉素0.1 g和蒸餾水1000 mL）具有檢驗霉菌菌相全面、獲得霉菌數(shù)量結果準確等優(yōu)點，適用于煙草及煙草制品中霉菌數(shù)量的檢測。

煙草；煙草制品；霉菌數(shù)量檢驗；培養(yǎng)基

煙草及煙草制品中含有霉菌生長所需的各種營養(yǎng)物，一旦溫度、濕度等環(huán)境條件適宜，各種霉菌極易滋生，進而導致煙草及煙草制品發(fā)霉變質，直接影響煙草及其制品的外觀和香味品質，降低其使用價值，給煙草業(yè)帶來重大損失［1］。近年來，關于煙草霉變方面的研究較多，如霉變機制［2］、儲藏條件對煙草霉變的影響［3］、優(yōu)勢霉菌的分離鑒定和防霉劑篩選［4］等。為及時了解煙草及其制品中的霉菌數(shù)量，減少霉變造成的損失，建立合適的霉菌檢測方法是非常必要的。盡管食品行業(yè)等檢驗霉菌的方法與培養(yǎng)基較為成熟，對建立煙草行業(yè)霉菌檢驗方法有一定的參考價值，研究人員也主要是參考廣泛應用于食品、化妝品和土壤等樣品中霉菌數(shù)量檢驗用的培養(yǎng)基，如孟加拉紅瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、察氏瓊脂和含20%蔗糖的高滲察氏瓊脂培養(yǎng)基等對煙草及其制品中的霉菌數(shù)量進行分析［5-9］，但由于不同類型的煙草樣品中霉菌的種類存有差異，且各種霉菌對培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的需求也不同，分析結果的準確性難以保證，相關研究有待進一步深入。因此，針對煙草及煙草制品中8種常見霉菌（黃曲霉、黑曲霉、局限曲霉、桔青霉、產(chǎn)黃青霉、總狀毛霉、匍枝根霉和綠色木霉）的營養(yǎng)需求及生理特性，對霉菌數(shù)量檢驗用培養(yǎng)基進行了篩選，旨在研制適用于煙草及煙草制品中霉菌數(shù)量檢驗用的培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

8種菌種：黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（A. niger ATCC16404）、局限曲霉（A.restrictus CGMCC 3.3973）、桔青霉（Penicillium citrinum）、產(chǎn)黃青霉（P. chrysogenum）、總狀毛霉（Mucor racemosus CGMCC 3.206）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer CGMCC 3.2045）和綠色木霉（Trichoderma viride）。6種煙草及煙草制品，其中煙草樣品4種：香料煙A（表觀正常），香料煙B（人工霉變），烤煙A（自然霉變）和烤煙B（表觀正常）；市售成品卷煙2種：“紅雙喜（12 mg）”和“中南海（8 mg）”。

培養(yǎng)基：孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基［10］；察氏瓊脂培養(yǎng)基［8］；高鹽察氏瓊脂培養(yǎng)基［11］；含20%蔗糖的高滲察氏瓊脂培養(yǎng)基［8］；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基［10］；Ⅰ～Ⅳ號改良的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（以下簡稱Ⅰ～Ⅳ號改良培養(yǎng)基）。Ⅰ號改良培養(yǎng)基配方：馬鈴薯（市售，去皮切塊）200 g，葡萄糖20.0 g，NaCl 30.0 g，瓊脂16.0 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1000 mL。Ⅱ～Ⅳ改良培養(yǎng)基配方中除NaCl用量分別調整為40.0，50.0和60.0 g外，其余成分用量同Ⅰ號改良培養(yǎng)基。無菌蒸餾水（蒸餾水分裝后，121℃下滅菌20 min）。

葡萄糖（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；NaCl（AR，上海大合化學品有限公司）；10%氯霉素（上海盛思生化科技有限公司）；瓊脂［細菌培養(yǎng)級，凝膠強度(1.5%)≥1200 g/cm2；上海日出生物科技有限公司］。

BagMixer 400拍擊式均質器、Bagfilter均質袋（法國Interscience公司）；E100顯微鏡（日本Nikon公司）；SE402F型電子天平［感量：0.01 g，奧豪斯儀器(上海)有限公司］；PYX-DHS-50×65-BS-Ⅱ型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）。

1.2 方法

1.2.1 煙草及煙草制品中霉菌數(shù)量檢驗用培養(yǎng)基的初篩

以煙草及煙草制品中常見的8種污染霉菌為試驗菌［5-8,10］，并選擇5種常用的霉菌培養(yǎng)基作候選培養(yǎng)基［6-9,11-12］，采用霉菌三點接種法接種，經(jīng)28℃培養(yǎng)6～9 d后，觀察各試驗菌在5種培養(yǎng)基上的生長情況。

采用上述方法對設計的Ⅰ～Ⅳ號改良培養(yǎng)基進行初篩。

1.2.2 煙草及煙草制品中霉菌數(shù)量檢驗用培養(yǎng)基的復篩

選用總狀毛霉、產(chǎn)黃青霉和局限曲霉3種常見霉菌，分別制備孢子液，步驟如下：用適量無菌蒸餾水將霉菌斜面菌種的孢子洗至含無菌玻璃珠的三角瓶中，充分振搖；再加入適量無菌蒸餾水并充分振搖，用含無菌擦鏡紙的過濾器過濾；濾液采用菌落計數(shù)法進行活菌計數(shù)，根據(jù)實驗需要調節(jié)成一定濃度。

將上述制備的3種霉菌孢子液制成霉菌混合孢子液。采用平板菌落計數(shù)法［12］，結合各菌種的形態(tài)學特征［13-14］，觀察霉菌菌種混合孢子液樣品在Ⅰ號改良培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂和孟加拉紅瓊脂3種培養(yǎng)基上的生長情況，進行霉菌數(shù)量及菌相研究。

1.2.3 煙草及煙草制品中霉菌數(shù)量檢驗

煙草及煙草制品采樣時應避免微生物污染，采樣后應盡快檢驗，否則應將樣品保存于低溫干燥處。樣品處理分別為：①煙草樣品：在無菌環(huán)境條件下，將樣品剪成小塊，充分混合；②煙草制品（卷煙）樣品：去除卷煙濾嘴。稱取25 g樣品，置于含有225 mL無菌蒸餾水的均質袋中，封口后置于拍擊式均質器中處理3 min；每處理30 s，將均質袋換反方向繼續(xù)處理；均質速度檔位：2，均質力度：標準；用無菌吸管從均質袋一側將濾液取出。此液即為1∶10的稀釋液。采用平板菌落計數(shù)法［12］進行煙草及煙草制品的霉菌數(shù)量檢驗，方法同1.2.2節(jié)。

2 結果與討論

表1 8種試驗霉菌在5種常用霉菌培養(yǎng)基上的生長情況①

2.1 煙草及煙草制品中霉菌數(shù)量檢驗用培養(yǎng)基的初篩結果

2.1.18 種試驗霉菌在5種常用霉菌培養(yǎng)基上的生長情況

通過觀察8種試驗霉菌在5種常用霉菌培養(yǎng)基上的生長情況（表1）發(fā)現(xiàn)：局限曲霉不能在馬鈴薯葡萄糖瓊脂、孟加拉紅瓊脂和察氏瓊脂培養(yǎng)基上生長；匍枝根霉在察氏瓊脂和含20%蔗糖的高滲察氏瓊脂培養(yǎng)基上生長極弱；匍枝根霉和總狀毛霉在高鹽察氏瓊脂培養(yǎng)基上呈弱生長狀態(tài)。若檢驗樣品被匍枝根霉污染，由于該霉菌在上述培養(yǎng)基上生長較弱（在一定時間內僅形成很小的菌落），易被生長快的霉菌形成的菌落所掩蓋，因而會造成菌落漏檢的現(xiàn)象。由此可見，上述5種培養(yǎng)基不宜用于煙草及煙草制品中霉菌數(shù)量檢驗。

2.1.28 種試驗霉菌在4種改良培養(yǎng)基上的生長情況

依據(jù)上述研究，大多培養(yǎng)基雖能滿足煙草及煙草制品中一般霉菌的生理需求，但不能滿足某些嗜干性霉菌的生長需求；含20%蔗糖的高滲察氏瓊脂培養(yǎng)基雖能滿足煙草及煙草制品中某些嗜干性霉菌及大多數(shù)普通霉菌的生長，但對于匍枝根霉而言，由于不能利用該培養(yǎng)基中的NaNO3作為自身生長的N源營養(yǎng)物，因而生長較弱。對此，本研究根據(jù)煙草及煙草制品中常見污染霉菌的營養(yǎng)需求及生理特點，選用營養(yǎng)成分和滲透壓能滿足一般霉菌生長需求的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，并對其進行了改良，通過加入一定量的NaCl適當提高培養(yǎng)基的滲透壓，以達到既不影響煙草及煙草制品中普通霉菌生長，又能滿足嗜干性霉菌生長所需滲透壓的目的。8種試驗霉菌在Ⅰ～Ⅳ號改良培養(yǎng)基上生長情況的觀察結果（表2）表明，8種試驗霉菌在4種改良瓊脂培養(yǎng)基上均能生長，在Ⅰ號培養(yǎng)基上各菌種生長最佳，因此選擇Ⅰ號改良培養(yǎng)基進行下一步研究。菌落。2.2煙草及煙草制品中霉菌數(shù)量檢驗用培養(yǎng)基的復篩結果

表2 8種試驗霉菌在Ⅰ～Ⅳ號4種改良培養(yǎng)基上生長情況

通常，霉變的煙草及煙草制品中存在多種霉菌，由于不同霉菌種類間存在拮抗作用，且生長速度也差異較大，生長快的霉菌形成的菌落可掩蓋生長慢的霉菌

通過預試驗，選擇煙草及煙草制品中常見的3種霉菌（總狀毛霉、產(chǎn)黃青霉和局限曲霉）并制成菌種混合孢子液，采用平板菌落計數(shù)法（結合各菌種的形態(tài)學特征）對初篩結果中效果較好的Ⅰ號改良培養(yǎng)基進行霉菌菌種混合孢子液樣品中霉菌數(shù)量及菌相的研究，進一步考察Ⅰ號改良培養(yǎng)基的適用性，并選擇目前研究中廣泛選用的馬鈴薯葡萄糖瓊脂、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基作為參照，結果見表3和圖1。

由表3和圖1可知，馬鈴薯葡萄糖瓊脂和孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基中僅觀察到總狀毛霉和產(chǎn)黃青霉2種試驗霉菌生長，霉菌數(shù)量為3.5×104～4.2×104cfu/mL；而在Ⅰ號改良培養(yǎng)基中3種試驗霉菌均能生長，且霉菌數(shù)量高達6.0×104cfu/mL。這說明Ⅰ號改良培養(yǎng)基不僅適合一般霉菌的生長，也適合嗜干性霉菌局限曲霉的生長，是一種適用于煙草及煙草制品中霉菌數(shù)量檢驗用的培養(yǎng)基。

2.3 實際樣品的檢驗結果

表3 3種霉菌混合孢子液在3種霉菌培養(yǎng)基中的霉菌數(shù)量及菌相檢驗結果①

圖1 局限曲霉、產(chǎn)黃青霉和總狀毛霉菌種混合孢子液在3種培養(yǎng)基中的生長情況

為檢驗Ⅰ號改良培養(yǎng)基在煙草及煙草制品實際樣品霉菌數(shù)量檢測中的應用效果，選用6種煙草及煙草制品進行實驗研究，結果如表4所示。由表4可知：①對于香料煙樣品A和B，Ⅰ號改良培養(yǎng)基中霉菌數(shù)量的檢驗結果均高于孟加拉紅瓊脂和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。其中，表觀正常的香料煙A樣品在Ⅰ號改良培養(yǎng)基中的霉菌數(shù)量分別比孟加拉紅瓊脂和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中提高了38.5%和20.0%，而人工霉變的香料煙B樣品分別提高了69.4%和74.3%。②烤煙A（自然霉變）和烤煙B（表觀正常）樣品在3種培養(yǎng)基中的霉菌數(shù)量檢驗結果相近。③“紅雙喜（12 mg）”和“中南海（8 mg）”卷煙在3種培養(yǎng)基中的霉菌數(shù)量檢驗結果均小于10 cfu/g。

表4 霉變或正常煙草及煙草制品在3種霉菌培養(yǎng)基中霉菌數(shù)量的檢驗結果①（cfu/g）

由表4還可以看出，同一樣品在不同培養(yǎng)基中的霉菌數(shù)量存在一定差異，其主要原因可能與樣品中污染霉菌種類有關。霉變煙草及煙草制品中常見污染既有黃曲霉、黑曲霉、產(chǎn)黃青霉、桔青霉、總狀毛霉、匍枝根霉等一般霉菌，也有局限曲霉、阿姆斯特丹曲霉等嗜干性霉菌，因而當霉變樣品中有嗜干性霉菌污染時，Ⅰ號改良培養(yǎng)基顯示出不僅適合嗜干性霉菌生長，亦適合一般霉菌生長的優(yōu)勢。反之，當樣品中不存在嗜干性霉菌時，Ⅰ號改良培養(yǎng)基呈現(xiàn)出與其他2種培養(yǎng)基相同的檢驗效果。綜上所述，Ⅰ號改良培養(yǎng)基適合用于煙草及煙草制品中霉菌數(shù)量的檢驗。

3 結論

研發(fā)了既能滿足一般霉菌的生長，也能滿足部分嗜干性霉菌生長的改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。本培養(yǎng)基是一種適用于煙草及煙草制品中霉菌數(shù)量檢驗的理想培養(yǎng)基，具有檢驗霉菌菌相全面、霉菌數(shù)量結果準確等優(yōu)點，以此為基礎建立的霉菌數(shù)量檢測方法，能夠滿足煙草及煙草制品中霉菌檢測的需求。

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Development and Application of Medium for Tobacco Mold Counting Test

LIN Huaqing，ZENG Lingjie，WANG Jiale，SHA Yunfei，QI Dawei，and WU Da*
Shanghai Tobacco Group Co.，Ltd.，Shanghai 200082，China

In order to develop a medium suitable for testing the amount of mold，eight molds common in tobacco and tobacco products were chosen(including Aspergillus flavus，A.niger ATCC16404，A.restrictus CGMCC 3.3973，Penicillium citrinum，P.chrysogenum，Mucor racemosus CGMCC 3.206，Rhizopus stolonifer CGMCC 3.2045 and Trichoderma viride)，five common mold media(Rose Bengal agar，Czapek agar，High salt Czapek agar，hypertonic Czapek agar containing 20%sucrose，and Potato dextrose agar)and four pilot media were tested via primary and secondary screening.The results showed that comparing with other media，the improved medium，potato dextrose agar No.1(potato 200 g，glucose 20.0 g，NaCl 30.0 g，agar 16.0 g，chloramphenicol 0.1 g and distilled water 1000 mL)，was more suitable for tobacco mold counting test due to its coverage of microflora and accurate counting results.

Tobacco；Tobacco product；Mold counting；Medium

TS414

A

1002-0861（2014）11-0029-04

國家煙草專賣局標準項目“煙草及煙草制品霉變的判定”（2013QB020）。

林華清（1984—），女，碩士，工程師，主要從事煙草化學及質量安全研究工作。E-mail：linhq@sh.tobacco.com.cn；*

吳達E-mail：wud@sh.tobacco.com.cn

2014-05-30

責任編輯：洪廣峰E-mail：hgf@ztri.com.cn

電話：0371-67672660