分泌吲哚乙酸的蔞蒿內生耐鎘細菌的篩選與鑒定

周小梅，趙運林，胥正鋼，董萌，庫文珍

分泌吲哚乙酸的蔞蒿內生耐鎘細菌的篩選與鑒定

周小梅1，趙運林2*，胥正鋼3，董萌1，庫文珍1

1. 湖南城市學院建筑與城市規劃學院，湖南 益陽 413000；2. 中南林業科技大學，湖南 長沙 410004；3. 湖南農業大學生物安全科學技術學院，湖南 長沙 410128

從蔞蒿（Artemisia selengensis）體中分離分泌吲哚乙酸（IAA）的內生耐鎘（Cd）細菌將有助于構建有效的植物-微生物聯合修復體系。本研究以分泌IAA和Cd耐性為篩選指標，采用研磨法從蔞蒿的根、莖、葉中分離能產生IAA的內生耐Cd細菌，并對其鉛（Pb）、銅（Cu）、銻（Sb）的耐受性及對蔞蒿生長特性的影響進行研究，根據形態特性、生理生化測定和16S rDNA序列分析對目標菌株進行分類鑒定。結果表明，從蔞蒿體內分離獲得2株分泌IAA能力較強的內生耐Cd細菌J2和Y5，J2和Y5菌對Cd的耐受質量濃度均為90 mg·L-1，IAA的分泌量分別為23.108、15.192 mg·L-1；J2菌能明顯增加蔞蒿的株高、最長根長、平均根長、鮮質量和干質量，Y5菌可顯著提高蔞蒿的株高、鮮質量和干質量；J2和Y5菌對Pb的耐受質量濃度均為1200 mg·L-1，對Cu的耐受質量濃度分別為120和160 mg·L-1，對Sb的耐受質量濃度分別為50和150 mg·L-1；J2菌在LB平板上菌落為黃色、近圓形、粘稠，Y5菌在LB平板上菌落為白色、近圓形、濕潤；J2和Y5菌的16S rDNA序列經擴增，分別獲得1條大小約為1500 bp的條帶，經比對分別與GenBank中Pantoea agglomerans STY29（HQ220151）、Pseudomonas fluorescens V7c10（KC195905）的相似性最高，結合形態特征與生理生化特性可分別鑒定為成團泛菌（Pantoea agglomerans）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。研究表明，從蔞蒿體中分離獲得分泌IAA能力較強的內生耐Cd成團泛菌和熒光假單胞菌，為進一步研究其在蔞蒿修復Cd污染土壤中的作用奠定了基礎。

蔞蒿；吲哚乙酸；內生耐鎘細菌；篩選；鑒定

洞庭湖是我國第二大淡水湖泊，位于湖南省東北部，由于礦產資源的不合理開采及廢物排放等因素導致其濕地土壤中重金屬鎘（Cd）污染嚴重（董萌等，2013a；Wang等，2008）。Cd為“五毒（Cd、汞（Hg）、鉛（Pb）、鉻（Cr）、砷（As））之首”，在土壤中長期積累不僅影響土壤的生態功能，而且還可通過食物鏈最終危害人類的身體健康（Chaney等，2004；崔巖山和陳曉晨，2010）。由于洞庭湖濕地面積遼闊，地形復雜，采用傳統的物理、化學修復方法很難達到預期的修復效果，因此建立有效的植物-微生物聯合修復體系具廣闊的應用前景，該研究的重點是尋找富集植物及與其匹配的功能微生物。

蔞蒿（Aremisia selengensis）是菊科蒿屬多年生草本植物，在洞庭湖濕地土壤中廣泛分布，是洞庭湖濕地土壤的一種優勢植物，對Cd具較強富集能力，是洞庭湖濕地Cd污染土壤的理想修復材料（董萌等，2011）。在Cd污染條件下蔞蒿的修復特性，防御機制和解毒機制已不乏研究（董萌等，2013b；董萌等，2013c），但由于蔞蒿生物量小等原因，限制了其在Cd污染土壤修復方面的應用。

研究表明，具重金屬耐性的內生細菌可通過固氮作用（Lian等，2009；楊成德等，2014），分泌1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶（周佳宇等，2013；黃蓋等，2013）、產生鐵載體（高曉星等，2013；于婷等，2014）、分泌吲哚乙酸（IAA）（Zhang等，2010）和溶磷（Ma等，2009）等途徑來改善植物的營養狀況，進而提高植物的修復效果，而蔞蒿內生細菌的篩選及其對蔞蒿生長與修復功能的

影響研究卻未見任何報道。

因此，本研究以分泌IAA及Cd耐性為指標篩選蔞蒿的內生細菌，并對菌株的Pb、銅（Cu）、銻（Sb）耐受性及對蔞蒿生長特性的影響等進行研究，從形態特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析等方面對目標菌株進行分類鑒定，以期為進一步揭示內生細菌在蔞蒿修復Cd污染土壤中的作用奠定基礎，也為構建高效的蔞蒿-微生物聯合修復體系打下理論基礎。

1 材料與方法

1.1植物材料

蔞蒿于2012年5月采自南洞庭湖管竹山（112°19′33.4″E，28°55′14.9″N），裝袋密封帶回實驗室備用。

1.2培養基

LB培養基（李振高等，2008）參照文獻配制；有氮培養基（劉琳等，2010）用于分泌IAA菌株的篩選和IAA的定量測定。

1.3內生細菌的分離純化

分別稱取蔞蒿植株的根、莖、葉各1 g，自來水沖洗干凈，依次使用體積分數為70%的酒精浸泡60 s，2.5%的次氯酸鈉溶液表面消毒10 min，無菌水清洗4次。無菌條件下，將根、莖、葉放入無菌研缽中，加入適量無菌水和無菌石英砂，充分研磨，定容至10 mL。稀釋成梯度稀釋樣品，分別從10-3、10-4、10-5稀釋液中取100 μL涂布于Cd離子質量濃度為1 mg·L-1的LB固體培養基平板上，28 ℃倒置培養3 d，待長出菌落后挑取單菌落劃線純化。同時，將表面消毒的最后一次洗滌水涂布于LB平板上以檢測植株樣品表面消毒是否徹底。

1.4分泌IAA的內生耐鎘細菌的篩選

以Cd離子質量濃度為0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg·L-1的LB固體培養基為篩選培養基，接種后，28 ℃倒置培養3 d，觀察Cd離子完全抑制菌株生長的最低濃度即最小抑制濃度（MIC），作為菌株對Cd耐受性的判斷依據（潘風山等，2014）。分泌IAA菌株的篩選方法參照劉琳等（2010），將耐Cd菌株接種于有氮培養基中（每管4 mL，加入過濾除菌的L-色氨酸（質量濃度為2.5 mg·mL-1）1 mL），28 ℃，180 r·min-1搖床培養4 d，取菌液1 mL于滅菌的試管中，加入2 mL Sacowski顯色液（250 mL去離子水+150 mL濃硫酸+7.5 mL物質量濃度為0.5 mol·L-1的FeCl3·6H2O）充分混合，室溫下避光顯色20 min，出現粉紅色，說明有IAA產生。

1.5菌株分泌IAA的定量檢測

培養條件同上，分泌IAA的內生耐Cd細菌經培養后10000 r·min-1離心10 min，取上清液加入等體積的Sacowski顯色液（250 mL去離子水+150 mL濃硫酸+7.5 mL物質量濃度為0.5 mol·L-1的FeCl3·6H2O），室溫下避光顯色20 min，測定其OD530值。根據標準曲線計算內生細菌分泌IAA的量。

1.6菌株對Pb、Cu、Sb的耐受性測定

分泌IAA的內生耐Cd細菌分別接種于含Pb離子質量濃度為0、400、600、800、1000、1200、1500、2000 mg·L-1，Cu離子質量濃度為0、40、80、120、160、200 mg·L-1，Sb離子質量濃度為0、50、100、150、200 mg·L-1的LB固體培養基中，28 ℃培養3 d，觀察Pb、Cu、Sb離子的MIC值以判斷菌株的重金屬耐受性（潘風山等，2014）。

1.7菌株對蔞蒿生長特性的影響

選取長勢一致且帶有4個芽的蔞蒿莖段若干，置于已過夜培養的菌懸液中30 min（對照置于無菌水中）后扦插于已滅菌處理且添加Cd離子質量分數為30 mg·kg-1的土樣中，每處理扦插16株。常規養護60 d后統計蔞蒿植株的株高、鮮重、干重、最長根長和平均根長等指標。

1.8菌株的分類鑒定

形態學鑒定：分泌IAA的內生耐Cd細菌于LB平板上培養3 d，觀察菌落的形態、光澤、質地、邊緣特征、表面特征、隆起形狀、透明度及菌落顏色等特征。

生理生化測定：甲基紅（M.R.）、淀粉水解、檸檬酸鹽利用、吲哚和V.P.等試驗參照《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）進行。

16S rDNA序列測定與分析：提取細菌DNA，選擇通用引物FD1（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），RP2（5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）（廖麗，2012）。PCR反應體系為：2×Taq Master Mix 25 μl，Primer FD1（10 μM）1.25 μL，Primer RP2（10 μM）1.25 μL，Template DNA 1.0 μL，H2O 21.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min；50 ℃退火1 min；72 ℃延長1.5 min；30次循環，72 ℃下延伸10 min后，取2 μL擴增產物于質量分數為1%瓊脂糖凝膠上進行水平電泳，電泳條件為：5 v·cm-1，電泳緩沖液為TAE。PCR產物純化及測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司廣州分公司完成。通過BLAST軟件對所測序列進行相似性分析，MEGA5.1進行系統發育分析，首先用ClustalX1.81進行多序列匹配，Kimura 2-parameter計算進化距離，Neighbor-joining構建系統發育進化樹，Bootstrap分析進化樹分枝的穩定性，重復1000次。

2 結果與分析

2.1分泌IAA內生耐鎘細菌的篩選

經分離純化，從蔞蒿根、莖、葉中分離獲得耐質量濃度為1 mg·L-1Cd離子的菌株共24株，采用不同Cd質量濃度梯度的LB培養基進行耐受性試驗，篩選出6株Cd耐受能力較強的菌株，分別編號為T4、T7、T10、G5、J2、Y5，對Cd的耐受質量濃度均達到90 mg·L-1。從IAA的顯色反應來看，6株菌株均能不同程度地分泌IAA，經定量測定，J2與Y5分泌IAA的能力較強（圖1），可作為目標菌種進行下一步試驗。

圖1 菌株T4、T7、T10、G5、J2和Y5分泌IAA量的測定Fig. 1 Determination quantity of IAA-producing of strains T4, T7, T10, G5, J2and Y5

2.2菌株J2和Y5對重金屬的耐受性

通過培養，發現菌株J2和Y5對Pb離子的耐受性相似，對Cu離子和Sb離子的耐受性均以Y5較強，其中對Sb離子的耐受濃度表現為Y5是J2的3倍（表1）。

表1 菌株J2和Y5對重金屬離子的耐受質量濃度Table 1 The tolerance mass concentration of heavy metal ions of strains J2 and Y5 mg·L-1

2.3菌株J2和Y5對蔞蒿生長特性的影響

從表2可知，菌株J2和Y5侵染蔞蒿植株后，對蔞蒿的生長產生一定的影響，菌株J2可明顯增加蔞蒿的株高、最長根長、平均根長、鮮重和干重，菌株Y5對蔞蒿的株高、鮮重和干重產生顯著影響。

表2 菌株J2和Y5對蔞蒿生長的影響Table 2 Effect of strains J2and Y5on growth of Aremisia selengensis

2.4菌株J2和Y5的分類鑒定

菌株J2在LB平板上菌落為黃色，近圓形，邊緣整齊完整，表面濕潤，粘稠，與培養基結合緊密。菌株Y5在LB平板上菌落為白色，近圓形，邊緣整齊完整，表面濕潤透明，微隆起，與培養基結合緊密（圖2）。

圖2 菌株J2和Y5的菌落形態Fig. 2 Colony morphology of strains J2and Y5

M.R.、淀粉水解、檸檬酸鹽利用等是細菌鑒定常用指標，J2、Y5菌生理生化特性的測定結果如表3，結合《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）可知，J2、Y5菌生理生化指標的測定結果與成團泛菌（Pantoea agglomerans）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）相一致。

表3 菌株J2和Y5的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strains J2 and Y5

16S rDNA基因序列可作為細菌系統發育分析鑒定最合適的指標（崔瑩等，2014），本研究利用PCR方法對J2和Y5的16S rDNA進行了擴增，分別獲得1條大小約為1500 bp的條帶。PCR產物經純化測序后（GenBank accession numbers：KJ882378、KJ882377），與GenBank 中相似度較高的菌株進行比對分析，并構建系統發育樹。結果發現，菌株J2的16S rDNA序列與Pantoea agglomerans STY29（HQ220151）的相似度最高，Y5的16S rDNA序列與Pseudomonas fluorescens V7c10（KC195905）的相似度最高（表4，圖3）。結合形態學和生理生化特性，J2與Y5菌可分別鑒定為成團泛菌（Pantoea agglomerans）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。

表4 菌株J2和Y5的16S rDNA序列相似性分析Table 4 Similarity analysis of 16S rDNA partial sequences of strains J2and Y5

3 討論

內生細菌與植物的關系非常密切（馬瑩等，2013；劉莉華等，2013；姚領愛等，2010），兩者聯合作用可明顯提高植物對重金屬污染土壤的修復效果（Luo等，2012），其作用機制之一就是通過內生細菌分泌IAA來改善植物的營養狀況，進而提高其修復效果（Maity等，2013）。劉佳等（2011）研究表明，分泌IAA的內生成團泛菌HAUM1能明顯提高宿主水稻的生物量、葉綠素及磷含量。何琳燕等（2011）研究認為，在Cd污染條件下分泌IAA的龍葵內生細菌AR1、AY1能夠明顯促進油菜幼苗根的伸長。潘風山等（2014）研究顯示，接種可產生IAA的內生細菌SaN1顯著促進油菜植株的生長，提高植物對Cd的積累量。本研究以分泌IAA和Cd耐性為指標，從蔞蒿體內分離獲得2株產生IAA能力較強的內生耐Cd細菌J2和Y5，J2和Y5菌能顯著增加蔞蒿的生物量，表明J2和Y5菌能有效增加蔞蒿對Cd的實際積累量。

在重金屬脅迫條件下，內生細菌往往可以同時耐受多種重金屬污染，利用內生細菌的技術有望降低復合重金屬污染對植物的毒性，提高植物對重金屬的抗性（朱雪竹等，2010）。Abou-shanab等（2007）發現了多株可以同時耐受9種重金屬毒性的內生細菌。Wei等（2009）從野生豆類根部分離到的土壤桿菌可以同時耐受Cd、Cu、鋅（Zn）、Pb的毒性，并可促進植物生長。Idris等（2006）研究顯示，從超積累植物體內篩選到的多株甲基營養菌能夠耐受Cd、Zn、Cr、鎳（Ni）、鈷（Co）等多種重金屬毒性。在本研究條件下，獲得的內生細菌J2和Y5除對Cd具一定耐受性外，對Pb、Cu、Sb也具一定的耐受能力。南洞庭湖濕地土壤中Cd、Pb、Cu、Sb尤其是Cd、Cu、Sb含量遠超過湖南省和中國的表土背景值（董萌等，2010）。因此，在南洞庭湖濕地土壤Cd、Pb、Cu、Sb的復合污染修復中菌株J2和Y5有望發揮其修復潛能。

目前已報道的能分泌IAA的內生細菌主要包括芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、泛菌屬（Pantoea sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、伯克氏菌屬（Burkholderia sp.）、土壤桿菌屬（Agrobacterium sp.）等（黃蓋等，2013；劉琳等，2010；潘風山等，2014；劉佳等，2011；何琳燕等，2011）。本研究獲得2株分泌IAA能力較強的內生耐Cd細菌J2、Y5，經形態學觀察、生理生化測定、16S rDNA序列測定與相似性分析可鑒定為成團泛菌（Pantoea agglomerans）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。這一方面說明了蔞蒿內生細菌具一定的種屬多樣性，同時也說明了泛菌屬和假單胞菌屬細菌分布廣泛。進一步深入研究J2和Y5菌株對蔞蒿吸收、富集、轉運和解毒Cd能力的影響，將為構建蔞蒿-微生物聯合修復洞庭湖濕地Cd污染土壤的體系提供理論依據。

圖3 菌株J2和Y5基于16S rDNA序列構建的系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strains J2and Y5based on 16S rDNA gene sequences

4 結論

以IAA的分泌能力和Cd耐受性為指標，從對Cd具較高富集能力的洞庭湖濕地植物蔞蒿體內分

離獲得2株產生IAA能力較強的內生耐Cd細菌J2和Y5，J2、Y5菌對Cd的耐受質量濃度均達到90 mg·L-1，IAA的分泌量分別為23.108、15.192 mg·L-1，能顯著促進蔞蒿的生長。經形態特性、生理生化測定和16S rDNA序列分析可分別鑒定為成團泛菌（Pantoea agglomerans）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。J2和Y5對Pb、Cu、Sb也具一定的耐受性，在南洞庭湖濕地土壤Cd、Pb、Cu、Sb的復合污染修復中有望發揮其修復潛能。成團泛菌和熒光假單胞菌分布較為廣泛，進一步深入研究J2和Y5菌對蔞蒿修復Cd污染土壤的影響，為構建蔞蒿-微生物聯合修復體系打下理論基礎。

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Screening and Identification of Indole Acetic Acid-Producing Cadmium-Resistant Endophytic Bacteria from Artemisia Selengensis

ZHOU Xiaomei1, ZHAO Yunlin2*, XU Zhenggang3, DONG Meng1, KU Wenzhen1
1. College of Architecture and Urban Planning, Hunan City University, Yiyang 413000, China; 2. Central South University of Forestry Science and Technology, Changsha 410004, China; 3. College of Bio-safety Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

To isolate indole acetic acid (IAA)-producing cadmium-resistant endophytic bacteria from Artemisia selengensis is to help build an effective combined remediation system of plant and microorganism. Using IAA-producing and cadmium-tolerance as the screening indexes, isolated IAA-producing cadmium-resistant endophytic bacteria from the root, stem and leaf of Artemisia selengensis by the grinding method, and determinated the tolerance of lead, copper, antimony and the effect of the strains on growth of Aremisia selengensis. Strains were identified based on morphological, physiological and biochemical properties as well as 16S rDNA sequence analysis. The results showed that, two cadmium-resistant endophytic bacteria which both have strong abilities to secrete IAA, named as J2and Y5,were isolated from Artemisia selengensis. The cadmium tolerance mass concentration of strains J2and Y5were up to 90 mg·L-1. The IAA production of strains J2and Y5respectively were 23.108 mg·L-1, 15.192 mg·L-1. Strain J2could significantly increase the plant height, the longest root length, the average root length, the fresh weight and the dry weight of Artemisia selengensis; strain Y5could significantly improve the plant height, the fresh weight and the dry weight of Artemisia selengensis. The lead tolerance mass concentration of strains J2and Y5were up to 1200 mg·L-1, while the copper tolerance mass concentration of strains J2and Y5respectively were 120 mg·L-1and 160 mg·L-1, the antimony tolerance mass concentration of strains J2and Y5respectively were 50 mg·L-1and 150 mg·L-1. The colony of strain J2was yellow, suborbicular and sticky on LB tablet. The colony of strain Y5was white, suborbicular and moist on LB tablet. Strains J2and Y5respectively obtained one about 1500 bp band by amplifying 16S rDNA sequences, and by comparing strains J2and Y5showed the closest similarity of 16S rDNA sequences to Pantoea agglomerans STY29(HQ220151) and Pseudomonas fluorescens V7c10(KC195905) respectively in GenBank and thus were identified as Pantoea agglomerans and Pseudomonas fluorescens respectively in combination with morphological, physiological and biochemical properties. This research on IAA-producing cadmium-resistant endophytic bacteria of Pantoea agglomerans and Pseudomonas fluorescens isolated from Artemisia selengensis provided a theoretical framework for studying their roles in remedying cadmium contaminated soil of Artemisia selengensis.

Artemisia selengensis; indole acetic acid; cadmium-resistant endophytic bacteria; screening; identification

X172

A

1674-5906（2014）12-1980-06

國家林業公益性行業科研基金項目（201304310）；湖南省自然科學基金項目（2015JJ4012）；湖南省科技計劃項目（2010SK2004）；湖南省教育廳項目（13C118）

周小梅（1977年生），女，副教授，博士，主要研究方向為環境污染生態修復。E-mail:864759100@QQ.com

*通信作者：趙運林，男，E-mail:zyl8291290@163.com

2014-08-17

周小梅，趙運林，胥正鋼，董萌，庫文珍. 分泌吲哚乙酸的蔞蒿內生耐鎘細菌的篩選與鑒定[J]. 生態環境學報, 2014, 23(12): 1980-1985.

ZHOU Xiaomei, ZHAO Yunlin, XU Zhenggang DONG Meng, KU Wenzhen. Screening and Identification of Indole Acetic Acid-Producing Cadmium-Resistant Endophytic Bacteria from Artemisia Selengensis [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2014, 23(12): 1980-1985.