Cu脅迫下土壤硝化功能的變化及其影響因素初探

劉愛菊，方殿梅，王超，李夢紅

Cu脅迫下土壤硝化功能的變化及其影響因素初探

劉愛菊*，方殿梅，王超，李夢紅

山東理工大學資源與環境工程學院，山東 淄博 255049

隨著養殖業的規模化發展，Cu、Zn等重金屬元素作為飼料添加劑被廣泛應用于畜禽養殖，并隨著畜禽糞便的大量、廣泛農用，Cu、Zn等低生物毒性的重金屬元素在土壤中的逐漸累積以及污染問題日趨嚴重，這對土壤生態系統的穩定造成了嚴重的威脅。為探討Cu脅迫下土壤生態功能的動態變化，文章采用室內模擬培養法，測定了紅壤、黃土等8種典型土壤的潛在硝化勢對Cu污染脅迫的時間效應；并利用統計分析手段研究了影響Cu脅迫下土壤的硝化功能恢復的主要因素。研究結果表明，在試驗處理劑量下，Cu污染處理一周，各土壤潛在硝化勢均受到完全抑制，即抑制率在80%以上；隨著污染脅迫時間的延長，各土壤的硝化功能均有不同程度的恢復，且在540 d后，500 mg·kg-1Cu處理土壤（除pH較低的紅壤和黑土外）潛在硝化勢的恢復率均達到其初始值的80%，即土壤硝化功能基本完全恢復；1000 mg·kg-1Cu處理土壤（除褐土、棕壤和黃土3中土壤外）潛在硝化勢的恢復率均顯著低于80%。這表明Cu污染程度的增加可延遲土壤硝化功能的恢復。多元逐步回歸分析表明，Cu污染脅迫下土壤硝化功能的恢復與其初始硝化功能以及其對Cu耐受能力顯著相關。由此可知，長期Cu污染脅迫下，土壤的硝化功能的恢復主要取決于土壤初始的硝化活性及其對Cu的耐受能力。

Cu；污染；土壤硝化作用；恢復

土壤是不可再生資源，也是社會經濟發展的基礎，土壤環境質量的好壞直接關系到生態環境和人體健康的安全。然而，隨著社會經濟的迅猛發展土壤重金屬污染問題日趨嚴重，已成為威脅我國農業生態系統及食品安全的主要問題（環境保護部和國土資源部，全國土壤污染狀況調查公報，2014）。近年來，隨著養殖業的規模化發展，低毒性的Cu、Zn等微量元素的在土壤環境中的累積及污染問題日趨嚴重（Zhang等，2011；潘霞等，2012）。因此，在土壤污染研究中特別關注的重金屬，除生物毒性顯著的Hg、Cd、Pb、Cr以及類金屬As外，還應包括低毒性的Cu、Zn等雙重性重金屬元素（趙保真，2012；高小柱等，2013）。

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，同時也是維持土壤生態功能的重要保障。隨著土壤重金屬污染的加劇，人們逐漸關注重金屬對微生物介導的生態過程的影響，并認為研究重金屬潛在微生物生態效應對于認識土壤功能退化過程具有重要意義（Giller等，2009）。土壤硝化作用主要由氨氧化微生物介導，是氮素生物地球化學循環中一個重要的環節。同時，土壤硝化作用是對重金屬污染最為敏感的土壤微生物過程之一(夏月和朱永官，2007；Smolders等，2001；Broos等，2004)。基于此特點，硝化作用已被廣泛用來進行土壤重金屬污染的風險評價（夏月和朱永官，2007）。但最新的相關研究表明，土壤硝化功能對Zn、Cu等重金屬長期污染具有較高的耐受或適應能力，即在重金屬的長期脅迫下，其硝化活性表現為先抑制后恢復，且該活性的恢復與氨氧化細菌（AOB）種群組成及其多樣性無關（Metens等，2009；Rutyers等，2012，2013）。這對以土壤硝化功能為指標，評價土壤重金屬污染的風險提出了嚴峻的挑戰。國內學者在Cu對土壤硝化作用急性毒性效應及相應微生物群落的影響進行了較為深入研究（孫晉偉等，2008），但是對于Cu污染脅迫下，土壤硝化功能的動態變化過程及其控制因素研究尚未見報道。

為此，本文選擇采自我國不同地區的8種典型土壤，采用室內模擬實驗法，研究了Cu長期污染脅迫下，不同類型土壤的潛在硝化勢（Potential nitrification rate, PNR）對Cu污染脅迫的時間效應；

并利用統計分析手段研究了影響Cu脅迫土壤硝化功能恢復的主要因素。以期為土壤重金屬污染的微生物評價與治理提供理論依據。

1 材料和方法

1.1供試土壤

8種典型土壤分別采自全國7個不同省和河南的2個生態區。采用多點混合取樣法采集農業土壤耕層0～20 cm土樣。樣品采回后，去除其中的石塊、草根等雜物，一部分于4 ℃下冷藏，一周內進行培養試驗；另一部分進行風干、將其充分混勻，磨細后過2 mm篩進行物理性質分析，過0.5 mm篩進行化學分析測定。

1.2土壤理化性質的測定

土壤基本理化性質測定采用常規分析法（魯如坤，2000）。其中土壤有機質（OC）用重鉻酸鉀水合熱法；土壤pH水土比1∶1浸提pH計測定；土壤陽離子代換量（CEC）用醋酸銨浸提火焰分光光度計測定；黏粒含量用激光力度儀測定。土壤NO3--N用1 mol·L-1的KCl溶液按1∶5的土液比浸提后用流動分析儀（AA3）測定其含量，最后換算為土壤中NO3--N（mg·kg-1）（孫晉偉等，2008）；土壤中Cu含量由山東理工大學分析測試中心測定，采用HF、HClO4微波消解，ICP-MS測定的方法。供試土壤的土壤類型及理化性質見表1。

1.3研究方法

1.3.1 土壤預培養處理

取適量冷藏土壤調節其含水量至其田間持水量的50%后，置于25 ℃±2 ℃培養1周，將其平分3份，一份加去離子水做對照；另2份加CuCl2（1 mol·L-1）母液使Cu添加濃度分別達500 mg·kg-1和1000 mg·kg-1；用去離子水調整土壤含水量之其田間持水量的60%，繼續置于25 ℃±2 ℃培養。定期取樣進行土壤潛在硝化勢和Cu抗性的測定；其中，每處理做3次重復。

1.3.2 土壤硝化勢的測定

主要參照國際標準委員會（ISO）推薦的方法（ISO14238，1997），稍作修改，即取預培養土壤適量，按100 mg·kg-1劑量向土壤中添加(NH4)2SO4，用蒸餾水調整土壤含水量至田間最大持水量的75%，置于25 ℃±2 ℃、黑暗、通風的條件下繼續培養7 d或14 d后，測定土壤中NO3--N的產生量。其中pH≥5的土壤，測定其7 d土壤中NO3--N的產生量；pH＜5的土壤，測定其14天土壤中NO3--N的產生量。

1.3.3 土壤硝化功能對Cu抗性測定

參考Mertens等報道的方法(Mertens等，2006)，稍作修改：分別取適量的風干土壤于121 ℃下滅菌1 h后，加入不同體積的CuCl2（1 mol·L-1）母液，配置0、15、30、75、150、300和500 mg·kg-1等不同Cu濃度梯度污染的土壤，用滅菌水調整其含水量至田間持水量的75%；之后，按1∶10的比例分別將預培養土樣接種于滅菌處理土壤中，充分混勻后，按照國際標準委員會（ISO：14238，1997）推薦的方法測定各處理的潛在硝化勢。

1.4數據處理

1.4.1 PNR計算

PNR采用如下公式計算：

式中，PNR：潛在硝化勢（NO3--N mg·kg-1·d-1）；?(NO3--N)1：加底物后培養0天土壤中NO3--N的含量（mg·kg-1）；?(NO3--N)2：加底物培養14或28 d后土壤中NO3--N的含量（mg·kg-1）；X為繼續培養的時間（d）。

1.4.2 PNR抑制率及恢復率的計算

式中，PNRcontrol為Cu未污染處理土壤的PNR值；PNRtreatment為Cu污染處理土壤的PNR值。

表1 供試土壤的類型及其理化性質Table 1 Soil types and its physical-chemical characters

1.4.3 作圖與分析

用EXCELL7.0進行作圖分析和數據初步處理；

用SPSS對所有數據進行差異顯著性、Pearson相關性、逐步多元回歸等統計分析；采用log-logistic曲線法計算Cu對各土壤潛在硝化勢的EC50值。

2 結果與討論

2.1Cu處理對土壤PNR抑制作用

已有的研究表明，土壤pH條件是影響土壤氨氧化細菌的群落組成及豐度的關鍵性因素（Nicol等，2008），并調控土壤的氨氧化能力（ISO14238，1997）。在本研究中，各供試土壤的初始氨氧化活性的差異性較大（圖1）。海南紅壤活性最低，PNR0僅為NO3--N 0.8 mg·kg-1·d-1；山西黃土的PNR0則高達NO3--N 17.19 mg·kg-1·d-1，是海南紅壤的PNR0的20余倍；且進一步的Pearson相關分析結果也表明pH與各供試土壤的PNR0程顯著正相關關系（表2）。由此可推測，在本研究中各供試土壤在氨氧化細菌的群落結構及豐度方面可能存在較大的差異。

圖1 各供試土壤的初始潛在硝化勢（PNR0）Fig. 1 The initial potential nitrification rate of each tested soil

表2 供試土壤各指標之間的Pearson相關分析Table 2 Pearson-related analysis results of the selected properties

盡管各供試土壤的氨氧化活性之間存在較大的差異，但Cu污染處理后，其均仍受到了嚴重抑制（圖2）。Cu污染處理一周后，各供試土壤的氨氧化活性均受到嚴重的抑制，其中，Cu濃度為500 mg·kg-1處理對土壤PNR的抑制率達80%～99.5%；1000 mg·kg-1處理對各供試土壤PNR的抑制率則均達到了100%。這進一步表明土壤氨氧化活性是指示土壤Cu污染的敏感性指標（高柱等，2013），并且土壤氨氧化微生物群落及其活性的差異并不影響其生態功能對Cu污染的敏感性。

圖2 Cu污染處理7天對各土壤硝化活性的抑制效應Fig. 2 Effects of Cu on soil nitrification after 7 days of application

2.2長期脅迫下土壤PNR對Cu的耐受能力變化及其影響因素

為進一步研究Cu長期污染對土壤氨氧化活性的影響及其控制因素，本文采用Spike-on-spike方法，研究了長期污染脅迫下，各土壤的氨氧化功能對Cu的耐受能力變化及其影響因素，結果見表2和表3。

在整個試驗過程中，Cu對各對照處理土壤PNR的EC50值未發生有顯著的變化。因此，本研究選用Cu對各土壤PNR的初始EC50參比對照，研究長期污染脅迫下土壤氨氧化活性對Cu的耐受能力變化。由表3可知，與對照處理相比，在Cu處理后30 d，Cu對各供試土壤PNR的EC50值顯著降低，表明各土壤的氨氧化活性對Cu污染的敏感性增加；但在Cu處理后180 d，360 d和540 d，Cu對各土壤PNR的EC50值較對照處理土壤均顯著增加，表明Cu長期脅迫下土壤硝化微生物可對其產生一定的適應性或耐受能力；且對于同一類型的土壤，1000 mg·kg-1處理的EC50值較500 mg·kg-1處理增加顯著，表明高劑量的Cu污染脅迫可加速土壤硝化功能對其的適應過程(Ruyters等，2013)。

2.3Cu長期污染脅迫下土壤PNR的恢復及其控制因素分析

為研究Cu長期污染脅迫下土壤硝化功能的動態變化，本文究采用定期取樣法測定了不同Cu污染處理時間土壤氨氧化活性的恢復率，結果見圖3。Cu污染處理180 d后，500 mg·kg-1處理各土壤的PNR恢復率在35%～60%之間；1000 mg·kg-1處理各土壤的PNR恢復率在5%～30%之間；360 d后，500 mg·kg-1處理各土壤的PNR恢復率均在50%以上，而1000 mg·kg-1處理各土壤的氨氧化活性恢復相對較慢，各土壤的PNR恢復率仍低于30%。但在經歷540 d Cu暴露培養后，除pH較低的紅壤和黑土外，500 mg·kg-1處理土壤的PNR恢復率均達到了

80%以上，即其氨氧化功能得以基本恢；而在1000 mg·kg-1處理土壤樣品中，僅河南褐土、黃褐土以及安徽淮南的砂姜黑土的氨氧化活性得以基本恢復。由此可知，在Cu長期污染脅迫下，初始受抑制的土壤氨氧化功能則會逐漸得以恢復；但是，Cu污染程度是影響土壤硝化功能恢復的重要因素。

表3 長期污染脅迫下Cu對各供試土壤PNR的毒性閾值Table 3 The EC50values in different soils after long time application of Cu（EC50mg·kg-1）

圖3 Cu污染處理后各土壤硝化功能的恢復率Fig. 3 Recovery of soil PNR after application of Cu

Pearson相關分析表明，Cu污染處理后，土壤氨氧化活性的恢復與土壤pH、PNR0以及其對Cu的抗性（EC50）之間存在顯著的正相關性（表2）；且進一步的多元逐步回歸分析表明，Cu污染后處理后，土壤硝化功能的恢復僅與土壤PNR0以及其對Cu耐受能力（EC50）密切相關（表4）。這在一定程度上表明，受重金屬污染土壤的硝化功能的恢復具有普遍性，但其主要取決于土壤氨氧化微生物活性以及其對重金屬污染的適應性。Babich和Stotzky（1980）研究也發現重金屬污染后土壤硝化作用的恢復與土壤的理化性質及其初始的氨氧化活性具有密切的關系。Ruysters等（2013）也研究報道了重金屬暴露污染后土壤硝化功能的恢復與土壤初始PNR顯著正相關，并認為污染土壤硝化功能的恢復主要取決于土壤微生物的功能冗余。Zhang等（2010）研究認為土壤硝化微生物群落多樣性與重金屬污染后土壤潛在硝化勢的恢復之間不存在必然的聯系。因此，今后，有必要進一步研究重金屬污染后土壤氨氧化活性的恢復與土壤功能微生物群落特征之間的關系。

表4 Cu污染脅迫下土壤硝化功能恢復的影響因素的多元逐步回歸分析Table 4 Multiple steps analysis results of soil nitrification recovery rates and the key factors

3 結論

各供試土壤的氨氧化功能對Cu污染均較為敏感；但Cu長期污染脅迫下，各土壤受抑制的硝化活性會逐漸得以恢復；Cu脅迫強度和時間是影響土壤硝化微生物對其產生抗性重要因素；Cu污染后土

壤硝化功能的恢復主要取決于土壤初始的硝化活性及其對Cu的適應能力。

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Primary Research on the Recovery of Soil Nitrification and Its Key Factors under the Cu Stress

LIU Aiju*, FANG Dianmei, WANG Chao, LI Menghong
School of Resources and Environmental Engineering, Shandong University of Technology, Zibo 255049, China

Up to 90% of trace elements, such as Cu and Zn, that are fed to livestock are excreted and thus are present in manure. By the wide application of manure as fertilizer, these light toxic elements can reach soil, accumulate and cause serious risk on soils microbial ecology. The aim of this study is to determine the effect of Cu on soil nitrification function for a longtime after application, and its key factors. To this end, the soil potential nitrification rate (PNR) was determined, and the relationship between PNR and soil properties was tested. Eight soil samples, collected from 8 locations of China, were used to represent soil nitrification bacterial difference, and to assess s effects on the recovery of the soil nitrification to long time metal stress (Cu). Soil (700 g) was amended with either mineral water and incubated in dark at 25 ℃ for 7 days. Then each of these soil treatments was mixed with CuCl2solutions at two total concentration levels 500 mg kg-1and 1000 mg kg-1, respectively. No Cu treated samples were selected as control treatments. After 0, 30, 180, 360 and 540 d, soils PNR were determined. At the same time, a spike-on-spike assay was set-up to test for tolerance of soil nitrification to copper (Cu). The results indicated that all soil PNRs were seriously inhibited by Cu at the beginning, which was over 80 % for the soil samples treated with 500 mg·kg-1and was 100 % for the soil samples treated with 1000 mg·kg-1. After a long time Cu exposure (540 days), recovery of the soil nitrification rate were found in all the Cu amended soils, especially for the soils treated with Cu 500 mg·kg-1, PNR almost restored to the same level to the control treatments as the recovery rate ranging from 80% to 100%. Multiple steps regression analysis indicated that the recovery was strongly related to the soil primary nitrification activity and its initial tolerance to Cu. Increased Cu tolerance of soil nitrification was consistently observed in response to corresponding soil contamination, and it was also strongly related to the soil primary nitrification activity. These data indicate that inherently microbial activity can be significant factor for the recovery of soil functioning derived from metal contamination.

Cu; contamination; coil nitrification; recovery

X131.3

A

1674-5906（2014）12-1986-05

國家自然科學基金項目(41001145；41210104050)；青年教師支持計劃項目（4072）

劉愛菊（1976年生），女，副教授，博士，研究方向為土壤污染生態學。E-mail: liuajsdut@gmail.com。*通信作者：

2014-09-18

劉愛菊，方殿梅，王超，李夢紅. Cu脅迫下土壤硝化功能的變化及其影響因素初探[J]. 生態環境學報, 2014, 23(12): 1986-1990.

LIU Aiju, FANG Dianmei, WANG Chao, LI Menghong. Primary Research on the Recovery of Soil Nitrification and Its Key Factors under the Cu Stress [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2014, 23(12): 1986-1990.