生物熒光傳感器檢測環境水樣中氨基甲酸酯類農藥殘留

于源華等

關鍵詞：氨基甲酸酯類農藥； 基因組文庫； 生物熒光傳感器； 非細胞體系

1引言

氨基甲酸酯類農藥是農作物防治蟲害的常用農藥[1]，常用的如呋喃丹（2，3二氫2，2二甲基7苯并呋喃基甲基氨基甲酸酯）、西維因 （（1萘基）N甲基氨基甲酸酯），它們是主要的氨基甲酸酯類殺蟲劑，能被植物的根、莖、葉吸收，并在作物內傳導；可經消化道、呼吸道和皮膚被人吸收，吸收后主要分布于肝、腎、脂肪和肌肉中。氨基甲酸酯類農藥是一種抑制體內膽堿酯酶的神經毒素，具有潛在致癌、致畸、致突變作用[2～4]。近年來，農藥殘留和食品安全的問題備受關注。

目前，氨基甲酸酯類農藥殘留的檢測方法主要用于蔬菜和水果等樣品，環境水體中氨基甲酸酯類農藥殘留的快速檢測鮮有報道。我國現行氨基甲酸酯類農藥國家標準檢測方法有色譜法[5，6]、膽堿酯酶抑制法[7]等。色譜法定量準確，但儀器體積大，對檢測人員的技術要求高；膽堿酯酶抑制法快速、便捷，但靈敏度低，檢出限僅為mg/kg級。因此建立靈敏、簡便、低成本的環境水體中氨基甲酸酯類農藥殘留快速檢測方法對環境監測領域意義重大。

近年來，非細胞體系生物熒光傳感器以快速、靈敏、高通量的優點，在快速檢測領域受到廣泛關注。非細胞體系是在細胞抽提物的酶系中合成蛋白質的體外系統，具有穩定、快速、高效等特點[8]。Xiong等[9]將綠色熒光蛋白基因同源重組到睪丸酮叢毛單胞菌中甾體激素特異性響應功能基因下游，構建了定量檢測甾體激素的非細胞體系生物熒光傳感器，靈敏度達到1.0 ng/L。本研究組在質粒pK18的順式β半乳糖苷酶啟動子基因下游，依次插入了甾體激素及多環芳烴的特異性響應功能基因、綠色熒光蛋白基因，并將質粒轉入大腸桿菌BL21中，構建了定量檢測甾體激素及多環芳烴的非細胞體系高效生物熒光傳感器，靈敏度達到0.1 ng/L[10] 。

本研究通過構建氨基甲酸酯類農藥降解菌H5基因組文庫，篩選出氨基甲酸酯類農藥特異性響應功能基因的調控序列，與增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因連接，構建了檢測氨基甲酸酯類農藥殘留的非細胞體系生物熒光傳感器，用于環境水體中的農殘檢測。當樣本中含有氨基甲酸酯類農藥時EGFP表達并發光，熒光值在一定范圍內與農藥含量呈正相關。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Synergy2熒光酶標儀（美國BioTek公司）； 96孔微孔黑板（美國Corning公司）； LC20A高效液相色譜儀、 UV2550紫外可見光分光光度計（日本島津公司）； 5810R冷凍高速離心機（德國Eppendorf公司）； HZQF160全溫振蕩培養箱（哈東聯公司）。

H5菌株（本實驗室保存）、質粒pKEGFP2（本實驗室構建）；大腸桿菌HB101（北京鼎國生物公司）。

呋喃丹標準品（中國藥品生物制品檢定所）；LB培養基、無機鹽培養基、Kanamycin（北京鼎國公司）；限制性內切酶、堿性磷酸酶（NEB公司）；其它試劑均為分析純，實驗用水為去離子水。

呋喃丹標準液配制：呋喃丹標準品0.01 g，加入10 mL丙酮溶解，再用含有10%丙酮的磷酸鹽緩沖液（PBS）將其稀釋成所需濃度的呋喃丹標準液。

2.2H5菌株對氨基甲酸酯類農藥降解功能的鑒定

配制50 mg/L呋喃丹，作為唯一碳源的無機鹽培養基，分別加入HB101菌液和H5菌液，HB101菌液在37 ℃，H5菌液在27 ℃，2000 r/min，培養14 h，高效液相（HPLC）法檢測培養基中呋喃丹含量。HPLC條件：ODSC18反向柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇水（70∶30， V/V）；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；紫外檢測器，檢測波長210 nm。

2.3H5菌株基因組文庫的構建及功能基因調控序列的篩選

參照基因組文庫構建方法[11]，用限制性內切酶BamHI酶切H5染色體及載體pKEGFP2，將其連接，轉化HB101感受態細胞，Kanamycin 抗性LB固體培養基篩選單克隆。將篩選出的單克隆菌液與10， 100和1000 ng/L呋喃丹標準液在96孔微孔黑板中誘導培養1 h，熒光酶標儀檢測熒光強度，激發波長475nm，發射波長509 nm，選取熒光強度與呋喃丹濃度正相關且熒光增強率（FE）最大的克隆子。

關鍵詞：氨基甲酸酯類農藥； 基因組文庫； 生物熒光傳感器； 非細胞體系

1引言

氨基甲酸酯類農藥是農作物防治蟲害的常用農藥[1]，常用的如呋喃丹（2，3二氫2，2二甲基7苯并呋喃基甲基氨基甲酸酯）、西維因 （（1萘基）N甲基氨基甲酸酯），它們是主要的氨基甲酸酯類殺蟲劑，能被植物的根、莖、葉吸收，并在作物內傳導；可經消化道、呼吸道和皮膚被人吸收，吸收后主要分布于肝、腎、脂肪和肌肉中。氨基甲酸酯類農藥是一種抑制體內膽堿酯酶的神經毒素，具有潛在致癌、致畸、致突變作用[2～4]。近年來，農藥殘留和食品安全的問題備受關注。

目前，氨基甲酸酯類農藥殘留的檢測方法主要用于蔬菜和水果等樣品，環境水體中氨基甲酸酯類農藥殘留的快速檢測鮮有報道。我國現行氨基甲酸酯類農藥國家標準檢測方法有色譜法[5，6]、膽堿酯酶抑制法[7]等。色譜法定量準確，但儀器體積大，對檢測人員的技術要求高；膽堿酯酶抑制法快速、便捷，但靈敏度低，檢出限僅為mg/kg級。因此建立靈敏、簡便、低成本的環境水體中氨基甲酸酯類農藥殘留快速檢測方法對環境監測領域意義重大。

近年來，非細胞體系生物熒光傳感器以快速、靈敏、高通量的優點，在快速檢測領域受到廣泛關注。非細胞體系是在細胞抽提物的酶系中合成蛋白質的體外系統，具有穩定、快速、高效等特點[8]。Xiong等[9]將綠色熒光蛋白基因同源重組到睪丸酮叢毛單胞菌中甾體激素特異性響應功能基因下游，構建了定量檢測甾體激素的非細胞體系生物熒光傳感器，靈敏度達到1.0 ng/L。本研究組在質粒pK18的順式β半乳糖苷酶啟動子基因下游，依次插入了甾體激素及多環芳烴的特異性響應功能基因、綠色熒光蛋白基因，并將質粒轉入大腸桿菌BL21中，構建了定量檢測甾體激素及多環芳烴的非細胞體系高效生物熒光傳感器，靈敏度達到0.1 ng/L[10] 。

本研究通過構建氨基甲酸酯類農藥降解菌H5基因組文庫，篩選出氨基甲酸酯類農藥特異性響應功能基因的調控序列，與增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因連接，構建了檢測氨基甲酸酯類農藥殘留的非細胞體系生物熒光傳感器，用于環境水體中的農殘檢測。當樣本中含有氨基甲酸酯類農藥時EGFP表達并發光，熒光值在一定范圍內與農藥含量呈正相關。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Synergy2熒光酶標儀（美國BioTek公司）； 96孔微孔黑板（美國Corning公司）； LC20A高效液相色譜儀、 UV2550紫外可見光分光光度計（日本島津公司）； 5810R冷凍高速離心機（德國Eppendorf公司）； HZQF160全溫振蕩培養箱（哈東聯公司）。

H5菌株（本實驗室保存）、質粒pKEGFP2（本實驗室構建）；大腸桿菌HB101（北京鼎國生物公司）。

呋喃丹標準品（中國藥品生物制品檢定所）；LB培養基、無機鹽培養基、Kanamycin（北京鼎國公司）；限制性內切酶、堿性磷酸酶（NEB公司）；其它試劑均為分析純，實驗用水為去離子水。

呋喃丹標準液配制：呋喃丹標準品0.01 g，加入10 mL丙酮溶解，再用含有10%丙酮的磷酸鹽緩沖液（PBS）將其稀釋成所需濃度的呋喃丹標準液。

2.2H5菌株對氨基甲酸酯類農藥降解功能的鑒定

配制50 mg/L呋喃丹，作為唯一碳源的無機鹽培養基，分別加入HB101菌液和H5菌液，HB101菌液在37 ℃，H5菌液在27 ℃，2000 r/min，培養14 h，高效液相（HPLC）法檢測培養基中呋喃丹含量。HPLC條件：ODSC18反向柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇水（70∶30， V/V）；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；紫外檢測器，檢測波長210 nm。

2.3H5菌株基因組文庫的構建及功能基因調控序列的篩選

參照基因組文庫構建方法[11]，用限制性內切酶BamHI酶切H5染色體及載體pKEGFP2，將其連接，轉化HB101感受態細胞，Kanamycin 抗性LB固體培養基篩選單克隆。將篩選出的單克隆菌液與10， 100和1000 ng/L呋喃丹標準液在96孔微孔黑板中誘導培養1 h，熒光酶標儀檢測熒光強度，激發波長475nm，發射波長509 nm，選取熒光強度與呋喃丹濃度正相關且熒光增強率（FE）最大的克隆子。

關鍵詞：氨基甲酸酯類農藥； 基因組文庫； 生物熒光傳感器； 非細胞體系

1引言

氨基甲酸酯類農藥是農作物防治蟲害的常用農藥[1]，常用的如呋喃丹（2，3二氫2，2二甲基7苯并呋喃基甲基氨基甲酸酯）、西維因 （（1萘基）N甲基氨基甲酸酯），它們是主要的氨基甲酸酯類殺蟲劑，能被植物的根、莖、葉吸收，并在作物內傳導；可經消化道、呼吸道和皮膚被人吸收，吸收后主要分布于肝、腎、脂肪和肌肉中。氨基甲酸酯類農藥是一種抑制體內膽堿酯酶的神經毒素，具有潛在致癌、致畸、致突變作用[2～4]。近年來，農藥殘留和食品安全的問題備受關注。

目前，氨基甲酸酯類農藥殘留的檢測方法主要用于蔬菜和水果等樣品，環境水體中氨基甲酸酯類農藥殘留的快速檢測鮮有報道。我國現行氨基甲酸酯類農藥國家標準檢測方法有色譜法[5，6]、膽堿酯酶抑制法[7]等。色譜法定量準確，但儀器體積大，對檢測人員的技術要求高；膽堿酯酶抑制法快速、便捷，但靈敏度低，檢出限僅為mg/kg級。因此建立靈敏、簡便、低成本的環境水體中氨基甲酸酯類農藥殘留快速檢測方法對環境監測領域意義重大。

近年來，非細胞體系生物熒光傳感器以快速、靈敏、高通量的優點，在快速檢測領域受到廣泛關注。非細胞體系是在細胞抽提物的酶系中合成蛋白質的體外系統，具有穩定、快速、高效等特點[8]。Xiong等[9]將綠色熒光蛋白基因同源重組到睪丸酮叢毛單胞菌中甾體激素特異性響應功能基因下游，構建了定量檢測甾體激素的非細胞體系生物熒光傳感器，靈敏度達到1.0 ng/L。本研究組在質粒pK18的順式β半乳糖苷酶啟動子基因下游，依次插入了甾體激素及多環芳烴的特異性響應功能基因、綠色熒光蛋白基因，并將質粒轉入大腸桿菌BL21中，構建了定量檢測甾體激素及多環芳烴的非細胞體系高效生物熒光傳感器，靈敏度達到0.1 ng/L[10] 。

本研究通過構建氨基甲酸酯類農藥降解菌H5基因組文庫，篩選出氨基甲酸酯類農藥特異性響應功能基因的調控序列，與增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因連接，構建了檢測氨基甲酸酯類農藥殘留的非細胞體系生物熒光傳感器，用于環境水體中的農殘檢測。當樣本中含有氨基甲酸酯類農藥時EGFP表達并發光，熒光值在一定范圍內與農藥含量呈正相關。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

Synergy2熒光酶標儀（美國BioTek公司）； 96孔微孔黑板（美國Corning公司）； LC20A高效液相色譜儀、 UV2550紫外可見光分光光度計（日本島津公司）； 5810R冷凍高速離心機（德國Eppendorf公司）； HZQF160全溫振蕩培養箱（哈東聯公司）。

H5菌株（本實驗室保存）、質粒pKEGFP2（本實驗室構建）；大腸桿菌HB101（北京鼎國生物公司）。

呋喃丹標準品（中國藥品生物制品檢定所）；LB培養基、無機鹽培養基、Kanamycin（北京鼎國公司）；限制性內切酶、堿性磷酸酶（NEB公司）；其它試劑均為分析純，實驗用水為去離子水。

呋喃丹標準液配制：呋喃丹標準品0.01 g，加入10 mL丙酮溶解，再用含有10%丙酮的磷酸鹽緩沖液（PBS）將其稀釋成所需濃度的呋喃丹標準液。

2.2H5菌株對氨基甲酸酯類農藥降解功能的鑒定

配制50 mg/L呋喃丹，作為唯一碳源的無機鹽培養基，分別加入HB101菌液和H5菌液，HB101菌液在37 ℃，H5菌液在27 ℃，2000 r/min，培養14 h，高效液相（HPLC）法檢測培養基中呋喃丹含量。HPLC條件：ODSC18反向柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇水（70∶30， V/V）；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；紫外檢測器，檢測波長210 nm。

2.3H5菌株基因組文庫的構建及功能基因調控序列的篩選

參照基因組文庫構建方法[11]，用限制性內切酶BamHI酶切H5染色體及載體pKEGFP2，將其連接，轉化HB101感受態細胞，Kanamycin 抗性LB固體培養基篩選單克隆。將篩選出的單克隆菌液與10， 100和1000 ng/L呋喃丹標準液在96孔微孔黑板中誘導培養1 h，熒光酶標儀檢測熒光強度，激發波長475nm，發射波長509 nm，選取熒光強度與呋喃丹濃度正相關且熒光增強率（FE）最大的克隆子。