烏頭堿電噴霧質(zhì)譜裂解機(jī)制的研究

譚 鵬，鄧欣祺，李 飛，鄔瑞光，龍柳娟，劉永剛

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

烏頭堿電噴霧質(zhì)譜裂解機(jī)制的研究

譚 鵬，鄧欣祺，李 飛，鄔瑞光，龍柳娟，劉永剛

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

為研究烏頭堿的質(zhì)譜裂解機(jī)制，采用蠕動(dòng)泵進(jìn)樣，在正離子模式下，獲得烏頭堿的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜。通過(guò)QTRAP-MSn檢測(cè)發(fā)現(xiàn)烏頭堿的21種裂解碎片，分析烏頭堿的3類裂解途徑，首次在二級(jí)質(zhì)譜中發(fā)現(xiàn)丟失C6H5COOH離子。不同裂解機(jī)制特征離子碎片的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)初步鑒定，為烏頭堿在較低濃度下的快速定性和定量鑒別提供依據(jù)。

ESI-QTRAP-MSn；烏頭堿；裂解機(jī)制

0 引 言

烏頭堿（aconitine）是附子、川烏、草烏等烏頭屬中藥的主要毒性成分之一，屬于雙酯型二萜類生物堿，結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)酯鍵在炮制過(guò)程中會(huì)發(fā)生水解，毒性降低。含烏頭堿的烏頭屬中藥在中醫(yī)臨床應(yīng)用廣泛，但中毒事件常有發(fā)生[1-2]。目前，已有報(bào)道采用HPLC等方法檢測(cè)飲片及中成藥中的烏頭堿含量[3-4]，及采用HPLC-MS等方法檢測(cè)兔的血、尿中的烏頭堿及代謝產(chǎn)物[5]，對(duì)烏頭堿的質(zhì)譜裂解有部分文獻(xiàn)報(bào)道[6-9]，但碎片離子數(shù)目較少，且在推測(cè)質(zhì)譜裂解途經(jīng)的過(guò)程中大多推測(cè)了丟失的基團(tuán)，如-OCH3等，丟失的位置或者丟失后的穩(wěn)定離子報(bào)道較少。本論文初步預(yù)測(cè)了21種碎片離子的結(jié)構(gòu)。

電噴霧電離（ESI）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種軟電離技術(shù)，特別適合于樣品的快速分析及鑒定，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)，包懿等[10]采用電噴霧質(zhì)譜研究了烏頭堿類雙酯型二萜生物堿的水解反應(yīng)，李錚等[11]研究了烏頭堿及水解產(chǎn)物的裂解產(chǎn)物。上述研究對(duì)解釋烏頭堿的質(zhì)譜裂解途經(jīng)起到了很好的作用，但本課題組在進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)烏頭堿的裂解碎片較多，有一些新的裂解方式。因此，本文采用高靈敏度電噴霧質(zhì)譜深入探討烏頭堿的質(zhì)譜裂解機(jī)制，為烏頭堿，尤其是生物樣品中的烏頭堿的快速定性和定量鑒別，提供了依據(jù)。

1 儀器與試劑

島津UPLC超快速液相色譜儀（島津公司，日本），AB SCIEX QTRAP 5500四級(jí)桿-離子阱質(zhì)譜儀（AB SCIEX公司，美國(guó)）。烏頭堿對(duì)照品（自制，含量＞98%），甲醇（美國(guó)Fisher公司），水為二次蒸餾水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試品溶液的制備

精密稱取烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品2.50mg，用甲醇定容在500mL容量瓶中，溶解后，稀釋100倍，制成濃度為50ng/mL溶液，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。

2.2 質(zhì)譜條件及分析方法

電噴霧離子化，正離子模式檢測(cè)；毛細(xì)管電壓：3.0kV；錐孔電壓：35V；碰撞誘導(dǎo)解離能量：15～25eV；離子源溫度：80℃；干燥氣溫度：150℃；質(zhì)量掃描范圍：m/z300～650；霧化氣（N2）流速：20 L·h-1；干燥氣（N2）流速：300L·h-1；碰撞氣為Ar；進(jìn)樣方式：蠕動(dòng)泵進(jìn)樣，流速7μL·min-1。

3 結(jié)果

在ESI正離子模式下，烏頭堿出現(xiàn)[M+H]+峰，m/z為646，選擇m/z646離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜的檢測(cè)，得到二級(jí)質(zhì)譜圖，見(jiàn)圖1。烏頭堿二級(jí)質(zhì)譜裂解為21種離子碎片，其中586，554，526，368離子強(qiáng)度較高，各離子檢測(cè)值、分子式見(jiàn)表1。

圖1 烏頭堿的二級(jí)質(zhì)譜圖

表1 烏頭堿的二級(jí)碎片離子

3.1 丟失CH3COOH、CH3OH、H2O的離子

由文獻(xiàn)報(bào)道[5-10]可知，烏頭堿最常見(jiàn)丟失的碎片離子是CH3COOH、CH3OH、H2O等。由圖1可見(jiàn)，二級(jí)碎片離子中以m/z586為基峰，丟失碎片為CH3COOH，其余二級(jí)碎片離子中有22個(gè)離子也丟失了CH3COOH。m/z614離子較烏頭堿m/z646少了32，符合[M-CH3OH]+，m/z554離子較m/z614少了60，符合[M-CH3COOH -CH3OH]+，m/z522離子符合[M-CH3COOH-2CH3OH]+，m/z490離子符合[M-CH3COOH-3CH3OH]+，烏頭堿結(jié)構(gòu)中有4個(gè)甲氧基，根據(jù)文獻(xiàn)[12]采用量子化學(xué)計(jì)算的結(jié)果認(rèn)為丟失的順序?yàn)镃16位、C1位、C6位，分別確定m/z586，614，554，522，490離子的結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖2。

圖2 m/z586，614，554，522，490離子的結(jié)構(gòu)

圖3 m/z596，568，536，504，472離子的結(jié)構(gòu)

圖4 m/z526，494，462，508，476離子的結(jié)構(gòu)

m/z596離子較m/z614少了18，丟失了一分子H2O，符合[M-CH3OH-H2O]+，m/z568離子較m/z646少了78，符合[M-CH3COOH-H2O]+，m/z536離子符合 [M-CH3COOH-CH3OH-H2O]+，m/z504離子符合[M-CH3COOH-2CH3OH-H2O]+，m/z472離子符合[M-CH3COOH-3CH3OH-H2O]+，烏頭堿結(jié)構(gòu)中C3位和C13位分別有2個(gè)羥基，可以丟失H2O，根據(jù)烏頭堿型生物堿的裂解規(guī)律和文獻(xiàn)[11]中的甲醇丟失順序，確定了m/z596，568，536，504，472離子的結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖3。

3.2 丟失CO的離子

烏頭堿在丟失CH3COOH后，形成C15位羰基的結(jié)構(gòu)，C15位羰基會(huì)發(fā)生縮環(huán)反應(yīng)，丟失一分子CO。m/z526離子較m/z554少了28，符合[M-CH3COOHCO-CH3OH]+，m/z494離子符合 [M-CH3COOH-CO-2CH3OH]+，m/z462離子符合 [M-CH3COOH-CO-3CH3OH]+。m/z508離子較m/z526少了18，丟失一分子H2O，符合[M-CH3COOH-CO-H2O-CH3CH3]+，m/z476離子符合 [M-CH3COOH-CO-2CH3OH-H2O]+，根據(jù)烏頭堿型生物堿的裂解規(guī)律和文獻(xiàn)中的甲醇丟失順序[11]，確定了m/z526，494，462，508，476離子的結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖4。

3.3 丟失C6H5COOH的離子

烏頭堿結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)酯鍵，C8位乙?；菀讈G失，C14位苯甲?；蝗菀讈G失，在CH3COOH、CH3OH、H2O等易失去基團(tuán)脫去后，苯甲酰基也會(huì)以苯甲酸的形式丟失。m/z404較m/z526少了122，符合[M-CH3COOH-CO-CH3OH-C6H5COOH]+，m/z372離子符合 [M-CH3COOH-CO-2CH3OH-C6H5COOH]+，m/z350符合[M-CH3COOH-3CH3OH-H2O]+，m/z400

較m/z522少了122，符合[M-CH3COOH-2CH3OHC6H5COOH]+，m/z368離子符合 [M-CH3COOH-3CH3OH-C6H5COOH]+，m/z354較m/z476少了122，符合[M-CH3COOH-CO-2CH3OH-H2O-C6H5COOH]+，m/z404，372，350，400，368，354離子的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5。

圖5 m/z404，372，350，400，368，354離子的結(jié)構(gòu)

4 結(jié)束語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)采用高靈敏度的串聯(lián)四極桿質(zhì)譜技術(shù)與快速掃描線性加速離子阱相結(jié)合的質(zhì)譜儀測(cè)定烏頭堿質(zhì)譜裂解，與以往報(bào)道相比，檢測(cè)出的碎片離子較多，在烏頭堿的二級(jí)質(zhì)譜中共檢出了21種離子碎片，主要發(fā)生了3種裂解途經(jīng)：丟失CH3COOH、CH3OH、H2O的離子；丟失CO的離子；丟失C6H5COOH的離子。其中，丟失C6H5COOH的離子的裂解途經(jīng)為首次報(bào)道。裂解途經(jīng)的完將會(huì)為二萜類生物堿的快速鑒定提供幫助。

對(duì)烏頭堿質(zhì)譜裂解機(jī)制的研究，有利于其結(jié)構(gòu)的分析、類似化合物結(jié)構(gòu)的鑒定和預(yù)測(cè)，在本論文完成的過(guò)程中，借鑒了用量子化學(xué)推測(cè)烏頭堿穩(wěn)定碎片離子的結(jié)果[12]，借鑒不同的技術(shù)輔助質(zhì)譜來(lái)推測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)已逐漸成為研究的熱點(diǎn)[13]。不同裂解機(jī)制特征離子碎片的發(fā)現(xiàn)，為烏頭堿在較低濃度下的快速定性和定量鑒別提供了依據(jù)，同時(shí)也為其他烏頭堿型生物堿的質(zhì)譜裂解機(jī)制研究提供參考。

[1]龐嶷，王進(jìn)忠，覃小蘭.誤服外用川烏草烏煎劑致心臟毒性[J].藥物不良反應(yīng)雜志，2009，11（1）：40-42.

[2]成洪，王錚.中西醫(yī)結(jié)合救治烏頭堿中毒24例[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2007，l6（11）：1415-1416.

[3]王瑞，劉芳，孫毅坤，等.不同附子炮制品中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿含量的HPLC測(cè)定[J].藥物分析雜志，2006（10）：1361-1363.

[4]劉芳，于向紅，李飛，等.HPLC測(cè)定附子及其炮制品中3種雙酯型生物堿的含量[J].中國(guó)中藥雜志，2006，31（14）：1160-1162.

[5]孫瑩，張宏桂，史向國(guó)，等.兔體內(nèi)烏頭堿代謝產(chǎn)物的研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2002，37（10）：781-783.

[6]劉永剛，劉倩，張宏桂，等.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法研究烏頭堿的水解產(chǎn)物[J].中國(guó)新藥雜志，2007，16（4）：303-305.

[7]Tan P，Liu Y G，Li F，et al.Reaction poducts analysis of aconitine in dilute ethanol using electrospray ionization[J].Die Pharmazie，2012（67）：274-276.

[8]譚鵬，劉永剛，關(guān)君，等.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合量子化學(xué)計(jì)算發(fā)現(xiàn)烏頭堿一新水解產(chǎn)物[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36（15）：2099-2101.

[9]Wang Y，Liu Z，Song F，et al.Electrospray ionization tandem mass spectrometric study of the aconitines in the roots of aconite[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2002，16（22）：2075-2082.

[10]包懿，宋鳳瑞，劉志強(qiáng)，等.烏頭堿類雙酯型二萜生物堿水解反應(yīng)的電噴霧質(zhì)譜分析[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2009，30（1）：1-5.

[11]李錚，譚鵬，王春國(guó)，等.烏頭堿中烏頭堿次烏頭堿及水解產(chǎn)物的電噴霧質(zhì)譜裂解機(jī)制研究[J].現(xiàn)代儀器，2011，30（1）：1-5.

[12]陳蘭慧，金蓮姬，蘇忠民，等.烏頭堿類生物堿電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜行為及碎片離子穩(wěn)定性的量子化學(xué)計(jì)算[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26（12）：2340-2344.

[13]Little J L，Williams A J.Identification of“known unknowns”utilizing accurate mass data and chemSpider[J]. Journal of The American Society for Mass Spectrometry，2012，23（1）：179-185.

Study on fragmentation behavior of aconitine by ESI-MSn

TAN Peng，DENG Xin-qi，LI Fei，WU Rui-guang，LONG Liu-juan，LIU Yong-gang
（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

To study the fragmentation pathways of aconitine by etectrospray ionization mass spectrometry（ESI-MS）.Aconitine was analyzed using ESI-MSn in positive ion mode.The first and multi-stage mass spectrum diagrams of aconitine were obtained.21 fragmentation ions were found，and they were classified into three kinds.C6H5COOH was firstly reported.These characteristics can be used for structures elucidation in studies of aconitum alkaloids in future.

ESI-QTRAP-MSn；aconitine；fragmentation behavior

R284.1；O657.7+2；O652.23；Q946.88

：A

：1674-5124（2014）01-0043-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2014.01.012

2013-04-12；

：2013-06-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30901959；81102807）北京中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生基金項(xiàng)目（201210026078）

譚 鵬（1980-），男，山東濰坊市人，講師，博士，主要從事中藥化學(xué)研究工作。