γ-氨基丁酸受體同源模建及與黃酮類化合物的分子對接

巨修練，錢 程

1.武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430074；2.綠色化工過程教育部重點實驗室(武漢工程大學)，湖北 武漢 430074

黃酮類化合物(如圖1)具有突出的抗焦慮效果，且不引起肌肉松弛、健忘等副作用.這些重大發現推動了對選擇抗焦慮，親和力高的配體研究.6-溴黃酮相對于黃酮對GABAA受體的苯二氮唑結合位點的親和力增加了近10倍[1].6-溴黃酮和GABAA的競爭結合參數是1.6～2.0(通過加入或不加入GABA時測量而得的6-溴黃酮和苯二氮唑結合位點的作用值比)，與地西泮很類似，具有完全激動劑的藥理學特征[2].當引入硝基時甚至會得到更有效的配體，6，3’ -二硝基黃酮與苯二氮唑位點結合力更強，其Ki值取值范圍為17～50 nmol/L，它具有極有效的抗焦慮和肌肉松弛作用.6-溴-3’-硝基黃酮相對于雙硝基類似物，對GABAA受體苯二氮唑結合位點的親和力稍有增加，對苯二氮唑位點同樣具有選擇性[3].這類化合物的抗焦慮作用盡管比6，3’-二硝基黃酮稍差，但仍比地西泮的抗焦慮作用強.由于黃酮類化合物藥理學選擇性及其自身對GABAA受體苯二氮唑結合位點的活性低，使得對其衍生物的研究有了一個很大的飛躍，同時也對GABAA受體苯二氮唑結合位點選擇性有了新的認識，促進了黃酮類化合物的發展.

本研究采用海兔乙酰膽堿結合蛋白(2XYS)作為模板，對人α1β2γ2 GABAA受體進行模建并能量優化，利用分子對接進一步指導研究.此外，從對接結果進行分析，發現黃酮類化合物的3’位對活性影響很大，且增多取代基團也會提高活性，進而為更好的設計黃酮類化合物提供了理論依據.

圖1 黃酮類化合物的基本結構Fig.1 Structure of flavonoid

1 實驗部分

本研究的所有計算實驗都是通過SYBYL-X1.2軟件(Tripos Inc.)完成，若無特別介紹，參數均采用缺省值.

1.1 人α1β2γ2GABAA受體同源模建

1.1.1 同源模建簡介 大多數受體蛋白的三級結構尚未解析，并且同源蛋白在進化過程中保持著結構保守性，利用同源蛋白作為模板來構建受體蛋白是一種有效的方法[4].常用的軟件有兩類：一是利用蛋白質分析軟件來預測，例如SWISS-MODEL主要用于預測蛋白質的高級結構，它通過同源建模的方法可對未知序列的三級結構進行預測；另一類是對蛋白的結晶進行X-衍射、核磁共振技術及冷凍電鏡等方法獲得結構信息，將已知的蛋白質立體結構為模板，利用相關軟件構建已知序列的蛋白高級結構，例如SYBYL, Discovery Studio，Modeller都是比較常用的軟件 .

1.1.2 同源模建a.序列選擇 為了模建目標受體人α1β2γ2GABAA受體，首先通過Swiss-Prot/TrEMBL數據庫篩選出合適的亞基序列：人α1亞基(蛋白質序列號：P14867)，β2亞基(蛋白質序列號：P47870)，γ2亞基 (蛋白質序列號：P18507)，然后對以上3種亞基進行編輯.考慮到所構建的受體在跨膜區，所以刪去膜內環區與膜外結合區域的氨基酸序列.

b.模板選擇 模板在同源模建中起關鍵作用，它直接影響靶結構的質量，并對結果起決定性作用[5].由于膜介蛋白晶體結構較難獲得，且當前結構解析技術直接決定了膜介蛋白結構的分辨率，因此已解析的三維結構膜蛋白數目十分有限.本實驗中，采用海兔乙酰膽堿結合蛋白作為模板(PDB登記號2XYS，0.194 nm)[6].

c.構建亞基 首先采用SYBYL-X1.2中的Biopolymer模塊中的compare sequences將靶標序列與模板序列進行比對(sequence alignment)，從而生成MSF (multiple sequence format)文件[7].然后再將Model Proteins中的ORCHESTRAR模塊中導入MSF文件，將模板結構與靶序列的三維結構進行結構比對.最后構建靶肽鏈的結構，包括搜索環區，識別結構保守區域(structure conserved regions，SCR)和添加側鏈.

d.模型組合 將人α1β2γ2受體與模板2XYS進行比對，需要將前者的α1亞基β2亞基γ2亞基分別疊合到2XYS為模板的各個亞基上,以順時針方向(β2)(γ2)(α1)(β2)(γ2)構建人α1β2γ2GABAA受體，如圖2所示.

圖2 人α1β2γ2 GABAA亞基對應示意圖Fig.2 Subunit of human α1β2γ2 GABAA

e.模型的優化與修正 因為只有運用分子動力學與分子力學的方法對受體進行修正，才能驗證受體的可靠性.因此，本實驗選取立體場AMBER7 FF99[8]，運用共軛梯度法優化體系能量梯度的RMS小于5 kcal/mol/nm，并通過分子動力學(molecular dynamic, MD)優化模型，以檢驗模型的穩定性.計算條件設置為300 K恒溫，每2.5 ps采樣一次軌跡數據，步長1 fs，計算總長為500 ps.

1.2 分子對接

1.2.1 對接方法 本實驗首先利用分子對接法將前面討論的黃酮類配體化合物與人α1β2γ2 GABAA受體蛋白對接.并結合打分函數，研究配體化合物與受體蛋白之間的相互作用，探究結合自由能與實測生物活性的線性關系，同時驗證模型的可靠性.

Surflex-docking[9]是SYBYL-X1.2中的一個模塊，可用于計算配體與受體之間的相互作用能，也可用于復合物的結構優化.本研究利用Surflex-docking進行分子對接實驗. 因為受體的結合口袋直接影響分子對接結果，所以定義結合口袋具有十分重要的意義[10].前文中同源模建人的α1β2γ2GABAA亞型，選用共晶的6-氟-3’-硝基黃酮作為活性區域，利用殘基模式定義活性結合位點. Surflex-docking模塊中，原型分子(protomol)即我們所稱的活性位點.此外，bloat與threshold這兩個參數直接影響原型分子的大小與形狀. 其中，Bloat影響原型分子滲入蛋白空隙的程度，Threshold影響原型分子的大小[11].

1.2.2 對接配體分子 通過SYBYL-X1.2軟件中的dock ligand模塊，41種黃酮類化合物(如圖7)對接到模建的α1β2γ2GABAA受體中.

Surflex-docking進行對接實驗后，分子配體的對接結果可通過Csorce模塊顯示.打分函數基于受體-配體復合物的結合親和力，將會考慮熵作用，極性作用，疏水作用，排斥作用，溶劑化作用.最后給出的總分即-lg10Kd，Kd為配體的解離常數.可通過以下函數計算配體與受體的結合自由能(Free Energy of Binding, kcal/mol):

Free Energy of Binding=RTlnK[12-13]

2 結果和討論

2.1 同源模建

將海兔乙酰膽堿結合蛋白與α1β2γ2進行序列比對，得到其同源性(Identity)分別為19.3%，19.6%和16.0%，由此可知：選取的2XYS作為人α1β2γ2亞基模型是比較合理的.將人α1β2γ2 GABAA受體與海兔乙酰膽堿結合蛋白進行序列比對，如圖3所示.

圖3 人α1β2γ2GABAA受體與海兔乙酰膽堿結合蛋白序列比對圖Fig.3 Result of sequence alignment between human α1β2γ2GABAA and aplysia californica nAChR

經過比對分子序列，搜索保守區域、構建疏水環區、添加分子側鏈、分子動力學優化后，得到人α1β2γ2 GABAA的二級結構，如圖4所示.

圖4 人α1β2γ2GABAA受體二級示意圖Fig.4 Secondary structure of human α1β2γ2GABAA

人α1β2γ2GABAA受體需要進行結構修正和能量優化.通過ProTable驗證受體模型的立體化學性質.人α1β2γ2GABAA的受體模型拉氏構象圖如圖5所示.

從以上拉氏圖可知，大量的氨基酸殘基聚集在值為-150度與-40度處，人α1β2γ2 GABA A受體模型中有96.76%的氨基酸殘基處于允許區域，驗證了模型的合理性.因此，實驗中模建的人α1β2γ2 GABAA受體模型是可靠的，可用作分子對接實驗.

利用SYBYL-X1.2的Dynamics模塊進行分子動力學模擬，人α1β2γ2 GABA A受體模型的動力學模擬能量-時間圖如圖6.經過分子動力學能量優化后，能量-時間圖里可知，α1β2γ2 GABA A受體模型在前300 ps能量變化較大，而后200 ps能量比較穩定，通過分子動力學實驗，也說明了該模型是可靠的[14-15].

2.2 分子對接

本實驗利用分子對接法將黃酮類化合物與人α1β2γ2 GABAA受體進行對接.通過上文軟件打分函數評價對接結果.

利用SYBY-X1.2軟件包中Surflex-docking模塊進行分子對接以及氫鍵，通過分子對接和打分函數的方法對打分函數進行評價，得到黃酮類化合物與人α1β2γ2 GABAA受體的對接得分，如表1所示.

表1 黃酮類化合物的對接得分Tabel 1 Docking result of Flavonoids

由于13號分子打分較高，且結構相似性較高具有代表性，故對其與人α1β2γ2 GABAA受體對接圖(圖7)，進行分析.

圖7 人α1β2γ2 GABAA受體與6-氟-3’-硝基黃酮對接圖Fig.7 Human α1β2γ2 GABAA docking with 6-fluoro-3’-nitro flavonoid

從上圖可知，13號分子3’位硝基的一個氧原子和氮原子作為氫鍵受體，與Arg97(精氨酸)側鏈上的亞胺上的氫原子形成氫鍵，為配體分子與受體結合提供了條件，同時也驗證了3’位對黃酮類化合物活性影響的重要性.而且從空間構象來看，13號分子的母環與Tyr190(酪氨酸)和Tyr140(酪氨酸)的苯環形成共軛，這樣能使體系的能量降低，分子穩定，也說明了所建模型的合理性.同時，從表1中可以發現，對比1號分子與9號分子，2號分子與10號分子，3號分子與11號分子，7號分子與13號分子可發現，當6位所連基團相同時，將3’位的氫原子替換成硝基時，對接打分明顯提高.同理可看出，將3’位替換為其他大分子基團時，對接打分也有所提高.且大部分化合物的對接打分與實測活性一致，也驗證了模型的可靠性.綜上所述，黃酮類化合物3’位對活性影響很重要.同時，38號化合物的高得分，可能與較多的取代基提高了與結合口袋的結合能力有關.

3 結 語

本研究通過同源模建人α1β2γ2 GABAA受體跨膜區的三維結構，并結合分子動力學優化和能量優化，驗證了所建模型的穩定性與可靠性.進而將41個黃酮類衍生物與該模型進行分子對接實驗，通過對接結果的分析，得知當母環3’位被取代時，分子活性有所增加，其中被硝基取代時，活性提高較大.并從38號化合物中得到提示，相應的增加取代基的個數，可能會提高活性，為設計黃酮類化合物提供了理論依據.

致 謝

本實驗基于武漢工程大學化工與制藥學院提供的計算平臺，在此表示感謝！

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