響應面法優化超聲提取葛根素工藝

邱 遠，芮 昕，謝翌冬，李 偉，陳曉紅，姜 梅，董明盛*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

響應面法優化超聲提取葛根素工藝

邱 遠，芮 昕，謝翌冬，李 偉，陳曉紅，姜 梅，董明盛*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

利用響應面法優化超聲提取葛根露酒中葛根素工藝。將葛根露酒進行超聲波處理，縮短葛根露酒的浸泡時間，對超聲波工藝條件進行優化，利用單因素試驗和響應面法對浸泡時間、超聲功率和超聲時間3個工藝參數進行優化。結果表明，最佳的工藝參數條件為：浸泡時間22 h、超聲功率120 W、超聲時間12 min，此條件下的葛根素浸出量可達89.6 mg/g。

葛根；葛根素；葛根露酒；超聲波；響應面法

葛根，又名野葛、甘葛、黃斤等，是豆科屬藤本植物葛的肥大塊根，廣泛分布在中國、日本、韓國等地，在我國已有6 000多年的栽培歷史[1-2]。葛根除了是常用的中藥藥材，而且還具有極高的營養保健價值。葛根素是葛屬植物所特有的黃酮類物質[3]，它又稱為葛根黃酮，全名8-β-D-葡萄吡喃糖-4’,7-二羥基異黃酮[4]。研究表明，葛根素能增強心肌的收縮力，保護心肌細胞[5-7]，降低血壓[8]，改善眼部血管微循環[9]，增強機體的造血功能[10]，對腎、心臟與肝臟具有一定的保護作用，還能夠抑制癌細胞的轉換[11]，增強學習記憶能力[12-13]，清除氧自由基和抗氧化性損傷[14-16]，降低血漿中兒茶酚胺的含量，調節一氧化氮合酶活性，提升體內NO水平[17]。

超聲波指的是頻率高于20 000 Hz的聲波，是一種機械振動的傳播過程，具有方向性好，穿透能力強等優點[18]?，F代社會中，超聲波被廣泛應用于金屬探傷[19]、水下定位、診斷疾病、工業生產[20]、環境保護、生物工程[21]等領域。超聲波提取是一種利用超聲波的機械振動與空化作用來促使植物的有效成分的浸出方法[22]。超聲波在機械振動的時候能夠產生傳遞能量，促使植物的有效成分加速進入溶劑中?？栈饔镁褪钱斠后w中在存在巨大的破壞力的時候，液體內部會形成空化泡的現象[23]。空化泡在破裂時將把泡內的能量全部釋放，產生瞬時的高溫和高壓，引起細胞壁的破壞，從而使得細胞內的物質直接浸出并與溶劑充分混合，提高物質的提出率[24]。研究表明，從黃芩[25]、槐米、山楂[26]、五加皮以及陳皮[27]等植物中提取黃酮類物質，使用超聲波提取之后，提取率都得到了巨大的提高。

將超聲波技術應用于植物各種成分的提取，必有廣闊的應用前景。超聲波提取法與諸多傳統的提取工藝相比，不僅顯著提高細胞物質的溶出速度、縮短提取的時間，而且提出率很高。我國葛根資源豐富，區域成本不高，具有數量優勢、質量優勢等經濟價值的優勢。目前，我國葛根開發的主要困難是缺乏先進的技術、產品形式比較單一。如將葛根與酒結合，不僅能發揮葛根與酒的各自的優點，更有利于中國酒文化在今后的發展。開發葛根藥酒對我國葛根資源利用率不高的現狀具有現實意義。葛根和藥酒在我國都具有很大的市場潛力，開發研制葛根酒，輔以超聲波提取技術，不僅為葛根，也為藥酒的現代化工業化提供了新的思路，具有十分廣闊的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根塊 江蘇省句容市中蘇容生態農副產品發展有限公司生態農業產業園；食用酒精 江蘇省味研食品有限公司；葛根素標準品（＞98%） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平 浙江凱豐集團有限公司；高效液相色譜儀 美國Agilent 技術公司；LRH-150型生化培養箱上海益恒實驗儀器有限公司；超聲波清洗儀 江蘇壘君達有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葛根露酒的提取

采用預實驗得到的提取葛根素的最佳條件為根與基酒的固液比為1∶25（g/mL），基酒為體積分數55%的食用酒精，然后進行超聲波處理，靜置一段時間后測定葛根素含量。

1.3.2 葛根素含量的測定

采用高效液相色譜法，色譜柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相A：甲醇，流動相B：水；洗脫條件：流動相A∶流動相B = 75∶25（V/V）；檢測波長：249 nm；柱溫：40 ℃；流速：0.8 mL/min；進樣量：20 ?L。

以葛根素標品做標準曲線，所得的回歸方程為y=107.1x＋364.6（R2=0.999）。y為葛根素標品峰面積；x為葛根素質量濃度/（μg/mL）。

1.3.3 單因素試驗

挑選外觀良好的、大小均勻的葛根塊，稱取4 g，加入100 mL的體積分數55%的食用酒精中，超聲功率140 W條件下超聲15 min，室溫浸泡24 h后測定其中葛根素的含量。固定其他條件，分別考察浸泡時間（4、8、12、16、20、24、48、72、96 h）、超聲功率（100、120、140、160、180、200 W）、超聲時間（5、10、15、20、25、30 min）對葛根素的含量的影響。每組試驗重復3次。

1.3.4 響應面試驗

根據單因素試驗結果，選取浸泡時間、超聲功率、超聲時間因素，以葛根素浸出含量為響應值，根據Box-Behnken試驗設計原理，設計3因素3水平響應面試驗，見表1，每組重復3次。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平及編碼Table 1 Factors and their coded levels used in Box-Behnken design

1.4 數據處理

采用Design Expert 7.0軟件處理，并進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 浸泡時間對葛根素浸出量的影響

圖1 浸泡時間對葛根素浸出量的影響Fig.1 Effect of soaking time on the extraction efficiency of puerarin

由圖1可知，超聲處理之后，在開始的24 h以內，葛根素浸出量隨著浸泡時間的延長而增加，24 h以后，葛根素的浸出量穩定，浸泡時間的延長不會引起葛根素浸出量的變化，故選擇24 h作為葛根露酒的浸泡時間。

2.1.2 超聲功率對葛根素浸出量的影響

圖2 2 超聲功率對葛根素浸出量的影響Fig.2 Effect of power of ultrasonic power on the extraction efficiency of puerarin

由圖2可知，葛根素浸出量隨著超聲功率的變化而變化，當超聲功率低于120 W時，葛根素未能夠浸提完全，而當超聲功率高于120 W時，葛根素浸出量隨著超聲功率的增加而減少。其原因可能是超聲功率過大引起葛根細胞里面一些分解葛根素的酶內物質浸出，從而引起葛根素浸出量的降低，故超聲功率的最后選擇為120 W。

2.1.3 超聲時間對葛根素浸出量的影響

圖3 超聲時 間對葛根素浸出量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on the extraction efficiency of puerarin

由圖3可知，葛根素浸出量隨著超聲時間的變化而變化，當超聲時間低于15 min時，葛根素浸出量隨著超聲時間的延長而增加，而當超聲功率高于15 min時，葛根素浸出量隨著超聲時間的延長而降低。結果分析原因可能是超聲時間過長，導致葛根細胞里面一些分解葛根素的酶內物質浸出，從而引起葛根素浸出量的降低，故超聲時間的最終選擇15 min。

2.2 響應面分析法優化葛根露酒的超聲提取工藝

2.2.1 Box-Behnken試驗設計及結果

根據三因素三水平的響應面試驗設計一共選擇試驗點17個，其中12個析因點、5個零點，方案與結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken design and experimental results

2.2.2 回歸模型的建立與顯著性分析

用Design Expert 7.0軟件對表2中的數據進行分析，得出3個影響因素與葛根素浸出量之間的二次回歸方程：Y=87.94-1.44A＋0.15B-7.16C-0.43AB-0.2AC-1.33BC-1.42A2-4.85B2-5.27C2。

從表3可以看出，模型的P值遠遠小于0.01，這說明該模型極顯著，與試驗擬合較好。本試驗中的決定系數R2=0.964 9，說明葛根素浸出量的結果與模型回歸值有著良好的一致性。模型校正系數R2Adj=0.919 8，說明試驗結果有91.98%受到所選因素的影響。失擬項F=0.142 7＞0.05，失擬項不顯著，說明該方程能夠充分反映實際情況。因此，此模型可以用來 預測超聲條件對葛根素浸出含量的影響?；貧w方程各項的方差分析結果表明，各因素對葛根素浸出量的影響次序為：超聲時間＞浸泡時間＞超聲功率。

表3 擬合二次多項式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

2.2.3 響應面分析

利用Design Expert軟件對表2的數據進行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應面及其等高線圖如圖4所示。從圖4a可以看出，隨著超聲功率的加強和浸泡時間的延長，葛根素浸出量先增高后降低；從等高線圖可以清楚的看出，浸泡時間所對應的等高線更陡，說明相對于超聲功率來說，浸泡時間的影響更顯著。圖4b、c表明隨著超聲時間、浸泡時間和超聲功率的延長，葛根素浸出量先增高后降低；超聲時間對葛根素浸出量的影響大于浸泡時間（圖4b），而超聲時間對葛根素浸出量的影響大于超聲功率（圖4c）。

圖4 兩因素交互影響響應面及等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots for the interactive effects of three process parameters on the extraction efficiency of puerarin

2.2.4 超聲工藝的優化組合及其驗證

根據Box-Behnken試驗設計所得結果和二次多項式方程，利用De sign-Expert軟件計算出最佳超聲工藝條件，葛根露酒的最佳超聲工藝條件為：浸泡時間22.1 h、超聲功率122.60 W、超聲時間11.56 min。為了便于操作，將以上條件參數做微小的修正：浸泡時間22 h、超聲功率120 W、超聲時間12 min。根據改修正的工藝條件，經過5次驗證實驗，葛根露酒的葛根素浸出量可以達到89.6 mg/g，與理論值相比，降低了1.28%，可見該模型較好的預測了實驗結果。

3 結 論

本實驗通過單因素試驗分析了葛根露酒生產過程中最佳的超聲波條件。采用Box-Behnken試驗設計與響應面分析，建立了超聲工藝的二次多項式數學模型。經過驗證實驗證明是有效的，能夠有效的預測葛根素浸出量。最后確定最佳的超聲工藝條件：浸泡時間22 h、超聲功率120 W、超聲時間12 min，在此條件下，葛根露酒的葛根素浸出量可以達到89.6 mg/g。

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Optimization of Ultrasound Extraction Process of Puerarin by Response Surface Methodology

QIU Yuan, RUI Xin, XIE Yi-dong, LI Wei, CHENG Xiao-hong, JIANG Mei, DONG Ming-sheng* (College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Kudzu root wine, made by soaking kudzu root in 55% food-grade alcohol was treated by ultrasound before being allowed to stand for a certain time to accelerate the extraction of puerarin. Three process parameters including ultrasound power, treatment time and subsequent soaking time were optimized by response surface methodology to be 120 W, 12 min and 22 h, respectively. Under these conditions, the amount of puerarin extracted from kudzu root was 89.6 mg/g.

kudzu root; puerarin; kudzu root wine; ultrasonic; response surface methodology

TS252.54

A

1002-6630（2014）06-0001-05

10.7506/spkx1002-6630-201406001

2013-07-11

國家自然科學基金面上項目（31371807）；國家自然科 學基金青年科學基金項目（31201422）；

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2011AA100903；2013BAD18B01-4）；國家農業科技成 果轉化資金項目（2012GB23600639）；江蘇省自然科學基金項目（BK2011651）；教育部博士點基金新教師類課題（20110097120028）；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目（PAPD）

邱遠（1990—），男，碩士，研究方向為中國傳統食品與功能性物質。E-mail：quincy0213@gmail.com

*通信作者：董明盛（1961—），男，教授，博士，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：dongms@njau.edu.cn