大粒車前子多糖酸水解產物的分析

胡海濤，王遠興*，張 娟，鄧 靜

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 3300 47）

大粒車前子多糖酸水解產物的分析

胡海濤，王遠興*，張 娟，鄧 靜

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 3300 47）

經水提、醇沉、Sevag除蛋白后得到精制大粒車前子多糖（Plantago a siatica L. polysaccharide，PLP），采用0.3 mol/L三氟乙酸對PLP進行部分酸水解。建立超高效液相色譜-蒸發光散射檢測器技術篩選較優水解條件的方法，同時運用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用法分析產物。結果表明：車前子多糖除蛋白后多糖 含量為68.56%。在水解溫度90 ℃、水解時間1.5 h條件下，能夠得到比較多的水解產物，經超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用分析鑒定，水解產物中含有單糖、二糖至 低聚六糖，并且存在戊糖和己糖相互連接的片段，但并未發現多個己糖相互連接的片段。

大粒車前子；部分酸水解；超高效液相色譜-蒸發光散射檢測器；超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用

車前子為車前科植物車前（Plantago asiati ca L.）或平車前（Plantago depressa Willd.）的干燥成熟種子[1]，被我國衛生部列為保健食品原料，也是我國傳統中醫用藥之一，具有清熱利尿、滲濕通淋、明目祛痰的功能[2]，車前子種皮外表細胞壁含有10%～30%黏液質，是一種親水性膠體，屬多糖類物質，是車前子中主要的有效成分，常被稱為車前子多糖或車前子膠[3]，據研究車前子多糖是一種部分發酵性膳食纖維，具有整腸通便[4]、降低血脂[5]、抗菌[6]等功能。

本實驗室對產自江西吉安的大粒車前子多糖進行了大量研究，例如，運用二次響應面法優化了車前子多糖提取工藝，獲得最佳提取工藝條件[7]，建立了一種準確測定車前子多糖的方法[8]，該多糖的主鏈是由β-1,4-木糖糖基相互連接，支鏈有β-末端-木糖糖基、α-末端-阿拉伯糖糖基、1,2,5-阿拉伯糖糖基、1,2-鼠李糖糖基等[9-10]，具有緩瀉[11]、抗氧化[12]、增強免疫[13-14]等功能。

多糖糖譜技術是將多糖進行水解后，結合色譜分析技術來研究其內部特征，Guan等[15]應用該技術成功的將9種不同的傳統中藥分離開來，隨后又應用到石斛[16]和蟲草[17]的研究當中，將8個不同產地的石斛和12個樣本的蟲草有效的分離開來，同時Xie Jing[18]、Wu Dingtao[19]等采用酶解、部分酸水解的方式有效的辨別出了多產地的靈芝資源，該技術有助于多糖的質量控制，然而車前子多糖在這方面卻未見詳細的報道。

車前子多糖主要是含有木糖和阿拉伯糖，糖環結構分別為吡喃環和呋喃環形式[20]。一般而言，支鏈的糖苷鍵較主鏈糖苷鍵易于水解，呋喃糖較吡喃糖易于水解[21]。因此，本研究采用較低濃度的三氟乙酸水解車前子多糖溶液，結合超高效液相色譜-蒸發光散射檢測（ultra performance liquid chromatography-evaporative light-scattering detector，UPLC-ELSD）以及超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用（ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）的方式解析多糖水解產物，旨在獲得更多水解產物的結構信息，為今后大粒車前子多糖糖譜的建立提供理論和數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大粒車前子 產地江西吉安；三氟乙酸、無水乙醇、無水甲醇、正丁醇、三氯甲烷（均為分析純）、乙腈（色譜級） 美國Honeywell公司。

1.2 儀器與設備

6538系列四極桿-飛行時間串聯質譜儀、1290 UPLC超高效液相色譜系統（配有蒸發光散射檢測器） 美國Agilent公司；ALPHA1-2型冷凍干燥機 德國Martin Christ公司；TU-1900型雙光束紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；EYELA N-1100旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司；KQ3200E型超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；AL 104型電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超純水儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的提取

稱取100 g車前子，加入12倍量的蒸餾水于100 ℃提取，離心過濾、收集濾液，重復1次，合并濾液后減壓濃縮至200 mL，加入乙醇至乙醇含量為80%（V/V），4 ℃靜置過夜，離心得沉淀。將沉淀用蒸餾水溶解后，再用Sevag法脫除游離蛋白質，透析（自來水48 h，蒸餾水24 h），透析液真空濃縮后于4 ℃醇沉過夜，離心分離得到濾渣，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗2次，冷凍干燥得車前子精制多糖（Plantago asiatica L. polysaccharide，PLP）。

1.3.2 多糖含量的測定

以木糖為標準對照物，采用苯酚-硫酸法[22]測定車前子多糖含量。

1.3.3 對照品UPLC-ELSD分析

精密稱取葡萄糖、D-阿拉伯糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖、蔗果三糖、水蘇糖、蔗果四糖、蔗果五糖9種標準品，用超純水定容至10 mL的容量瓶中，得到混合標準溶液（葡萄糖0.9432 mg/mL、D-阿拉伯糖1.5648 mg/mL、蔗糖1.126 9 mg/mL、麥芽糖0.975 6 mg/mL、麥芽三糖1.429 6 mg/mL、水蘇糖0.581 2 mg/mL、蔗果三糖（GF2）1.136 5 mg/mL、蔗果四糖（GF3）1.082 3 mg/mL、蔗果五糖（GF4）0.843 6 mg/mL），并對色譜條件進行選擇和優化。

1.3.4 部分酸水解

稱取30.0 mg PLP，用0.3 mol/L三氟乙酸于90 ℃條件下分別水解1.5、2.5、3.5、4.5 h，無水甲醇旋蒸，超純水復溶，透析過夜，收集袋外液組分PLP-X（X代表不同水解時間），0.22 μm濾膜過濾，用于UPLC-ELSD和UPLCQ-TOF-MS分析。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：Prevail Carbohydrate ES氨基色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：水（A）、乙腈（B）；梯度洗脫：0～15min，75% B；15～35min，75%～65% B；35～40min， 65%～75% B；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；ELSD的漂移管溫度40 ℃；霧化溫度45 ℃；載氣氮氣；流速1.3 L/min。

1.3.6 質譜條件

電噴霧離子源；負離子檢測模式；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速10 L/min；霧化氣壓力40 psi；毛細管出口電壓120 V；質量掃描范圍m/z 100～3 200。

2 結果與分析

2.1 多糖含量的測定

車前子多糖中木糖的含量較多，因此選用木糖標準品作其標準曲線，測得車前子多糖總糖含量為68.56%。

2.2 標照品的UPLC-ELSD分析及條件優化

圖1 9種標準品的UPLC-ELSD色譜圖Fig.1 UPLC-ELSD chromatogram of nine saccharide standards

從圖1可以看出，單糖和雙糖全部在0～15 min分離開，三糖出現在15～20 min，四糖出現在20～28 min，五糖則在30 min左右出現。

霧化氣體流量和漂移管溫度是影響目標峰響應值的2個重要因素，氣體流量決定形成液滴的大小，漂移管溫度決定蒸發量的大小[23]，本實驗對氣體流量和溫度進行了優化，發現響應值并無明顯的變化和規律，通過調整兩者的設定值、觀察基線的響應值、飄移值及信噪比變化情況，發現在當漂移管溫度40 ℃、霧化溫度45 ℃、載氣流量1.3 L/min條件下，色譜圖基線平穩，信噪比較小，滿足分析要求。

2.3 水解條件的優化

圖2 不同酸水解時間時車前子多糖的UPLC-ELSD色譜圖Fig.2 UPLC-ELSD chromatograms of Plantago asiatica L. polysaccharide hydrolyzed for different periods of time

由圖2可知，在0～10 min之間，每張譜圖中都有2個比較明顯的色譜峰，對比標準品譜圖（圖1），該峰出現在單糖區域之內，在戊糖和己糖的出峰位置，可知水解產物中有大量的單糖；隨著水解時間的延長，多糖水解出的低聚糖逐漸減少；水解到2.5 h時，峰2、3、5、6、8消失；水解到3.5 h時，峰4、7消失；當水解到4.5 h時，水解產物幾乎全部為單糖，可以得出隨著水解時間的延長，水解產物中的低聚糖逐漸裂解成單糖；當多糖水解至1.5 h時，能夠水解出一系列的低聚糖，比較明顯產物如峰1、4、7，可能為二聚糖、四聚糖和五聚糖，峰2、3、5、6、8由于水解出的量較少，在色譜圖上并不是十分明顯。為了更加深入了解水解產物信息，將PLP-1.5進行UPLC-Q-TOF-MS分析。

2.4 UPLC-Q-TOF-MS產物分析

采用上述質譜條件對PLP-1.5進行測定，所得總離子流圖如圖3所示，部分組分的質譜圖見圖4，各物質對應的峰號、保留時間、主要碎片信息和水解產物見表1。

圖3 PLP-1.5的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of PLP-1.5

表 1 各水解產物的保留時間和主要離子碎片Table 1 Retention times and major ion fragments of hydrolysis products in a negative ion mode

如圖3和表1所示，車前子多糖水解后產生一系列的單糖和低聚糖，水解產物中戊糖和己糖所產生的離子碎片與文獻報道一致[24]，戊二糖等其他低聚糖離子碎片為[M-H]-、[M＋Cl]-、[M＋COOH]-所結合的特征離子。單糖產物中戊糖比例很高，符合有關文獻[25]的報道；同時阿拉伯糖比木糖更易水解，推測戊糖中可能含有阿拉 伯糖和木糖；低聚糖多以戊糖與戊糖相連接，這與此前推測的一級結構相符合[9-10]，可能是由阿拉伯糖糖基與木糖糖基相互連接在一起；m/z 311.100 7[MH]-、347[M＋Cl]-、357.106 7[M＋COOH]-表明1個戊糖和1個己糖相互連接并脫去1個H2O所形成的低聚二糖，表明多糖的內部結構存在著這樣的重復片段，同時并未檢測出己糖相互連接所形成的碎片，推測在多糖支鏈上并不存在幾個己糖相互連接的片段。

圖4 不同保留時間色譜組分的質譜圖Fig.4 Mass spectra of different chromatographic fractions with various retention time

3 結 論

本研究建立了UPLC-ELSD法快速、準確分離9種單糖及低聚糖標品的方法，適用于多種單糖和低聚糖的檢測。運用所建立的UPLC-ELSD方法對多糖水解條件進行了篩選，采用0.3 mol/L三氟乙酸、水解溫度90 ℃、水解時間1.5 h條件，能夠得到較多的產物，為大粒車前子多糖糖譜的建立提供了方法支持。

采用超UPLC-Q-TOF-MS技術分析水解產物，確定水解產物中有己糖、戊糖、戊二糖至低聚戊六糖，同時存在戊糖與己糖相互連接的片段，但并沒有發現己糖相互連接大分子片段。由于多糖結構的復雜性，仍需對產物做更進一步的研究。

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Product Analysis of Plantago asiatica L. Polysaccharide by Acid Hydrolysis

HU Hai-tao, WANG Yuan-xing*, ZHANG Juan, DENG Jing
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Polysaccharides were isolated from seeds of Plantago asiatica L. by water extraction and ethanol precipitation, and subjected to protein removal by Sevag method, and then t he polysaccharide sample was hydrolyzed with 0.3 mol/L TFA by partial acid hydrolysis for different durations. An ultra performance liquid chromatography coupled with evaporative light scattering detection (UPLC-ELSD) method was established for establishing better hydrolysis conditions, and ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) was used for product analysis of samples under the optimal hydrolysis conditions. Results showed that the content of polysaccharides in the deproteinized sample was 68.56%. The optimal hydrolysis conditions were found to be hydrolysis with 0.3 mol/L TFA at 90 ℃ for 1.5 h. The hydrolysate obtained under these conditions contained more degradation products like monosaccharides and oligosaccharides, as identified by UPLC-Q-TOF-MS. Simultaneously, some pentose and hexose interconnected pieces in branch chains were also detected. However, multiple hexose connected pieces were not observed.

Plantago asiatica L.; partial acid hydrolysis; ultra performance liquid chromatography-evaporative lightscattering detector; ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry

TS207.3

A

1002-6630（2014）06-0060-05

10.7506/spkx1002-6630-201406012

2013-06-28

國家自然科學基金地區科學基金項目（31160321）

胡海濤（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品化學與分析技術。E-mail：153708927@qq.com

*通信作者：王遠興（1964—），男，教授，博士，研究方向為食品營養與衛生、食品化學。E-mail：yuanxingwang@ncu.edu.cn