氣相色譜-質譜法分析比較不同酵母發酵紅樹莓果酒的香氣成分

王家利，辛秀蘭，陳 亮，陶伯旭，張 丹，楊曉清,*

（1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.北京電子科技職業學院生物工程學院，北京 100029；3.西部鉆探克拉瑪依鉆井 公司，新疆 克拉瑪依 834000）

氣相色譜-質譜法分析比較不同酵母發酵紅樹莓果酒的香氣成分

王家利1，辛秀蘭2，陳 亮2，陶伯旭1，張 丹3，楊曉清1,*

（1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.北京電子科技職業學院生物工程學院，北京 100029；3.西部鉆探克拉瑪依鉆井 公司，新疆 克拉瑪依 834000）

以紅樹莓為原料，選取1 203、1399、SY、RW、F151、F1526 種果酒酵母進行發酵，通過頂空-固相微萃取法和氣相色譜-質譜聯用法分別對6 種果酒香氣成分萃取、鑒定、分析和比較。結果表明：6 種酵母發酵的酒液中共檢測出159 種香氣成分，分別為45、56、67、58、66、39 種，其中相同成分占13種。6種果酒中的主要香氣成分分別為乙醇、癸酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、癸酸乙酯、癸酸乙酯，含量依次為15.73%、22.05%、15.74%、18.38%、19.14%、15.24%。通過儀器測定和嗅聞感官綜合判斷，果酒酵母1399發酵的紅樹莓果酒香氣較好，適宜大眾口味。

紅樹莓果酒；頂空-固相微萃取法；氣相色譜-質譜聯用；香氣成分

紅樹莓是山莓的一種，又被稱為木莓、馬林、覆盤子等，是薔薇科懸鉤子屬植物[1]，屬于空心莓亞屬[2]。紅樹莓為多年生落葉灌木，適應能力強，抗病蟲能力強，并且抗旱、抗寒，在國際上樹莓有“世界水果之王”之美譽[3]。樹莓中含有大量超氧化物歧化酶（superoxide orgotein dismutase，SOD）、果糖、維生素、氨基酸、風味香醇等營養物質[4]，以及黃酮、類黃酮、白藜蘆醇等多種具有抗氧化作用的化學成分，其中鞣花酸含量高達325 μg/g[5-7]，VE、SOD、氨基丁酸等成分的含量高于其他野果[8]。釀制紅樹莓果酒不僅可以保留紅樹莓原有的營養物質，而且可以增加紅樹莓的附加值。紅樹莓果酒是以新鮮的紅樹莓果實為原料，經過破碎、榨汁、人工添加果酒酵母菌來進行發酵或浸泡，從而分解糖分、發酵產生酒精及其他副產物而制成的。果酒在發酵過程中，內部發生一系列復雜的生化反應，通過陳釀貯藏等可使酒香濃郁、色澤紅潤、酸甜可口，得到高質低度的飲料酒。果酒的品質不僅取決于釀酒果實的優質程度和生產工藝，對酵母也有要求，發酵穩定、性質突出的酵母能夠保證安全發酵，使酒香迷人，提高果酒的質量。房玉林等[9]選取同一種酵母、采用不同釀造工藝對樹莓干酒香氣成分進行了研究。而樹莓品種的多樣性也會影響酒的香氣成分，因此本實驗選用同一種紅樹莓果、6 種不同酵母、同一種工藝進行發酵，采用頂空-固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HSSPME）法和氣相色譜-質譜聯用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）儀對6 種酵母發酵后的果酒香氣成分進行鑒定，并結合感官評定，選取優良的釀酒酵母。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅樹莓由匯源果汁公司提供；果酒酵母1203和1399中國食品發酵工業研究院；果酒干酵母（SY和RW）安琪酵母公司；釀酒干酵母F151、F152北京電子科技學院生物技術系；果膠酶（2 000 U/g） 諾維信（中國）生物科技有限公司；其他試劑均為分析純 天津市華東試劑廠。

1.2 儀器與設備

JYZ-E6榨汁機 九陽股份有限公司；ZQTY-90恒溫搖床、DHP-9012恒溫培養箱 上海夕徽實驗儀器廠；附溫比重計 安徽省鳳陽縣玻璃廠；雷磁PHS-3C酸度計 上海楚柏儀器有限公司；AR2140電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；7890A氣相色譜儀、5975質譜儀 美國Agilent公司；固相微萃取裝置及50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母預處理

葡萄酒活性干酵母SY和RW：分別取1 g干酵母，在38 ℃、20 mL蔗糖溶液（5%，V/V）中復水15 min，然后在30 ℃溫度下活化1.5 h后即可使用。

果酒酵母1205和1399：將斜面釀酒酵母菌種放于28 ℃的恒溫箱中活化2～3 d，然接種至10 mL已滅菌的紅樹莓清汁（pH 3.5）中培養2～3 d，再將培養的酵母菌加入20 mL樹莓清汁（pH 3.5）中培養2～3 d，酵母活化3代后即可使用。

釀酒干酵母F151和F152：分別取1 g活性干酵母，在20 mL、35～40 ℃的蔗糖溶液（2%，V/V）中攪拌活化15 min，制得酵母活化液[10]。

6 種酵母活化液均按5%（V/V）的接種量分別接種于50 mL滅菌后的pH值為3.5的紅樹莓果汁中，25 ℃培養24 h。

1.3.2 工藝流程

原料經分選、清洗、破碎打漿處理后，進行酶解和殺菌作用，經過3代活化后的6 種酵母活化液均按5%（V/V）的接種。參照薛明等[11]對紅樹莓果酒的加工工藝，對果膠酶和K2S2O5的添加順序稍作改動。由于K2S2O5會影響酶解效果，所以先添加果膠酶進行酶解，再后加入K2S2O5。由于紅樹莓果皮中含有豐富的鞣花酸，可使果酒的營養更加豐富，因此采用帶渣發酵，省略分離除渣過程。原料經分選、清洗、破碎打漿處理后，添加果膠酶0.4%（V/V），50 ℃恒溫水浴保持2 h；滅酶：水浴80 ℃保持15 min；添加100 mg/L K2S2O5；采用2次加糖方法，第1次添加白砂糖至其質量濃度為200 g/L，當發酵過程中糖消耗一半時2次加糖，使糖質量濃度為136 g/L[12]；添加CaCO3調整酸度使紅樹莓果汁pH 4.0；將6 種酵母菌處理后制得的酒母按5%的接種量分別接種于100 mL滅菌的澄清紅樹莓果汁中，25 ℃發酵8 d，倒桶，14 ℃陳釀22 d，測定其香氣成分，對比分析各酵母發酵的紅樹莓果酒香氣成分。

1.3.3 果酒香氣成分分析

1.3.3.1 香氣物質的提取

取25 mL果酒樣品于50 mL頂空瓶中，按2.5 g 0.1 g/mL的NaCl，用聚四氟乙烯隔墊密封，45 ℃水浴30 min，將萃取針通過隔墊中間針孔插入頂空瓶中，調整并固定萃取頭在頂空體積中的位置，推出萃取針頭，針頭應懸于待測樣品上方，不得接觸樣品和瓶壁，頂空萃取40 min后，將萃取針插入GC-MS進樣口，解吸5 min[13]。

1.3.3.2 色譜條件[14]

色譜柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 ?m）；氣化溫度250 ℃；初始柱溫40 ℃；升溫程序：40 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至250 ℃，保持10 min；高純載氣（He）流速1.0 mL/min；進樣量1 μL；進樣口不分流。

1.3.3.3 質譜條件

電子電離源；離子源溫度240 ℃；電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；質量掃描范圍m/z 35～500。

1.3.4 定性、定量方法

采用蓋禹含等[14]對不同酵母發酵的藍莓酒香氣成分的測定方法，GC-MS測定出的總離子流色譜圖通過NIST 08數據庫分析，計算出各香氣成分相對含量。

1.3.5 感官評價方法

實驗中選出7名嗅覺感官評定員，在身體狀態良好、其他條件都相同的情況下對果酒進行評價[15]。評審員的培訓和要求參照GB/T 10220—2012《感官分析方法學總論》[16]，紅樹莓果酒的感官評價標準如表1所示。

表 1 紅樹莓果酒的感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of red raspberry wine

2 結果與分析

2.1 GC-MS分析

國內外有關葡萄酒的釀造工藝和香氣成分的分析研究報道較多[17-20]，對紅樹莓果酒工藝方面的報道也較多，但關于其香氣成分的測定還很少，陳娟等[21]采用溶劑萃取法對酒樣處理，測定十大桑葚果汁與發酵果酒香氣成分的變化規律，選用二氯甲烷作為萃取劑，醇、醚、酚、醛、酮、酯類、胺類物質可很快溶于二氯甲烷中，但采用萃取劑萃取測定的香氣成分的方法不穩定，有些微量的香氣成分也無法精確測出，所以本實驗采用頂空萃取法提取紅樹莓果酒中的香氣成分，測定的果酒香氣成分相對含量穩定、精確。6 種酵母發酵的果酒的香氣成分及其相對含量如表2所示。

表 2 不同酵母發酵的紅樹莓酒的主要香氣成分Table 2 Major aroma components of red raspberry wines fermented by different yeast starters

續表2

續表2

續表2

注：—. 未檢出；A～F分別代表果酒酵母1203、果酒酵母1399、活性干酵母RW、活性干酵母SY、活性干酵母F151、活性干酵母F152發酵而成的紅樹莓果酒。

2.2 不同酵母發酵的紅樹莓果酒中呈香物質的比較

香氣是構成果酒質量的重要因素之一。果酒中原果實的香氣構成果酒的一類香氣成分，果汁發酵期間由于酵母菌的繁殖代謝形成了醇酯類等揮發物質，芳香醇類、酯類、醛類會隨時間的延長而揮發減少，醇類的化學性質活潑，與羥基相連的碳原子容易被氧化成醛、酮、酸，而醛、酮、酸呈味不明顯，所以發酵過程中保留下來的香氣物質構成了果酒的二類香氣成分，對果酒香氣的形成具有更重要的作用[22-23]。

6 種酵母發酵的紅樹莓果酒中共檢測出醇類物質36 種、酯類54 種、酸類11 種、烷烴類25 種、醛類 5種、酮類6種、酚類4 種、萜烯類8 種、胺類5 種、苯環類2 種、其他3 種。

6 種果酒的香氣成分中醇類分別占A～F香氣成分總含量的35.87%、21.62%、32.15%、24.40%、17.94%、36.06%。其中共有的醇類只有乙醇、苯乙醇、3-甲基-1-丁醇3 種。酒中苯乙醇含量較高，僅次于乙醇含量，A、B、C、D、E、F 6 種果酒中苯乙醇相對含量分別為12.56%、6.35%、10.98%、7.28%、5.66%、6.96%。一般醇類物質都會有刺鼻的氣味，會給酒香帶來負影響，但苯乙醇不僅有一定的殺菌作用，而且有誘人的茉莉花香和玫瑰香，給人以柔和愉悅的感覺；3-甲基-1-丁醇具有青草、植物香氣，這種香氣能夠持久保持，常應用于食品工業和化工行業中[24]。A、C、F中醇類物質含量較高，其相應的酵母適宜發酵稍高酒精度的果酒，B和E為低酒精度數的果酒，并且呈香明顯，在果酒中能夠持久的保持。

6 種果酒中酯類物質分別占 相對含量的40.02%、67.82%、55.23%、63.05%、80.64%、44.34%，共有的酯類化合物是苯甲酸乙酯、壬酸乙酯、辛酸乙酯、9-甲基乙烷基-4-壬烯變酸酯（酒花中的一種酯類）、癸酸乙酯、十六碳烯酸乙酯。苯甲酸乙酯在酯類中占相對含量最高，具有濃烈的花香，并帶有水果的清香氣味[25]；辛酸乙酯略帶有玫瑰、橙子的花果香氣，是白蘭地酒特有的香味。B和E果酒中癸酸乙酯相對含量較高，分別是22.05%、19.14%，所以釀造B、E果酒的酵母也是較好的葡萄酒釀造酵母；C、D是分別由發酵紅葡萄酒和白葡萄酒常用的酵母發酵而成的果酒，其中癸酸乙酯是葡萄酒中重要的香氣成分。

6 種果酒中共產生11 種酸類物質，其中B～F共有的酸是辛酸，相對含量分別為0.34%、0.17%、0.14%、0.34%、0.29%。辛酸有辛辣的氣味，對果酒的口感影響較大。3-甲基戊酸是A中特有的酸，具有煙草香味，有刺鼻的酸澀感，因其相對含量僅為0.21%，所以對果酒中的酸澀感影響較小。

6 種果酒中共產生了3 種相同的烷烴類物質，分別為正十四烷、十五烷、十六烷，分別占香氣總成分的1.47%、1.59%、1.86%、1.14%、1.73%、0.86%。6 種果酒中產生的苯酚類、醛酮類、胺類和其他類物質中沒有共有的香氣成分，且相對含量很低。

6 種果酒中醇類、酯類香氣成分相對含量較高，對果酒香氣的影響起主要作用，烷烴類、醛類、酮類、酚類、萜烯類、胺類、苯環類和其他3種成分所占的相對含量較少，對果酒香氣影響較小。

2.3 不同酵母發酵的紅樹莓果酒感官評價

通過儀器測定分析能精確知道酒中的各香氣成分的相對含量，但很難判斷口感需求，所以對紅樹莓酒的香氣成分的鑒定不僅需要儀器的精確測定，還需要人體感官分析[26]。

表 3 不同菌種發酵的果酒感官評價表Table 3 Sensory evaluation of red raspberry fruit wines fermented by different yeast starters

由表3可知，B、E與C、D透明度的感官評分差異顯著；A、B、C、E香味感官與D、F差異顯著；A、B、D、E、F的口感風味與C差異顯著。6組果酒中B、E組總分較高，B酒感官評分達96.12，在6 種酒中分數最高，綜合以上香氣成分分析和感官分析綜合評價，果酒酵母1399發酵的果酒酒色清澈透明、色澤穩定、口感圓潤柔和、香氣持久迷人。

3 結 論

利用HS-SPME-GC-MS分析檢測，在1203、1399、SY、RW、F151、F1526 種果酒中共檢測出159 種香氣成分，6 種酵母發酵的果酒分別檢測出45、56、67、58、66、39 種。用色譜峰面積歸一化定量計算出各香氣成分的相對含量。分析可知，各種酒樣之間差別較大，6 種果酒中主要的香氣成分分別為乙醇、癸酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、癸酸乙酯和癸酸乙酯，相對含量依次為15.73%、22.05%、15.74%、18.38%、19.14%和15.24%。果酒中各香氣成分之間通過協同、抑制作用，使香氣成分出現變化而影響果酒的風味，通過儀器只能精確測定各成分的相對含量，但很難判斷口感需求，所以對紅樹莓酒的香氣成分的鑒定不僅需要儀器的精確測定，還需要人體感官分析。通過儀器測定和感官評價綜合分析，得出果酒酵母1399為6 種酵母中最優菌種，發酵后的各指標分數都較高。

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Comparative Analysis by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Aromatic Composition of Red Raspberry Wines Fermented by Different Yeast Starters

WANG Jia-li1, XIN Xiu-lan2, CHEN Liang2, TAO Bo-xu1, ZHANG Dan3, YANG Xiao-qing1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China; 2. College of Bioengineering, Beijing Polytechnic, Beijing 100029, China; 3. Karamay Drilling Company of Xibu Drilling Engingeering Company, Karamay 834000, China)

The aroma composition of red raspberry wines fermented by different wine yeast starters 1203, 1399, SY, RW,F151and F152was analyzed and compared by headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) and gas chromatographymass spectrometry (GC-MS). In total 159 flavor components were detected in 6 red raspberry wines, with 45, 56, 67, 58, 66 and 39 ones in the corresponding individuals and 13 ones common to them. The main aroma components of the 6 wines were alcohol, decanoic acid ethyl ester, octylic acid ethyl ester, decanoic acid ethyl ester, decanoic acid ethyl esterand decanoic acid ethyl ester with contents of 15.73%, 22.05%, 15.74%, 18.38%, 19.14% and 15.24%, respectively. Through instrumental analysis and sensory evaluation, it is concluded that raspberry wine fermented by wine yeast 1399 has an excellent aroma and is suitable for the pubic taste.

red raspberry wine; headspace solid-phase microextraction (HS-SPME); gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); aroma components

TS207.3；TS261.1

A

1002-6630（2014）06-0107-06

10.7506/spkx1002-6630-201406022

2013-01-08

公益性行業（農業）科研專項（201103037）；北京市屬高等學校人才強教深 化計劃項目（nyhyzx07-028）；科研基地-生物技術在制藥和農產品加工中的應用平臺建設項目（PXM2010_014306_109857）

王家利（1986—），女，碩士研究生，研究方向為小漿果深加工。E-mail：gali3316@126.com

*通信作者：楊曉清（1966—），女，教授，博士，研究方向為農產品加工與貯藏。E-mail：yxqnmg@hotmail.com