人工濕地去除三唑磷的生物學機制初步研究

馮玉琴，伍亮，吳娟，鐘非，代嫣然，成水平

同濟大學污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海200092

人工濕地去除三唑磷的生物學機制初步研究

馮玉琴，伍亮，吳娟，鐘非，代嫣然，成水平*

同濟大學污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海200092

構建了以陶粒為基質、種植美人蕉（Canna indica）的水平潛流人工濕地小試系統，研究了該人工濕地系統對水體中三唑磷（triazophos, TAP）的去除效果，通過測定基質酶脲酶和堿性磷酸活性、微生物種群特征及植物根系超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性，初步探討了該人工濕地系統去除水體TAP的生物學機制。實驗結果表明，在進水TAP濃度分別為0 mg·L-1（對照CW1）、0.1 mg·L-1（低濃度CW2）、1 mg·L-1（中濃度CW3）和5 mg·L-1（高濃度CW4）的條件下，人工濕地對水體中三唑磷具有良好的去除效果，去除率分別是96.4%、96.8%和53.7%。在進水TAP濃度越高的人工濕地系統中，進水端基質脲酶和堿性磷酸酶活性越高。中、高TAP濃度進水的系統中脲酶活性分別高于對照系統21.8%和29.2%。高TAP濃度進水的系統中堿性磷酸酶活性分別高于對照和低濃度進水系統51.7%和36.3%（p＜0.05）。比較進水端而言，各系統出水端的酶活性顯著降低（p＜0.05）。相關性分析結果顯示系統TAP的去除與基質中堿性磷酸酶活性呈顯著正相關（p＜0.05），表明基質中脲酶、堿性磷酸酶在人工濕地去除TAP過程中發揮重要作用。對各人工濕地系統基質中微生物進行分離純化，并通過16S rDNA基因測序，結果表明，進水含TAP系統的進水端基質中均存在能夠促進植物對氮磷營養元素的吸收以及與有機物降解密切相關的菌種，尤其在高TAP濃度進水的系統中發現一株含脫氨酶基因（acds）的菌株，能夠促進有機磷降解中間產物—有機胺類的降解轉化。此外，美人蕉根系超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性在進水TAP濃度升高的情況下，呈現顯著增強態勢（p＜0.05），并正常生長，說明美人蕉對TAP具有較好的抵抗能力。

人工濕地；三唑磷；美人蕉；微生物；酶活性

自二十世紀九十年代開始，有機磷農藥逐漸開始替代有機氯農藥廣泛應用于農業生產中，然而其中許多高毒性有機磷，如甲基對硫磷、對硫磷等因對環境具有嚴重的危害作用先后被禁用。三唑磷（Triazophos，TAP）作為一種中等毒性、廣譜有機磷殺蟲劑，以其低毒、殺蟲效果好、生產工藝簡單等優點，仍被大量應用于防治糧食、果樹以及蔬菜類農作物上的螟蟲、紅蜘蛛等害蟲等農業生產（Tang和You，2012）。但三唑磷同樣具有半衰期較長，且容易通過土壤滲透、地表徑流等途徑進入自然水體（Wang等，2005），造成的農藥面源污染等特性，因此亟需有效途徑對其污染加以控制。

人工濕地是一種利用基質、植物和微生物去除污染物的生態處理方法，具有能耗低、運行管理方便、污染物去除率高等優點，在處理農業面源污染方面發揮著巨大的作用（Kovacic等，2000； Ortega-Clemente等，2013）。通過充分優化水力停留時間、水生植物種植密度等，人工濕地可有效減弱農業灌溉尾水中擬除蟲菊酯對環境的危害（Budd等，2009）。人工濕地中基質粒徑、水生植物種類、菌群豐富度等因素會影響到有機磷降解效果（Agudelo等，2011），選擇適合的水生植物、控制基質種類和粒徑范圍、有效調控水利條件等可將有機磷的去除率提高至80%以上。

當前研究多偏重于運行工況對有機磷去除效果的影響研究，而對濕地系統內基質、植物及微生物對有機磷去除機理的研究甚少，從而不能為工程的實際應用提供具體的理論依據。且目前對人工濕地去除有機磷污染的研究對象多為氧樂果、甲基對硫磷等高毒性有機磷（(Karpuzcu等，2013)），而隨著三唑磷等中等毒性農藥的廣泛使用，如何利用人工濕地等生態工程削減其面源污染的研究也急需

展開。有研究報道了水培條件下的美人蕉可積極響應三唑磷的脅迫（Cheng等，2007），進一步研究也表明美人蕉可促進根系微生物的生長及群落結構的形成，從而實現三唑磷的有效去除（Xiao等，2010），但并未將美人蕉應用于實際的人工濕地系統中對其去除效果和生理響應做深入研究。本研究旨在探討種植美人蕉的水平潛流人工濕地去除水體中三唑磷的生物學作用機制，重點研究植物與微生物在吸收、降解三唑磷過程中的生理學響應及種群變化。通過測定基質微生物的脲酶和堿性磷酸酶（ALP）（Michela等，2012），細菌分離純化法鑒定基質微生物優勢種群并進行16S rDNA基因序列測定，初步解析人工濕地去除三唑磷的微生物學機制（Wang等，2012）；同時測定美人蕉（Canna indica）根系抗氧化酶活性，了解人工濕地中美人蕉對三唑磷的響應及抗性。

1 材料與方法

1.1 人工濕地小試系統與運行方式

實驗系統為四組水平潛流人工濕地，長×寬×高：1200×400×800 mm；濕地主體填充粒徑1～3 mm的人工陶粒，進水腔填充粒徑3～8 mm的石英砂（圖1）。濕地植物為美人蕉（Canna indica），種植密度為20株·m-2。濕地進水采用人工配水，且為連續進水，其中進水化學需氧量（COD）為41～82 mg·L-1，總磷（TP）濃度為0.14-0.71 mg·L-1，總氮（TN）濃度為2.05-3.51 mg·L-1；進水三唑磷濃度分別設置為0，0.1，1，5 mg·L-1，對應濕地系統編號為CW1、CW2、CW3、CW4，水力負荷為200 mm·d-1。三唑磷純品由強生（上海）化學試劑有限公司提供。人工濕地穩定運行半年后，于2013年4、5、6月進行了各項測試。

1.2 三唑磷凈化效果測定

進行了測定利用固相萃取-高效液相色譜聯用法（SPE-HPLC）分別測定濕地系統進水端和出水中三唑磷濃度。檢測條件為流動相，甲醇：超純水=80：20（V：V）；流量1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長246 nm；進樣量10 μL；保留時間5.7 min。三唑磷濃度采用峰面積法計算。三唑磷去除率計算公式如下：

式中，R為去除率，C0為進水濃度，Ct為停留48 h后出水濃度。

1.3 基質酶活性測定

分別從濕地進水端10～15 cm處和出水端10～15 cm處取適量植物根區基質（深0～10 cm），測定其脲酶和堿性磷酸酶（ALP）活性。測定方法分別為奈氏比色法（Kandeler和Gerber，1988）和磷酸苯二鈉比色法（陳永華等，2009）。即將所取樣品充分混合，從中稱取5 g，手動去除植物根系等雜物，然后經前處理后在37 ℃條件下培養24 h和2 h，再經過濾、顯色，由標準曲線求得脲酶和ALP活性（Ge等，2011）。

1.4 基質微生物種群特征分析

取濕地進水端10～15 cm處和出水端10～15 cm處取適量表層根區基質（深0～10 cm），采用細菌分離純化法對微生物優勢種群進行鑒定，對分離菌株進行16S rDNA基因序列測定（Joseph和David，2012）。具體方法：將適量基質置于無菌生理鹽水中經震蕩、稀釋得到懸液；分別取懸液100 μL 在伊紅美蘭培養基、營養瓊脂培養基、水解酪蛋白、WS四種培養基上進行涂布，28 ℃條件下培養過夜；挑取單菌落，接種到營養肉湯中并在28 ℃、200 r·min-1振蕩條件下過夜培養，清除雜菌；最后將純培養的細菌離心管送至上海杰李公司測序。細菌測序使用通用引物1492 R和27 F進行正反測序，測序結果通過軟件拼接而成。

1.5 濕地植物根系抗氧化酶活性測定

分別從四組人工濕地表層（0～5 cm）根系取美人蕉新生根根尖樣品，取樣點分別為樣點1-5（圖1）。超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）測定預處理方法：取適量根系樣品（平行樣n=3）加入預冷酶提取液（0.05 mol/L pH 7.8的磷酸緩沖液PBS），冰浴研磨至勻漿，在4 ℃、10000 r·min-1條件下低溫離心15 min，上清液即為粗酶液。SOD的測定采用氮藍四唑（NBT）光化還原法（Beauchamp和Fridovich，1971），以抑制NBT光化還原的50 %為一個酶活性單位表示。POD的測定采用愈創木酚方法（Hammerschmidt等，1982），取適量酶液與底物愈創木酚和H2O2發生反應，以1 min內吸光度（OD）增加0.01所需的酶量為一個酶活單位，紫外分光光度計測定POD的活性。

表1 濕地系統進出水TAP濃度及去除率Table 1 Concentrations and removal rates of TAP in the four constructed wetlands

1.6 數據分析

運用SPSS17.0對各測定變量進行單因素方差分析（One-way ANONA），不同處理組兩兩差異比較通過Duncan和LSD檢驗。三唑磷的去除與基質酶活性的關系采用皮爾森（Pearson）相關性分析。基質微生物測序所得代表序列在國家生物技術信息中心（National centre of biotechnology information, NCBI）上BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）進行相似性序列比較。并將序列提交至NCBI數據庫，獲得相應的GenBank序列號。

2 結果與分析

2.1 濕地系統進出水TAP濃度

人工濕地實際進出水三唑磷濃度見表1。經過濕地系統中陶粒吸附、微生物降解以及植物的吸收降解作用，低濃度系統CW2和CW3出水三唑磷含量明顯低于進水中三唑磷含量，去除率分別為96.4%、96.8%（表1）。而高濃度進水的CW4系統中三唑磷去除率僅為53.7%，顯著低于CW2和CW3系統（p＜0.05）。

2.2 基質脲酶和堿性磷酸酶活性

如圖2（1）顯示，隨著進水三唑磷濃度的增加，四組人工濕地的進水端微生物脲酶活性呈依次上升趨勢，CW2、CW3、CW4系統進水端脲酶活性分別高出CW1系統19.7%、21.8%和29.2%。其中，CW3和CW4與對照系統差異顯著（p＜0.05），表明三唑磷的加入對脲酶分泌產生了顯著影響。另外方差分析結果還顯示，添加三唑磷的三組系統進水端脲酶活性與相應出水端以及對照組進水端的脲酶活性都存在顯著性差異（P＜0.05）。而在出水端，CW2、CW4脲酶活性顯著高于CW1、CW3（p＜0.05）。

從圖2（2）可以看出，同脲酶規律類似，隨著進水三唑磷濃度的增加，四組人工濕地系統的進水端微生物ALP活性同樣呈上升趨勢，CW2、CW3、CW4系統進水端ALP活性分別高出對照系統11.3%、23.0%和51.7%。其中，高濃度系統CW4顯著高于系統CW1、CW2（p＜0.05）。此外，四組系統出水端的ALP活性相對于進水端，分別降低了25.9%、28.8%、41.6%、53.1%。其中，三組添加三唑磷的濕地系統中，出水端ALP活性均與其進水端差異顯著（p＜0.05），但四組系統之間差異不顯著。且三唑磷的去除與濕地系統中ALP活性呈顯著正相關（Pearson指數=0.995）。

2.3 微生物種群特征分析

16s DNA測序共得到23條有效序列，均屬于假單胞菌屬。對所得結果進一步分析發現，在添加三唑磷系統的進水端均出現了能夠促進植物對磷的吸收以及與有機磷降解可能相關的菌株。其中，從CW2中分離得到的042402WS-1（KF803181）與Pseudomonas sp. SF4c的相似性較高（99%）。Fischer等人（Fischer等，2006；2010）發現此菌株能以1-氨基環丙烷-1 -羧酸為單一氮源，分泌鐵載體-吲哚乙酸底物，以此促進磷酸鹽在土壤中的水溶性，有助于植物的對氮磷營養元素的吸收；從CW3進水端分離得到的042407NA-1(KF803178)則與熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens Pf0–1的同源性較高（99%），該菌種在無機磷缺乏的條件下能夠分泌堿性磷酸酯酶，從而使有機態磷易于轉化為無機態，便于自身或其它共生生物的吸收（Monds等，2006）；而CW4進水端分離得到的042406SL-1（KF803180）菌株與Pseudomonas veronii gene strain: nBP2、Pseudomonas veronii gene strain: nBP5和Pseudomonas veronii gene strain: MT4具有99%的相似性。Pseudomonas veronii屬于熒光假單胞細菌屬，目前研究表明Pseudomonas veronii能夠凈化被污染的土壤，對芳香族有機污染物具有一定的降解作用；與CW4進水端另外分離得到的042405WS-1菌株相似度較高的菌種有Pseudomonas sp. SaCS17、Pseudomonas fluorescens strain CLW17等。Pseudomonas sp. SaCS17中含脫氨酶基因（acds），能夠促進有機胺類的轉化，該基因所表達的脫氨酶在根際促生菌中廣泛存在，能夠分解乙烯前體以提高植物在逆境脅迫下的適應能力（Janette等，2009），而Pseudomonas fluorescens strain CLW17是從一種的溶磷細菌，能夠通過分泌酸性物質等改善植物根區對磷的吸收，對植物的生長有明顯的促進作用（任嘉紅等，2012）。

2.4 植物根系抗氧化酶活性

圖3（1）為濕地系統中美人蕉根系SOD隨三唑磷降解的沿程變化。進水三唑磷濃度越高，濕地美人蕉根系SOD活性越高。此外，各濕地系統中植物根系SOD活性呈現不同的沿程變化趨勢。其中，對照系統CW1中，SOD活性一直處于較低狀態；進水濃度為0.1 mg·L-1的CW2系統SOD活性由進水端至出水端整體呈現下降趨勢，但變化不明顯，出水端的SOD活性比進水端僅低18.3%；而CW3和CW4中SOD活性沿程的下降趨勢相對較

明顯，出水端SOD活性比進水端分別降低了38.1%和32.4%。方差分析結果顯示，各濕地系統之間SOD活性存在極其顯著差異（p＜0.01）。為了進一步深入探討不同濃度三唑磷在濕地中沿程變化情況，我們對不同濕地系統相同位點的SOD活性進行分析發現，CW4系統中SOD活性在所有樣點均顯著高于對照組和CW2系統；CW3系統SOD活性僅在樣點1、2和5處顯著高于對照組和系統CW2。

圖3（2）為4～6月份濕地系統中美人蕉根系過氧化物酶POD活性隨三唑磷降解的沿程變化情況。由圖可以直觀看出，同樣進水三唑磷濃度越高，濕地美人蕉根系POD活性越高，即CW4（5 mg·L-1）＞CW3（1 mg·L-1）＞CW2（0.1 mg·L-1）＞CW1（0 mg·L-1）。且隨三唑磷在系統中的降解，在進水濃度不同的濕地系統中，POD活性呈現不同的變化趨勢。對照系統CW1中，POD活性一直處于較低水平，且變化不明顯；而實驗組CW2、CW3和CW4中，POD活性除在濕地后半部分（樣點4）有小幅上升外，沿程整體均呈顯著下降趨勢，出水端（樣點5）的POD活性相較于進水端（樣點1），分別降低了26.3%、29.9%以及33.9%。通過比較不同濕地系統，發現各濕地系統之間的POD活性均存在極其顯著差異（p＜0.01）；而比較不同濕地系統相同位點的SOD活性發現，在進水端（樣點1），實驗組濕地系統與對照組差異最為明顯，且四組濕地系統POD活性差異極其顯著（p＜0.01）。此外，CW4在濕地前端（樣點2處），POD活性顯著高于其它三組濕地系統（p＜0.05）。

圖2 濕地系統基質酶活性Fig.2 Enzyme activities in different constructed wetlands

圖3 美人蕉根系抗氧化酶活性沿程變化情況（1） SOD活性 （2） POD活性Fig.3 Variations of antioxidant enzyme activitys in Canna roots along the flow in wetland

3 討論

在濕地系統中，脲酶是與氮元素循環密切相關的酶，主要作用于尿素的水解使其轉變為氨。一般情況下，脲酶的活性與基質中的微生物含量、有機物質含量、全氮和速效氮含量成正相關（Kang等，1998），有研究表明濕地基質的脲酶活性與TN去除率有較好的相關性，可以把人工濕地根區基質中脲酶的活性作為人工濕地去除污水中含氮污染物效果的一個主要指標（吳振斌等，2001）。本研究中，當進水中含有三唑磷時，濕地系統微生物脲酶活性

受三唑磷影響而明顯升高，特別是進水端（圖2）。說明濕地中微生物能夠以三唑磷為底物，并通過脲酶分泌量的增多來降解其水解中間產物——尿素（Liang等，2011）。此外，高濃度進水系統中，脲酶的活性沒有隨進水三唑磷濃度的顯著增加而呈現明顯的升高現象，這說明濕地微生物脲酶活性已接近最大值。磷酸酶能促進有機磷化合物水解，在生態系統P元素循環與周轉中發揮著重要作用（Newman等，2003）。在土壤中，ALP活性與微生物的豐富度呈正相關，表明微生物是ALP的主要貢獻者（Rani和Juwarkar，2012）。本研究中，隨著進水三唑磷濃度的增加，濕地系統的進水端ALP活性同樣呈上升趨勢，說明系統中的微生物可根據進水三唑磷濃度分泌適量的ALP用于有機磷的轉化降解。但與脲酶情況不同的是，在高濃度三唑磷系統中，進水端ALP活性隨三唑磷濃度的增加呈顯著升高現象，這表明濕地系統微生物ALP分泌量可能還有存在一定上升的空間。此外，出水端不論是脲酶還是ALP，其活性均遠低于進水端，且各系統間差異并不明顯，這可能與出水端水體營養鹽不足，以及相應植物生長狀況較差有關。

濕地基質微生物分離純化及測序結果表明，對照組與三個實驗組的微生物群落組成有一定的差異。實驗組中存在與有機物降解相關的菌種，CW4中的042405WS-1菌株與含脫氨酶基因的Pseudomonas sp. SaCS17的有較高的相似性（99%），而已知的三唑磷降解過程中會產生有機胺類中間產物，表明042405WS-1菌株可能與三唑磷的降解直接相關。目前未發現其他菌株對有機磷存在專性降解作用，但發現的大部分菌株都與甲苯、烷基酚等有機污染物的降解密切相關，它們在三唑磷降解過程中的作用仍需進一步深入研究。

在正常情況下，植物組織中活性氧的形成和清除之間保持一種動態平衡，當植物遭受環境因子脅迫時，這種平衡被破壞，自由基積累，引起植物細胞水平的氧化傷害（Foyer和Noctor，2000）。SOD和POD是植物的兩種重要抗氧化酶，能清除氧化物自由基，從而避免其對植物膜質的破壞作用。在本研究中，進水添加三唑磷的濕地系統中SOD和POD活性顯著高于對照組（p＜0.05），表明在三唑磷脅迫下，美人蕉本身的防御機能和抗逆性生理活動被刺激加快，通過SOD和POD活性提高以減弱活性氧的傷害。而三個實驗系統之間美人蕉根系的SOD和POD活性同樣存在極其顯著差異（p＜0.01），說明美人蕉根系抵抗三唑磷的脅迫能力隨三唑磷濃度的升高而增強。特別在濕地前端，三唑磷未被植物和微生物吸收降解，導致四組濕地系統在采樣點1處的SOD和POD活性均存在極其顯著差異（p＜0.01）。而隨著三唑磷在人工濕地中的降解，脅迫作用逐漸降低，不同單元的SOD和POD活性呈不同程度下降趨勢。值得注意的是，在三唑磷濃度較高的情況下（5 mg·L-1），植物根區SOD和POD作為抗氧化酶系統的防線仍保持較高的活性，說明美人蕉對三唑磷具有較高的抗脅迫能力。

4 結論

1）種植美人蕉的水平潛流人工濕地系統對受三唑磷污染的水體具有一定程度的凈化作用，對低濃度三唑磷（TAP）污染有較好的去除效果。

2）三唑磷濃度會影響系統中尤其是進水端微生物脲酶和堿性磷酸酶的分泌，表明長期運行下的系統中微生物能夠通過調節與三唑磷去除密切相關的酶實現對三唑磷的有效降解。

3）不同的三唑磷進水濃度會對系統的微生物群落組成產生明顯的影響，持續運行的系統中微生物得到充分選擇與馴化，能夠分離出與三唑磷降解相關的菌種。

4）濕地植物美人蕉在一定范圍內其抗氧化性隨三唑磷濃度的升高而增強，對三唑磷具有較高的抗脅迫能力，能夠實現對三唑磷的有效吸收和降解。

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Primary study on biological mechanism of removing triazophos by constructed wetland

FENG Yuqin, WU Liang, WU Juan, ZHONG Fei, DAI Yanran, CHENG Shuiping
State Key Laboratory of Pollution Control and Resources Reuse, Tongji University, Shanghai 200092, China

Four horizontal subsurface constructed wetlands (HSCWs), which were filled with ceramsite and planted with Canna indica, were constructed. The removal efficiencies of triazophos (TAP) by HSCWs were determined. The enzyme activities of urease and alkaline phosphatase (ALP) and population characteristic of microorganism in the medium and the superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) in root of C. indica were investigated to discuss the biological mechanisms in the process of removing TAP. Under the inflow concentration of TAP were 0 mg·L-1(CW1, control), 0.1 mg·L-1(CW2, lower concentration), 1 mg·L-1(CW3, medium concentration) and 5 mg·L-1(CW4, higher concentration), the removal percentages of TAP were 96.4%, 96.8% and 53.7% in CW2, CW3 and CW4, respectively. The activities of urease and ALP in the medium of the inlet section of CWs went up along with the increasing of inflow TAP. The urease activities in CW3 and CW4 were significantly higher than that in the control (CW1) with 21.8% and 29.2% (P＜0.05), respectively. While ALP activity in CW4 was significantly higher than those in CW1 and CW2 with 51.7% and 36.3% (P＜0.05). respectively. Compared to these in inlet section of HSCWs, the activities of these two enzymes decreased significantly in the outlet section of HSCWs (P＜0.05). Correlation analysis indicated that there was significant positive correlation between TAP removal percentages and ALP activities in the HSCWs (P＜0.05). These results suggested that urease and ALP play important roles in removing TAP in the HSCWs. By 16S rDNA gene sequences detection, some special microorganisms were isolated from the medium in the inlet section of the HSCWs treated with TAP, which could affect the nitrogen and phosphorus adsorption of plant and the degradation of organic phosphorus. It was notable that a bacterial strain containing deaminase gene (acds), capable of degrading organic amines, was isolated and identified from the higher TAP concentration inflow HSCW. Additionally, with the increasing discharge of TAP, the activities of SOD and POD in the root of C. indica increased and showed significant differences (P＜0.05) in the four HSCWs. These indicated that C. indica owns the ability to resist TAP.

constructed wetland; triazophos; Canna indica; microorganism; enzymes activity

X17

A

1674-5906（2014）05-0853-06

國家自然科學基金（51278355）；污染控制與資源化研究國家重點實驗室（PCRRY11007）

馮玉琴（1989年生），女，碩士研究生，主要從事人工濕地技術研究。E-mail：yqffeng@163.com

*通訊作者：成水平（1969年生），男，教授，主要從事生態工程技術研究。E-mail：shpcheng@tongji.edu.cn

2014-01-08

馮玉琴，伍亮，吳娟，鐘非，代嫣然，成水平. 人工濕地去除三唑磷的生物學機制初步研究[J]. 生態環境學報, 2014, 23(5): 853-858.

FENG Yuqin, WU Liang, WU Juan, ZHONG Fei, DAI Yanran, CHENG Shuiping. Primary study on biological mechanism of removing triazophos by constructed wetland [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2014, 23(5): 853-858.