納米TiO2對耕作紅壤土壤微生物活性的影響

劉啟明，吳澤恩，朱藝貞，曹英蘭，焦玉佩,，曹馨

1. 集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2. 中國科學院城市環境研究所，福建 廈門 361021

納米TiO2對耕作紅壤土壤微生物活性的影響

劉啟明1，吳澤恩1，朱藝貞1，曹英蘭1，焦玉佩1,2，曹馨1

1. 集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2. 中國科學院城市環境研究所，福建 廈門 361021

作為最為常用的納米材料，納米TiO2潛在的生態環境負面效應已日漸引起重視。土壤微生物活性是土壤微生物群落生長狀況的整體表現，是反映土壤污染、表征土壤質量、衡量土壤生態系統管理措施和擾動變化的敏感指標。本研究將納米TiO2均勻混合于耕作土壤，以土壤—納米TiO2—微生物體系為研究對象，通過對耕作紅壤的現場實驗，綜合土壤微生物菌落數、呼吸強度和蛋白酶活性等參數，較為真實的反映了納米TiO2對土壤微生物活性的影響。數據表明，在整個90 d的試驗周期內，空白對照土樣土壤微生物菌落數變化范圍是3.59～3.92 CPU（107·g-1）、土壤呼吸強度變化范圍是0.49～0.61（mg·g-1）、土壤蛋白酶活性變化范圍是0.068～0.081（mg·g-1）。耕作紅壤摻雜不同劑量（0.1、0.2、0.5、1、3 mg·g-1）納米TiO2后，土壤微生物菌落數、呼吸強度和蛋白酶活性等參數均低于空白對照土樣，說明土壤微生物活性受納米TiO2抑制，且納米TiO2劑量越大，抑制作用越明顯。研究結果對綜合評判人工納米材料的生態環境效應可提供數據支撐。

納米TiO2；紅壤；微生物活性

納米材料是指在三維空間中至少有一維幾何尺寸在納米尺度（1～100 nm）的材料, 因其具有獨特的理化性質，如小尺寸效應、大比表面、極高的反應活性、量子效應等，納米材料已在生產、生活各領域中均有廣泛的應用。自2003年以來，關于納米材料的潛在生物毒性、是否會對生態環境產生影響以及影響的程度如何等問題已日漸引起重視（Service, 2003；Maynard，2006；Nel等，2006）。目前較多的工作集中在納米材料對單一生物或體內細胞的毒理學實驗室內研究方面，對于綜合性的生態環境效應如微生物群落結構及功能方面的野外實踐研究相對較少（林道輝等，2009；Sharifi等, 2012；Lewicka和Colvin，2013; Gardea-Torresdey等, 2014; Fajardo等, 2014）。

納米TiO2是最為常用的納米材料之一，在環保、醫療、涂料、汽車等各行業領域均有廣泛應用。近年來，隨著納米包膜肥料、納米土壤改良劑、TiO2光合作用促進劑等在農業生產中的規模化使用，納米TiO2進入土壤的機會和數量與日俱增，已不可避免的造成土壤生態系統的暴露（Ge等, 2011; Du等, 2011; Kim等, 2012）。土壤微生物活性是土壤微生物群落生長狀況的整體表現，是反映土壤污染、表征土壤質量、衡量土壤生態系統管理措施和擾動變化的敏感指標。本研究基于耕作紅壤田地的現場實驗，以土壤—納米TiO2—微生物體系為研究對象，通過分析測試土壤微生物菌落數、土壤呼吸強度、土壤蛋白酶活性等參數，綜合探討納米TiO2對土壤微生物活性的影響。以期促進對納米材料生態環境風險方面的科學評估。

1 材料與方法

1.1 實驗場地與材料

本研究采用將納米TiO2均勻混合于耕作土壤中的野外現場實驗方式。實驗場地位于福建省廈門市坂頭林場附近菜地中，土壤類型為硅鋁鐵質紅壤土，質地以砂質粘壤土為主, pH為5.1, 上層土壤（0～40 cm）有機質含量為1.53%～2.16%。供試納米TiO2為銳鈦型TiO2粉末(DK Co. LTD)，純度＞99%，平均粒徑20 nm, 比表面積＞15 m2·g-1。

1.2 實驗流程

在菜地中隨機選擇5個0.1 m2大小土地，將納米TiO2摻入耕作層（0～40 cm）土壤中，納米TiO2與土壤的質量比按0.1、0.2、0.5、1、3 mg·g-1的比例混合均勻。在與周邊土地保持同樣土肥、水熱條件下繼續耕種。以10 d為一個實驗采樣頻次，在一

個季度（90 d）的實驗周期內，對6組實驗(包括空白對照組-CK組)的表層（0～20 cm）土壤中的土壤微生物菌落數、土壤呼吸強度和土壤蛋白酶活性等指標分組測定。

1.3 分析測試

土壤微生物菌落數采用稀釋平板計數法，土壤呼吸強度采用堿式滴定法，土壤蛋白酶活性采用Folin試劑分光光度法，各實驗均參照規范方法操作（李振高等，2008；林先貴，2012）。

實驗結果用統計軟件Excel 2007和SPSS 16.0進行處理分析。

圖1 不同納米TiO2添加量/（mg·g-1）對土壤微生物菌落數的影響Fig. 1 The effect of different dosage/ (mg·g-1) of Nano -TiO2on soil microbial colonies

2 結果

2.1 納米TiO2對土壤微生物菌落數的影響

通過測試包括空白對照組（CK）在內的6組土樣在整個實驗周期內的土壤微生物菌落數，圖1表明，不同的納米TiO2添加量和不同的時間段，土壤微生物菌落數變化表現出一定的差異性。CK組在整個90 d的試驗周期內土壤微生物菌落數變化范圍是3.59～3.92 CPU（107·g-1）。低納米TiO2劑量（0.1、0.2 mg·g-1）土樣微生物菌落數在實驗前期（10、20、30 d）明顯低于CK組，在實驗后期（80、90 d）與CK組的差距有所縮小。如添加納米TiO2劑量為0.1 mg·g-1的土樣中的微生物菌落數變化范圍是3.27～3.78 CPU（107·g-1）；高納米TiO2劑量（1、3 mg·g-1）土樣微生物菌落數在整個實驗周期內均明顯受到抑制。如添加納米TiO2劑量為3 g·kg-1的土樣中的微生物菌落數變化范圍是2.18～2.61 CPU（107·g-1）。總體而言，納米TiO2對土壤微生物菌落數有一定的抑制作用，且納米TiO2劑量越大，抑制作用越明顯。

2.2 納米TiO2對土壤呼吸強度的影響

通過測試包括空白對照組（CK）在內的6組土樣在整個實驗周期內的土壤呼吸強度（以CO2計，mg·g-1），圖2表明，不同的納米TiO2添加量和不同的時間段，土壤呼吸強度變化表現出一定的差異性。CK組在整個90 d的試驗周期內土壤呼吸強度變化范圍是0.49～0.61（mg·g-1）。低納米TiO2劑量（0.1、0.2 mg·g-1）土樣呼吸強度在實驗前期（10、20、30 d）明顯低于CK組，在實驗后期（80、90 d）與CK組的差距有所縮小。如添加納米TiO2劑量為0.1 mg·g-1的土樣呼吸強度變化范圍是0.43～0.54（mg·g-1）；高納米TiO2劑量（1、3 mg·g-1）土樣呼吸強度在整個實驗周期內均明顯受到抑制。如添加納米TiO2劑量為3 mg·g-1的土樣呼吸強度變化范圍是0.19～0.28（mg·g-1）。總體而言，納米TiO2對土壤呼吸強度有一定的抑制作用，且納米TiO2劑量越大，抑制作用越明顯。

2.3 納米TiO2對土壤蛋白酶活性的影響

通過測試包括空白對照組（CK）在內的6組土樣在整個實驗周期內的土壤蛋白酶活性，圖3表明,不同的納米TiO2添加量和不同的時間段，土壤蛋白酶活性變化表現出一定的差異性。CK組在整個90 d的試驗周期內土壤蛋白酶活性變化范圍是0.068～0.081（mg·g-1）。低納米TiO2劑量（0.1、0.2 mg·g-1）土樣蛋白酶活性在實驗前期（10、20、30 d）明顯低于CK組，在實驗后期（80、90 d）與CK組的差距有所縮小。如添加納米TiO2劑量為0.1 mg·g-1的土樣蛋白酶活性變化范圍是0.052～0.070（mg·g-1）；高納米TiO2劑量（1、3 mg·g-1）土樣蛋白酶活性在整個實驗周期內均明顯受到抑制。如添

加納米TiO2劑量為3 mg·g-1的土樣蛋白酶活性變化范圍是0.015～0.034（mg·g-1）。總體而言，納米TiO2對土壤蛋白酶活性有一定的抑制作用，且納米TiO2劑量越大，抑制作用越明顯。

圖2 不同納米TiO2添加量（mg·g-1）對土壤呼吸強度的影響Fig. 2 The effect of different dosage (mg·g-1) of Nano -TiO2on intensity of soil respiration

圖3 不同納米TiO2添加量（mg·g-1）對土壤蛋白酶活性的影響Fig. 3 The effect of different dosage (mg·g-1) of Nano -TiO2on soil proteinase activities

3 討論

3.1 土壤微生物活性的度量

土壤微生物是生活在土壤中的細菌、真菌、放線菌等的總稱，土壤微生物菌落數的數值大小反映了土壤微生物在該土壤環境中的適宜程度；土壤呼吸強度主要反映了土壤微生物的呼吸作用，影響微生物活性的各種因素（如pH/溫度/毒性物質）的變化都能從土壤呼吸強度的變化中反映出來；蛋白酶屬于水解性酶類，為植物提供有效氮素營養和在促進營養元素的礦化上起重要作用，是衡量土壤肥力及土壤微生物總活性的一項重要指標。因此，綜合土壤微生物菌落數、呼吸強度和蛋白酶活性等參數，基本能反映土壤微生物活性的整體狀況（Hungria等, 2009；Chaer等, 2009；Manna等, 2013）。

3.2 納米TiO2對土壤微生物活性的影響

納米材料對生態環境的毒性效應的相關研究已有很多的工作開展，但是目前絕大部分工作是在實驗室內進行的模擬實驗，沒能反映真實環境中的物理、化學和生物等各種因素的綜合境況。本研究通過對耕作紅壤的現場實驗，能較為真實的反映納米 TiO2對土壤微生物活性的影響。

納米TiO2對土壤微生物抑制較為合理的影響機制是隨著顆粒尺寸縮小，納米TiO2表面晶格

可能出現破損，從而產生電子缺損或富余的活性位點，一定條件下可與O2相互作用形成超氧自由基（O2-）及其它ROS（Reactive Oxygen Species-活性氧簇）。ROS可增加氧化壓力，導致脂質過氧化、破壞細胞膜，引起微生物毒性效應（Nel等, 2006；Lyon等, 2008）。對于能受到陽光照射的表層土壤，除了上述影響機制外，納米TiO2的光催化特性也不容忽視。納米TiO2在光照射下自行分解出自由移動的帶負電的電子(e-)和帶正電的空穴(h+)，形成電子－空穴對。吸附溶解在TiO2表面的氧俘獲電子形成氧自由基，而空穴則將吸附在TiO2表面的OH-和H2O氧化成氫氧自由基。生成的氧自由基和氫氧自由基均有很強的化學活性，特別是氧自由基能與多數有機物反應，使得有機物得到降解，從而抑制微生物的生長（Linsebigler等, 1995；Ge等, 2011；Allahverdiyev等, 2011）。

本研究中，耕作紅壤摻雜納米TiO2后，土壤微生物菌落數、呼吸強度和蛋白酶活性等參數均低于空白對照土樣，說明土壤微生物活性受納米TiO2抑制，且納米TiO2劑量越大，抑制作用越明顯。對于低納米TiO2劑量（0.1、0.2 mg·g-1）土樣土壤微生物菌落數、呼吸強度和蛋白酶活性等參數在實驗前期（10、20、30 d）明顯低于空白對照土樣，在實驗后期（80、90 d）與空白對照土樣的差距有所縮小。可能是隨著時間延長，由于澆灌，表層（0～20 cm）土壤中的部分納米TiO2逐漸淋濾滲入中下層，其光催化性能也隨之減弱，從而減少了對表層土壤微生物活性的抑制作用。而高納米TiO2劑量（1、3 mg·g-1）土樣中由于納米TiO2劑量較高，即使部分淋濾流失后，在整個90 d的實驗周期內也能一直保持對土壤微生物活性的明顯抑制。

4 結論

通過對耕作紅壤的現場實驗，綜合土壤微生物菌落數、呼吸強度和蛋白酶活性等參數，較為真實的反映了納米TiO2對土壤微生物活性的影響。研究表明，在整個90 d的試驗周期內，空白對照土樣土壤微生物菌落數變化范圍是3.59～3.92 CPU（107·g-1）、土壤呼吸強度變化范圍是0.49～0.61（mg·g-1）、土壤蛋白酶活性變化范圍是0.068～0.081（mg·g-1）。耕作紅壤摻雜不同劑量（0.1、0.2、0.5、1、3 mg·g-1）納米TiO2后，土壤微生物菌落數、呼吸強度和蛋白酶活性等參數均低于空白對照土樣，說明土壤微生物活性受納米TiO2抑制，且納米TiO2劑量越大，抑制作用越明顯。納米TiO2對土壤微生物抑制機制包括由于納米尺寸效應形成的超氧自由基（O2-）和其它ROS，以及由于TiO2的光催化效應生成的氧自由基和氫氧自由基的共同作用。

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Effect of Nano-TiO2on red soil microbial activity

LIU Qiming1, WU Zeen1, ZHU Yizhen1, CAO Yinglan1, JIAO Yupei1,2, CAO Xin1
1. College of Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China；2. Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences, Xiamen 361021, China

Nanomaterials have nanostructured components with at least one dimension less than 100 nm. Nanomaterials are already widely used in the various industries due to the special physical and chemical properties they exhibit compared to the bulk material. Increasing production and use of nanomaterials have raised concerns about their potential negative ecological and environmental impacts. Nano-TiO2is among the most highly used nanomaterials in industry. And Nano-TiO2is introduced into the soil as a result of a number of human activities, including intentional and unintentional releases. In this study, based on field test, the effects of nano-TiO2on red soil microbial activity were systematically investigated from three aspects including soil microbial colonies, intensity of soil microbial respiration and soil proteinase activities. Experimental results showed the soil microbial colonies of Ck soil samples range from 3.59-3.92 CPU(107·g-1), the soil respiration of Ck soil samples range from 0.49-0.61(mg·g-1), the soil proteinase activities of Ck soil samples range from 0.068-0.081(mg·g-1). And the soil microbial activity of red soil was inhibited after mixed with different dosages (0.1, 0.2, 0.5, 1, 3 mg·g-1) of nano-TiO2, and higher dosages of nano-TiO2, the more inhibition obvious.

Nano-TiO2; red soil; microbial activity

X171

A

1674-5906（2014）05-0859-05

福建省自然科學基金項目（2014J01162；2013J01162）；廈門南方海洋中心項目

劉啟明（1973年生），男，副教授，博士，從事生態環境研究工作。E-mail: liuqm@jmu.edu.cn

2014-02-24

劉啟明，吳澤恩，朱藝貞，曹英蘭，焦玉佩，曹馨. 納米TiO2對耕作紅壤土壤微生物活性的影響[J]. 生態環境學報, 2014, 23(5): 859-863.

LIU Qiming, WU Zeen, ZHU Yizhen, CAO Yinglan, JIAO Yupei, CAO Xin. Effect of Nano-TiO2on red soil microbial activity [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2014, 23(5): 859-863.