新疆哈族食管癌血清MicroRNA初步篩查

曹 波 張紅濤 朱亞婷 馬媛媛

（新疆醫科大學厚博學院，新疆 烏魯木齊830054）

食管癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，我國男女性食管癌患病率和死亡率均居世界之首位，且近年來仍呈現上升趨勢。食管癌患病率因地區變化而顯著不同，在我國新疆哈薩克族是食管癌的最高發民族之一，其食管癌死亡率達155.9/106，高于我國平均水平15.23/106，嚴重威脅著哈薩克族人民的身心健康。早期診斷不僅可以明顯提高食管癌患者的生存率，而且對于提高病人的生活質量、節約衛生資源以及維護社會安定等均有重要意義。

1 研究對象

采用問卷調查、家訪、醫院病案資料整理分析及病理學檢查等方法，對新疆內哈薩克族食管癌病人資料進行收集整理，共收集50例癌患資料，資料主要來源于當地數家醫院及相關腫瘤登記機構，所有病人均經組織病理學證實。選取本實驗室收集50例單發食管癌和賁門癌手術切除標本，將每例標本進行連續取材，全部石蠟包埋，每個蠟塊均進行切片、HE染色，再次鏡下觀察、記錄，篩選漏診的雙源癌，共檢出112例，將所有收集到的臨床資料錄入Excel表，使用SPSSl3.0統計軟件包進行統計學處理，檢驗水準采用阿爾法=0.05。

挑選50例臨床資料齊全的血清標本（25例食管癌病人和25例正常），全部研究對象取清晨空腹非抗凝靜脈血5mL，靜置30min后，4℃1600轉離心5分鐘分離血清，將血清放置EP管-20℃保存待用。根據提取的miRNA量，部分樣品做了技術重復以進一步消除隨機誤差。

2 材料與方法

2.1 主要化學試劑

表1

血清miRNA的提取一苯酚氯仿抽提體系；RT-PCR反應體系；SPSS 13.0軟件；microRNA芯片分析儀。

2.2 方法

利用一苯酚氯仿抽提法抽提正常組別和對照組別的血清RNA，利用PCR技術進行擴增，microRNA芯片技術分析血清miroRNA表達譜。qRT-PCR技術檢測的標準曲線的重復性，數據分析，數據分析采用SPSS 13.0軟件進行數據處理。

食管癌與正常對照比較篩選的結果食管癌與正常對照比較可篩選到12個表達呈上調趨勢的miRNA(fold change＞1.5)，這些上調表達的 miRNA分別為 hsa.miR.320b st、hsa.miR.320c st、hsa.miR.320a st、hsa.miR.92a st、hsa-miR-486-5p st、hsa-miR一 627 st、hsa-miR.365 st、hsa.miR.1 826 st、hsa-miR-923 st、hsaomiR-l 85 st、hsa-miR.129。star st和hsa.miR.106a.star st，表達倍數1.5192.3.8319

3 討論

食管癌目前漏診率很高，患者5年生存率差，有效的術前診斷手段就是胃鏡+活檢，除了常規查體發現早期，大部分患者均是有了吞咽困難等消化道癥狀后才會去檢查，此時腫瘤已經發展到了中晚期，錯過了最佳的手術治療時間，而早期診斷和治療有效的降低癌的死亡率，改善生存狀況。所以探索發現癌的早期診斷生物標記物，可以對對高危人群進行篩查，有助于早期發現癌。

一般來說，特異的生物標記物有三種不同的用途，首先，它能區分疾病與正常狀態；其次它能用來指導預后；還能用來進行治療或檢測治療反應。檢測血中特異的miRNA作為一種生物標記物用來區分惡性腫瘤和正常有著廣闊的應用前景，可以提高惡性腫瘤患者非侵入性檢查的早期診斷率，改善患者的生存時間。越來越多的研究證據表明miRNA與各種惡性腫瘤的關系密切，成為腫瘤研究領域的熱點之一。有文獻報道miRNA可能會對癌癥的診斷、預測及治療開辟了一條新的途徑；而且miRNA高表達譜與食管癌患者的低生存率有關，其中miR.129的高表達被認為在外科手術治療的食管鱗癌患者中是一個獨立而重要的預后影響因子；也有人認為miRNA在組織和血液中的表達譜在結腸癌的檢測、篩查和監測中都有潛在的應用價值，而且，miRNA可能會成為結腸癌基因治療的一個靶點；miRNA表達譜改變可以區分食管腫瘤的組織學類型、正常與癌組織，而且能鑒別出有癌變傾向的Barrett食管。miRNA廣泛存在于生物體內，具有強大的調控基因表達的作用，miRNA主要采用降解靶mRNA和抑制靶mRNA的翻譯兩種作用方式調控基因的表達，而且有調節生長發育和維持機體正常生理功能等均有重要作用，正常人血漿微泡表達的miRNA能夠預測血細胞的分化和代謝通路及重要的免疫調節機制，為miRNA在疾病中的預測作用奠定了基礎。有研究證據都顯示，miRNA可以作為一類新的腫瘤“原癌基因”或者腫瘤“抑癌基因”。若這些miRNA表達在腫瘤中升高，就被看作癌基因，它們通過促進腫瘤增殖或者抑制腫瘤抑制基因，調控腫瘤細胞的增殖和凋亡。miR.17.92是原癌miRNA的一個典型例子，它是定位于人13q31的多順反子miRNA，這一區域的基因參與了包括惡性淋巴瘤、肺癌在內的多種腫瘤的發生。另外一些miRNA的表達在腫瘤細胞中有所降低，腫瘤抑帶IJmiRNA通常通過抑制原癌基因控制細胞分化和凋亡，進一步抑制腫瘤的發展，1let.7在肺癌中的表達降低，患者的生存期縮短，這說明let.7可能是一個腫瘤抑制基因。miRNA表達譜芯片的原理簡單地說就是把待測樣品中的miRNA與芯片上互補的探針序列雜交，通常待測樣品中miRNA的端會標記上熒光基團，雜交洗滌后掃描熒光強度，大量數據經處理后便可篩選出有顯著表達差異的miRNA，這些“脫穎而出”的群體就是要瞄準的研究對象了。基因芯片高通量的特點，使得miRNA芯片非常適合檢測miRNA表達譜。miRNA芯片分析可以幫助了解腫瘤組織和正常組織中miRNA表達的關系。基于此技術，一些作為原癌基因和腫瘤抑制基因的miRNA被分離鑒定出來，這將有助于理解在腫瘤發生中miRNA的作用，同時也為尋找腫瘤特異性診斷的標志物提供了依據。

我們通過昂飛的miRNA芯片雜交掃描得到的雙源癌與正常對照比較的miRNA表達譜，共有12個表達上調的miRNA，與食管癌比較的miRNA表達譜也是12個上調、1個下調，與賁門癌比較的miRNA表達譜有11個上調，3組表達譜同時有8個miRNA表達上調，這8個miRNA組成的表達譜對癌的診斷有一定價值，進一步進行大范圍的驗證及研究其功能和相關的基因表達調節機制，將會對癌發病機制的探討和早期診斷起到重要的作用。有研究發現在網織紅細胞終末分化過程中miR.320的下調在CD71(鐵傳遞蛋白受體)中起著重要作用，而CI)71是一個反映分化程度的標志，見于早幼紅細胞、網織紅細胞，成熟紅細胞無表達。更進一步的調查發現miR.320在純合子鐮狀細胞病的細胞中低表達和CD71在終末分化過程中的缺陷低調節有關。

我們發現癌里hsa.miR.320b st、hsa.miR.320c st、hsa.miR.320a st均有較明顯的高表達，是否與CD71的調節有關還需進一步的研究。miRNA在癌癥中的發生中起著重要的作用，因為超過50%的miRNA基因位于癌癥相關的基因組區域，他們在各種癌癥中出現錯調現象，最新版本的miRBasel4.0(SangermicroRNA序列數據庫)它的共收錄10，581條成熟的miRNA序列信息，共涵蓋115個物種，人類miRNA共721條。為了深入研究這些miRNA的功能，首先需要我們能夠準確、快捷地檢鋇,UmiRNA在不同組織、不同發育階段以及各種生理狀態下的表達情況。當前研究miRNA表達的方法有克隆測序、RNA印跡、RT.PCR和RNA酶保護分析等，但對于腫瘤研究，需要大規模比較腫瘤組織和正常組織中的miRNA表達譜差異，以上的方法耗時耗力，檢測的通量不高。在miRNA水平高通量檢測基因表達的生物芯片技術在20世紀90年代發展以來，發展到今天已經非常成熟，并在基因表達檢測方面得到了廣泛應用。

芯片技術的應用實現了在全基因組水平鑒定成熟miRNA的表達，可于短時間內同時鑒定所有已矢NmiRNA的表達譜，成為高通量檢測的最佳選擇。隨著計算機技術和生物信息學的發展，miRNA功能的研究更先進，可能逐一找到miRNA的靶基因，從而揭示它們的功能。

研究人員已經設計出多種miRNA靶基因預測軟件，如mirBase，miRanda，targetscan，Pictar等對miRNA靶基因預測具有較高的準確性，為了減少假陽性的情況，只有推定靶基因預測至少有三個項目被接受。該基因的功能的闡釋是通過基因本體 Biocarta，KEGG，和GenMAPP數據庫等來進行。對此，我們將在后續實驗中針對篩選出來的雙源癌差異表達各種miRNA，在較大的樣本中采用實時定量PCR方法加以驗證，結合患者的臨床病理資料分析其臨床意義，并在體內外實驗進一步研究相關miRNA的生物學功能。

4 結論

hsa-miR·320b—st、hsa-miR-320c-st、hsa—miR·320a—st、hsamiR一92a—st、hsa·miR-486-5p_st、hsa-miR-627-st、hsa-miR-365-st和hsa-miR-1826-st等miRNA較對照組明顯上調表達，可能癌診斷標記物的探索和發病機制的探討有一定價值。

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