作物遺傳育種研究進展Ⅲ.作物基因工程與基因組編輯

（湖南農業大學，長沙410128）

作物遺傳育種研究進展Ⅲ.作物基因工程與基因組編輯

劉忠松

（湖南農業大學，長沙410128）

從育種應用角度對利用基因工程和基因組編輯技術拓寬作物遺傳變異的意義、特點、原理和基本方法進行了評述，著重介紹了近10年來內源轉基因和同源轉基因、新靶標基因、多基因工程、葉綠體基因工程和基因組編輯技術的研究新進展，同時比較了它們的優缺點，以期為合理選擇利用這些新技術創制新種質提供基礎。

作物；遺傳育種；基因工程；基因組編輯

遺傳變異是育種選擇的基礎。遺傳變異的主要來源一是基因突變，二是基因重組，三是基因轉移。傳統的基因工程使基因在不同物種間實現轉移，是利用基因轉移擴大作物遺傳變異的重要途徑，在作物育種上已經廣泛利用，已培育出第一代、第二代轉基因作物［1，2］。近年來開發的基因組編輯技術可使作物基因組進行定點改造，通過斷裂的雙鏈DNA非同源末端結合或同源重組，導致基因突變、基因重組和基因轉移，將在定向改變作物的遺傳、拓寬作物遺傳變異來源中發揮重要作用。此外，轉基因和基因組編輯也是研究基因功能的重要方法。

1 作物基因工程

基因工程是指將不同DNA（或基因）在體外進行酶切和連接，構成重組DNA分子，然后借助生物方法或理化方法將外源基因導入到植物細胞，導入的目的基因整合到植物基因組進行穩定的表達而實現改變植物特定性狀的目的。

1.1 內源轉基因和同源轉基因

由于遺傳密碼具有通用性，基因可在不同的生物之間進行交流或轉譯，因而轉基因的目的基因可來源于植物、動物和微生物甚或人工合成。第一代轉基因作物的目的基因抗除草劑、抗蟲基因主要來自于細菌，這引發人們對轉基因安全性的擔憂。為了解決轉基因安全性問題，Rommens［3］和Schouten等［4］提出了intragenesis（內源轉基因）和cisgenesis（同源轉基因），即利用雜交親和的植物來源的基因作為轉基因的目的基因。在同源轉基因中包括啟動子、終止子在內的目的基因來自于同種作物或雜交親和植物，完整轉移，不對基因進行改造操作，而在內源轉基因中目的基因的各個部分可能來自于同種作物或雜交親和植物的不同基因，需將不同基因的各功能成分（編碼區、啟動子、終止子）進行重組（圖1）［5］。

圖1 同源轉基因與內源轉基因的比較

1.2 基因工程的新靶標

基因多數編碼蛋白質，如編碼酶的基因、編碼轉錄因子的基因，但也有不編碼蛋白質、而編碼RNA的基因，如microRNA基因。第一代甚至第二代轉基因主要集中在編碼酶的基因，以期改善作物的投入性狀（如抗除草劑、抗蟲）和產出性狀（如富營養化等品質性狀）。轉錄因子可以調控遺傳網絡中多個基因的表達，利用轉錄因子基因進行轉基因將改變一條路徑上全部或多個基因的表達，因此可用于復雜性狀（如抗旱性）的改良。但利用轉錄因子基因進行轉基因時，應注意轉錄因子基因的表達具有時空特征，需要利用組織專一性或誘導性表達啟動子［6］。小RNA是指長度短于200個堿基的RNA，包括microRNA、小干擾RNA（siRNA）等，它們通過剪切基因轉錄本或抑制轉錄本翻譯而使基因沉默，從而調控基因的表達。通過增強或干擾小RNA基因的表達可以改變小RNA基因調控的靶標基因控制的性狀的表達（圖2）［7～10］。

圖2 基于小RNA基因的轉基因策略

1.3 多基因基因工程和基因聚合

作物的許多性狀都是復雜的遺傳調控網絡控制的，導致單個基因對性狀的改良往往不能湊效，需要同時導入多個有利基因才能達到目的。多基因基因工程有多條途徑（圖3）［11］。一是基因聚合（圖3A），攜帶不同轉基因的植株通過傳統育種方法雜交、回交，將轉基因聚合到優良品種中，這種轉基因聚合方法也叫做育種聚合（breeding stack）。育種聚合花費時間長，能聚合的基因數目有限（4個以內），而且在后代中會發生遺傳分離，難以保持。二是重復轉化（圖3B），轉基因植株作為受體材料用另一基因的表達載體再轉化。這種途徑需要多輪轉化，在每次轉化時需要用不同的選擇標記基因或將標記基因切除，基因分別整合和表達，在后代中分離，需要回交而且難以獲得所有轉基因的純合系。三是非連鎖基因共轉化（圖3C），將多個目的基因分別構建載體，然后同時通過農桿菌介導或基因槍方法對受體進行轉化，多個基因往往能隨機串聯整合到受體的同一位點，但對多個基因（3個基因）不適用。四是連鎖基因轉化（圖3D），有時也叫分子聚合（molecular stack），是將多個目的基因轉化到同一表達載體，用一個載體進行轉化，轉基因整合到基因組的一個位點。由于轉基因緊密連鎖，后代轉基因基本不會發生分離。這種途徑存在的問題是多個基因（如8～10個基因）在進行克隆、組裝時可能需要用不同的啟動子［13］，需要有合適的限制酶切位點和載體構建平臺［14］。由于合成生物學的興起，合成DNA或基因方便而高效，這一問題已迎刃而解。另一問題是需要用高容量轉化載體如BIBAC、TAC等，即使這樣，轉化上限也在200 kb以下（一般80～150 kb），而且載體不穩定，容易片段化，位于載體3′端的基因往往表達低。為了克服這一問題，并將更多基因同時進行轉化，正在致力于人工染色體或合成染色體研究。人工染色體長達幾個Mb，能攜帶數十甚至數百個基因，且目標基因的導入不會破壞內源基因的表達，因此是多基因轉移有希望的載體［15］。

圖3 多基因基因工程途徑

1.4 葉綠體基因工程

植物細胞除了有細胞核基因組外，細胞質的葉綠體和線粒體也有自己的基因組。盡管線粒體基因工程停滯不前，但葉綠體基因工程已取得突破，近20種雙子葉植物都能通過基因槍轉化獲得質體轉基因植株［16］。

與細胞核轉基因相比，質體轉基因具有4大優勢：（1）大多數植物的質體為細胞質遺傳，轉基因不會通過花粉擴散；（2）一個細胞中有上百個質體，每個質體中有上百個基因組，同質的轉基因質體的拷貝數多，導致轉基因高水平表達；（3）質體基因不會發生基因沉默，轉基因表達穩定；（4）質體基因組為原核基因組，基因以操縱子形式排列，適宜多基因轉化。

與核轉基因的隨機整合不同，葉綠體轉基因通過同源重組定點整合到葉綠體基因組（圖4B），因此利用葉綠體基因序列作為同源重組序列（圖4A）來構建表達框。葉綠體基因組具有原核生物的特點，基因以多順反子進行表達，且采用基因槍進行葉綠體基因轉化，能導入50 kb大小DNA到葉綠體，因此適合多基因的轉化（圖3E），在光合作用、品質代謝、抗性改良和重組蛋白生產均有重要作用。葉綠體轉基因雖然不能通過花粉有性轉移，但可以通過無性嫁接實現在細胞間轉移［17］，利用嫁接融合體細胞再生將葉綠體轉基因轉移到其他植物。

葉綠體轉基因目前在單子葉植物上尚未取得成功，需要利用綠色葉片進行轉化，轉化過程繁瑣，組織培養必不可少，轉基因只在綠色組織高表達，而在非綠色組織是低表達，因此需要研究如何提高非綠色組織葉綠體轉基因的表達，利用非綠色組織高表達基因（如accD基因）的啟動子和5′端調控元件可能是途徑之一。

2 作物基因組編輯

基因工程是將單個或少數幾個結構和功能已知的目的基因插入到作物的基因組，而基因組編輯是將DNA雙鏈定點切開，使雙鏈斷裂，DNA雙鏈斷裂后，能夠激活細胞內固有的非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HDR）機制，將斷裂的DNA修復，DNA修復過程可導致基因插入、基因點突變、染色體結構變異（圖5）［18］。

2.1 基因組編輯的主要特點

基因組編輯是利用蛋白或RNA對基因組的特定序列具有專一識別的特性設計、構建人工內切核酸酶，從而使DNA雙鏈在特定位置斷裂，因此這種斷裂是位點特異的，可以對基因進行定向突變。

決定基因組編輯的靶標位點短（表1），只要有作物的基因組序列或基因序列，就可以利用計算機進行靶標位點預測，基因組中任意符合條件的位點均可進行編輯，基因組編輯頻率高。

基因組編輯既可以通過病毒載體進行瞬時轉化，又可以通過農桿菌介導的穩定遺傳轉化進行。由于基因組編輯是使靶標基因突變，而核酸酶轉基因可以通過雜交分離去除，基因組編輯的結果是非轉基因植株（圖6）［19］。

2.2 基因組編輯技術

從2005年基因組編輯技術出現以來，已開發的基因組編輯技術有鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN）、類轉錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）和成簇規律間隔短回文重復／Cas9蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR／Cas9）三種技術（圖7）［18，20，21］。

ZFN是人工將具有獨特的DNA序列識別的鋅指蛋白（zinc finger，ZF）與非特異性核酸內切酶（nuclease）FokⅠ連接合成的酶，其中鋅指蛋白負責DNA特異序列的識別，每個鋅指蛋白都能夠識別一個特定的三聯體堿基，在鋅指蛋白的指導下FokⅠ二聚體在特定的位置將DNA雙鏈切開。

TALEN是用類轉錄激活子效應物（TALE）代替了鋅指蛋白作為DNA結合域與FokⅠ切割結構連接形成的核酸酶。通過TALE（由33～35個氨基酸的重復序列構成的轉錄激活子效應因子蛋白）第12位和第13位氨基酸（這兩個氨基酸被稱為RVDs）識別特異的DNA序列，FokⅠ酶二聚化產生核酸內切酶活性，從而在特定位點將DNA序列精確切開。目前已發現了5種RVDs，分別與特異的堿基對應：組氨酸-天冬氨酸（HD）特異識別堿基C、天冬酰胺-異亮氨酸（NI）識別堿基A、天冬酰胺-天冬酰胺（NN）識別堿基G或A、天冬酰胺-甘氨酸（NG）識別堿基T、天冬酰胺-絲氨酸（NK）可以識別A、T、C、G中的任一種。由于TALEN的RVD對于核苷酸的識別是一一對應的，為識別某一特定氨基酸序列，只需要設計相應TALE單元串聯克隆即可，所以TALEN的設計、構建和篩選比ZFN簡單得多，具備比ZFN更廣闊的應用潛力。

CRISPR／Cas9基因組編輯技術不同于ZFN和TALEN基因組編輯技術，它不是以蛋白質識別DNA序列，而是以一條短的向導RNA識別特異結合的DNA序列，通過CRISPR位點附近的雙鏈DNA核酸內切酶Cas9在向導RNA引導下對靶標位點進行切割。Cas9與FokⅠ酶的功能類似，但是它并不需要形成二聚體就能發揮作用。CRISPR／Cas9基因組編輯技術只需要設計短的向導RNA序列，設計、組裝都很方便，因此快速得到了應用，在基因組編輯技術中似有后來居上之勢［22，23］。

上述3種基因組編輯技術在原理、修飾效率、構建方法、操作難度以及應用成本等方面具有較大差異（表1）。

表1 基因組編輯技術比較［18，20，21］

2.3 基因組編輯技術改良植物基因組的步驟

（1）分析和確定待改良性狀及其目標基因；（2）針對目標基因DNA序列構建1對（或多對）內切核酸酶表達基因盒，并將其裝載入合適的植物表達載體；（3）利用農桿菌介導法等遺傳轉化途徑，將工程核酸酶基因表達盒導入目標植物細胞；（4）分化獲得轉工程核酸酶基因植株；（5）對轉基因植株進行剪切位點的DNA序列分析及目標基因的表達分析；（6）對轉基因植株進行表型檢測，包括目標基因性狀和其它主要農藝性狀；（7）轉基因植株通過自交或與其它材料雜交，篩選剔除轉入的外源DNA片段、同時目標基因又得到了修飾的轉基因植株；（8）與常規育種技術結合，培育剔除不利性狀基因或激活目標基因的植物新品種。在這些環節中，也可以在分化獲得轉基因植株前，在細胞水平檢測不同工程核酸酶的定點剪切效果，并確定是否對工程核酸酶基因表達盒進行優化。

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S330

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2014 04 21

劉忠松（1963-），男，湖南常寧人，博士，教授，從事作物遺傳育種研究與教學。