S-KIR基因組合型與肝移植術后急性排斥發生率的關

陳小平，李雪松，駱利敏，陳世洪，王忠，羅敏，肖露露

自然殺傷(nature killer，NK)細胞表面的免疫蛋白樣多態性家族受體(killer immunoglobulin-like receptor，KIR)對其發揮細胞毒樣自然殺傷作用具有重要意義。KIR可調節NK細胞在感染反應、腫瘤免疫、移植免疫和自身免疫性疾病中的殺傷功能，研究其多態性有助于理解NK細胞作為先天性免疫細胞發揮有益或有害免疫作用的機制[1-2]。近年有關KIR與腎移植和肝移植急性排斥反應(acute rejection，AR)的研究主要集中在供受者NK細胞的KIR與人類主要組織相容性復合物Ⅰ(human leukocyte antigenⅠ，HLA-Ⅰ)類分子的錯配分析[3-5]。這些錯配分析表明，HLA-C是抑制型NK細胞受體(L-KIR)最主要的配體，調節HLA-C與KIR的相互作用可能是改善移植物及患者長期存活的重要途徑。但是，目前尚不明確KIR受體發揮的作用，因為一個NK細胞可以單獨或同時表達多個抑制型和激活型KIR受體(S-KIR)，不同個體KIR基因的表達頻率和基因組合也不相同。本研究回顧性分析56對供受者KIR基因的組合型，觀察KIR基因是否與肝移植術后AR的發生相關。

1 資料與方法

1.1 研究對象 解放軍458醫院肝膽外科2007年2月－2013年2月因肝衰竭接受原位異基因肝臟移植的受者56例及相應供者。取靜脈血液2ml，EDTANa2抗凝，－20℃保存。

1.2 肝移植受者臨床信息采集 56例受者均為初次肝臟移植，年齡41.9±12.1(19～60)歲，其中男性52例(92.86%)，女性4例(7.14%)。原發疾病包括原發性肝癌、肝炎后肝硬化、酒精性肝硬化、肝豆狀核變性合并急性肝功能衰竭。肝臟移植后住院天數32.7±10.3d，移植物存活＞30d。肝移植術式均為經典原位肝移植。

1.3 肝移植后AR的診斷 根據Banff排斥活動指數明確是否發生AR以及AR的嚴重程度。診斷標準：①臨床表現為發熱、尿量減少、移植肝區脹痛、血清轉氨酶升高伴或不伴膽紅素升高；②彩色多普勒超聲檢查顯示供肝血管阻力指數升高；③供肝細針穿刺活檢病理檢查符合AR病理標準。

1.4 術中及術后免疫抑制劑的使用 所有受者術中無肝期前和無肝期均使用甲潑尼龍(Pred)500mg；術后基礎免疫抑制方案采用三聯療法[他克莫司(FK506)+霉酚酸酯(MMF)+Pred]，即術后第1～6天靜脈使用Pred并逐日遞減使用量，術后第7天開始改為口服，60mg/d，每3～4d遞減10mg，直至使用劑量為10mg/d時維持，術后第2天加用MMF，1g/次，2次/d，術后第5天加用FK506并維持藥物濃度(谷濃度)為8～10ng/ml。

1.5 KIR基因分型 取全血提取DNA，A260/A280為0.9～1.6。采用序列特異性引物聚合酶鏈反應技術(polymerase chain reaction-sequences specific primer，PCR-SSP)進行KIR基因分型。

1.5.1 KIR引物序列設計[1]根據2010年11月10日IPD (immuno polymorphism database)KIR序列數據庫(www.ebi.ac.uk/ipd/kir)公布的KIR堿基編碼序列(release 1.3.0)，設計23對上下游引物序列，經BLAST軟件驗證可識別16個KIR基因及12個等位基因，包括14個功能基因及其8個等位基因2DL1、2DL2、2DL3、2DL4(group1& group2)、2DL5(A*001、005、B*、B*002、003、004)、3DL1、3DL2、3DL3、2DS1、2DS2、2DS3、2DS4(group1& group2)、2DS5、3DS1，沉默基因2DP1、3DP1(*001、002、003、004)。內對照采用人類生長激素(HGH)基因特異性引物，濃度25μmol/L。引物由天津秀鵬科技有限公司合成(表1)。

1.5.2 PCR-SSP反應 反應體系：模板DNA 1μl，PCR Buffer 5μl，15mol/L MgCl21μl，dNTP 1μl，上、下游引物各1μl(濃度為25μmol/L)，Taq酶0.08U。96℃預變性 2min；96℃變性15s，65℃退火60s，10次循環；96℃變性15s，61℃退火50s，30℃延伸30s，20次循環。依次取擴增產物8μl，2%瓊脂糖凝膠水平電泳(12mV/cm)，溴化乙啶染色，UVP成像。

1.5.3 S-KIR組合類型與基因包含關系 參照文獻[2]，KIR基因組合型分為L-KIR(AA)和S-KIR(AB/BB類型)。

1.6 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析。兩組計量資料的比較采用兩樣本t檢驗，兩組AR發生率的比較采用Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 受者KIR基因頻率及組合型頻率 由于沉默基因2DP1、3DP1會導致內在遺傳缺失而無法闡述其功能，本研究參照文獻[2]對KIR功能基因的14個組合型進行了分析。56例受者共獲得8個組合型，其中2個KIR基因的組合型為：由多個抑制型KIR基因(KIR-2DL1、2DL3、2DL4、3DL1、3DL2、3DL3)和1個激活型KIR基因(2DS4)組成，即僅包含AA類型；由多個抑制型KIR基因(KIR-2DL1、2DL3、2DL4、3DL1、3DL2、3DL3)和多個激活型KIR基因(2DS1、2DS2、2DS3、2SD4、2DS5、3DS1)組成，即AB類型；由多個抑制型KIR基因(KIR-2DL1、2DL3、2DL4、3DL1、3DL2、3DL3)和不包括KIR-2DS4的多個激活型KIR(2DS1、2DS2、2DS3、2DS5、3DS1)組成，即BB類型(表2)。其中L-KIR(AA)在肝移植患者中的表達頻率為0.499，S-KIR(AB/BB)在肝移植患者中的表達頻率為0.500(表3)。

2.2 肝移植后受者AR發生率 56例受者中有16例發生了AR，AR發生率28.6%，AR發生時間為術后7～30d，中位時間為術后14d。

表1 KIR基因及其等位基因引物序列Tab.1Primers for identification of KIR genes and allelic genes

表2 KIR基因組合與KIR基因的包含關系Tab.2KIR genotype assortment and inclusion relation thereof

表356 例肝移植受者KIR基因頻率和組合型頻率一覽表Tab.3Frequency of KIR gene and its assortment in 56cases of liver transplantation recipients

2.3 供、受者KIR基因組合型與肝移植后AR的關系 16例術后發生AR的患者中，受者為L-KIR者占18.8%(3/16)，受者為S-KIR者占43.8%(7/16)，兩者之間差異無統計學意義(P＞0.05)；供者為L-KIR者占25.0%(4/16)，供者為S-KIR者占12.5%(2/16)，兩者之間差異亦無統計學意義(P＞0.05)。

2.4受者KIR激活基因數量與肝移植后AR發生率的關系 在移植后發生AR的受者中，表達1個KIR激活基因(S1)的占16.67%，表達≥2個激活KIR基因(S2)的占83.33%，兩者之間差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討 論

器官移植后，聯合應用免疫抑制藥物可在細胞周期的不同階段和不同信號傳導通路上阻斷淋巴細胞的活化、增殖[6-7]。NK細胞具有自然殺傷作用，可以通過加強免疫抑制作用來控制宿主對移植物的排斥。此外，KIR還可特異性識別HLA，形成對靶細胞的激活或耐受通路，介導并調節NK細胞和效應性T細胞的殺傷功能。NK細胞毒性被認為是特定的KIR的刺激性效應和抑制性效應之間平衡的結果。由此可以認為，在病理和藥物環境下，NK細胞承擔著“獲得免疫”的生物學功能[5]。本研究結果顯示，L-KIR(AA)在肝移植患者中占50.0%(28/56)，其表達頻率為0.499，S-KIR(AB/BB)也占50.0%(28/56)，其表達頻率為0.500。國內外學者普遍認為在肝移植患者中，KIR基因組合型以抑制性信號通路為主[4-5]，但本文結果顯示S-KIR在其中也起著重要作用。

本研究對L-KIR/S-KIR與移植后AR的關系進行分析發現，L-KIR受者AR發生率較低但供者AR發生率較高，S-KIR受者AR發生率較高但供者AR發生率較低。此外，本研究結果還顯示，供受者基因組合型為L-KIR或S-KIR時，其AR發生率之間差異無統計學意義(P＞0.05)，即無論KIR組合型為抑制型還是激活型，對肝移植后AR的發生均沒有明顯影響。進一步分析顯示，受者S-KIR數目≥2與移植后AR的發生有關，即受者S-KIR數目≥2有增加肝臟移植后AR發生率的可能性，提示在肝移植中對受者進行KIR檢測具有一定臨床意義。

本組研究對象中有部分肝癌患者，而肝癌細胞能明顯下調KIR表達，抑制NK細胞活性，也可能并未直接參與對移植物的排斥，而是通過一些未知的免疫信號通路對受者獲得性免疫功能的調節起作用[8]?？傊覀兊难芯刻崾?，受者S-KIR基因組合型及數目可能增加肝移植術后AR的發生率，可借助S-KIR或L-KIR與特異性識別配體HLA-Ⅰ類分子來調控受者的NK細胞功能。上述結論為肝移植后小劑量、低濃度、聯合抗排斥藥物的臨床應用研究提供了參考。

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