高效液相色譜柱后同位素稀釋質譜法定量分析人血清中轉鐵蛋白及白蛋白

張丹　馮流星　王軍　熊金平

摘要 建立了高效液相色譜（HPLC）與電感耦合等離子體質譜（ICPMS）聯用，同時結合柱后同位素稀釋法，通過直接測定硫及鐵元素，實現蛋白質絕對定量的分析方法。選取分子量不同的4種標準蛋白：轉鐵蛋白、β乳球蛋白、肌紅蛋白和溶菌酶作為混合蛋白，34S或54Fe同位素稀釋劑與液相色譜洗脫液經三通混合后，在線進入ICPMS檢測。根據同位素稀釋法公式及蛋白中硫、鐵的含量計算混合蛋白中每種蛋白的濃度，與天平稱量結果一致，對方法進行了驗證。將方法應用到人血清轉鐵蛋白、白蛋白的定量分析，針對兩種蛋白含量差別大導致的信號差異，通過改變同位素稀釋劑的流速，成功測定了人血清中轉鐵蛋白、白蛋白的含量。采用34S及54Fe同位素稀釋劑分別定量的血清中轉鐵蛋白濃度為（2.35±0.01）g/L和（2.22±0.13）g/L，結果基本吻合。方法精密度RSD均小于10%，可用于基體樣品中含硫蛋白及金屬蛋白的定量分析。

關鍵詞 同位素稀釋； 蛋白質定量； 電感耦合等離子體質譜； 轉鐵蛋白； 白蛋白

1引言

蛋白質組學的快速發展，不但需要準確鑒定蛋白質，還要求對處于動態變化的蛋白質進行定量分析[1～4]。目前比較成熟的定量方法多是基于穩定同位素標記的生物質譜[5，6]，但是生物質譜的信號響應與蛋白質或肽段含量間的關系十分復雜，沒有蛋白質標準作歸一化處理，很難對蛋白質或肽段定量。與生物質譜不同，電感耦合等離子體質譜（ICPMS）分析中元素的響應與原子所處的分子環境無關[7]，而且樣品處理簡單，易于色譜聯用，可進行同位素分析[8]。因此，利用ICPMS對蛋白質中的元素定量分析，是近年來蛋白質定量技術研究的熱點。硫是最適合作為蛋白質定量分析的元素[9]。根據SwissProt蛋白質數據庫的統計分析，分別有96.6%、98.8%的蛋白質含有半胱氨酸、甲硫氨酸等含硫氨基酸[10]。如果蛋白質的氨基酸序列已知，就能確定其中的硫原子數；那么通過ICPMS測定硫的含量來實現蛋白質的定量是完全可行的[11]。但是，目前ICPMS直接測定硫來定量的蛋白，主要是標準蛋白，涉及基體樣品的很少，因為ICPMS測量硫存在一些困難：需使用碰撞池技術或高分辨ICPMS克服O+2對硫的譜線干擾[12]。常見的ICPMS對蛋白質定量研究集中在金屬蛋白上[13，14]，定量原理與含硫蛋白相同。

為保證定量分析的準確度，需使用與待測蛋白匹配的標準物質來保障質控與量傳，但由于蛋白質種類繁多、結構復雜，目前可獲得的蛋白標準十分匱乏。同位素稀釋法（ID）是國際公認的具有權威性化學計量方法，只需硫或金屬的濃縮同位素即可實現不同基體蛋白的定量分析[15]。

高效液相色譜（HPLC）的同位素稀釋法分為特異性、非特異性形態[16]。前者在前處理時就將稀釋劑加入到樣品中，具有傳統同位素稀釋法的優點；但是必須開發針對目標蛋白的特異性稀釋劑制備方法，目前商品化或人工合成的稀釋劑非常有限，直到2005年才有文獻報道第一次應用到蛋白質的定量分析[17]。而非特異性形態同位素稀釋（也稱柱后同位素稀釋）對蛋白質的種類、結構沒有要求，同位素稀釋劑常為某元素的簡單離子，基本都有商品化的產品，適合于蛋白質的定量分析。

目前，文獻報道了高效液相色譜柱后同位素稀釋質譜法（HPLCIDICPMS）， 通過測硫定量標準蛋白[11]和測鐵定量轉鐵蛋白[14]，但是未見對硫、鐵共同定量蛋白的比較及人血清中多種蛋白的定量。本研究采用液相色譜分離混合蛋白，ICPMS測硫、鐵分別定量的標準蛋白結果與天平稱量結果比較，驗證了HPLCIDICPMS方法，并對硫、鐵定量分析進行比較。在此基礎上，將方法應用到人血清中轉鐵蛋白、白蛋白的定量分析，測定了血清中兩種蛋白的含量。本方法體系可應用在食品安全、環境監測、臨床檢驗的化學計量、相關實驗室認證等生命科學研究的重要領域，促進我國生命科學測量水平的不斷提高和測量溯源性研究的深入發展。

2實驗部分

2.1儀器、試劑與樣品

Element 2扇形磁場電感耦合等離子體質譜儀（美國ThermoFisher Scientific公司）；高效液相色譜系統（日本Shimadzu公司）：含LC30AD泵、LC20AD泵、SIL30AC自動進樣器、CTO20A柱溫箱、SPD20A紫外檢測器；Toledo型電子天平（瑞士Mettler公司）；MillQ超純水系統（美國Millipore公司）；TSKGel G3000SWxl凝膠柱（300 mm×7.8 mm，日本Tosoh公司）；Shodex QA825 IEC色譜柱（75 mm×8.0 mm， 日本Shodex公司）

Tris、人血清轉鐵蛋白Transferrin（Tf，75.2 kDa，每分子含47個S原子）、白蛋白Albumin（Alb，66.4 kDa，含41個S原子）、牛β乳球蛋白Lactoglobulin（Lacb，18.36 kDa，含9個S原子）、雞溶菌酶Lysozyme（Lys，14.31 kDa，含12個S原子），均購自Sigma公司；甲酸銨、乙酸銨，購于Fisher Scientific公司；馬心肌紅蛋白Myoglobin（Myo，16.95 kDa，含3個S原子）、人血清樣品來自中國計量科學研究院；其它試劑均為國產分析純；實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

4種標準蛋白Tf， Lacb， Myo和 Lys用天平準確稱量后混合，溶于超純水中備用；人血清樣品不經任何處理，直接進入液相色譜進行分析。

34S濃縮同位素（美國橡樹嶺實驗室）：同位素32S/34S豐度比為0.01417；54Fe濃縮同位素（中國計量科學研究院）：同位素56Fe/54Fe豐度比為0.11313。

2.2電感耦合等離子體質譜儀條件

儀器工作參數為：功率 1300 W，樣品氣流速1.05 L/min，輔助氣流速0.87 L/min，冷卻氣流速16.0 L/min， 分辨率（m/Δm） 4000；掃描次數 700×1。

2.3高效液相色譜分離條件

2.3.1尺寸排阻色譜（SEC）分離混合標準蛋白尺寸排阻液相色譜常用的流動相中高濃度鹽（如NaCl等）在質譜錐上的堆積會影響ICPMS測量；文獻[18]研究發現，0.2 mol/L乙酸銨作為流動相時既能保證分離效果，又不會引入高濃度鹽；而且質譜連續工作8 h，沒有發現明顯的碳堆積。本實驗所用的流動相為0.1 mol/L 乙酸銨溶液，流速為0.4 mL/min， 紫外檢測器波長280 nm，分析時間40 min，等度洗脫。

2.3.2陰離子交換色譜（IEC）分離人血清由于轉鐵蛋白與白蛋白分子量接近，尺寸排阻色譜柱分離人血清時，兩者的保留時間重合，不能達到分離效果，因此采用陰離子交換柱Shodex QA825 IEC分離人血清。液相分離條件為 A相： 0.02 mol/L TrisHCl（pH 8.6）； B相： A+0.5 mol/L甲酸銨溶液，流速為0.7 mL/min， 時間程序： 0～30 min， 0～100% B； 梯度洗脫。 紫外檢測器波長為280 nm。

2.4HPLCIDICPMS分析

柱后同位素稀釋時，稀釋劑通過島津液相系統自帶的LC20AD泵加入，與液相色譜的洗脫液經過三通混合后在線進入ICPMS檢測。液相色譜實現混合蛋白分離，ICPMS檢測對蛋白定量分析。

質譜得到的同位素比值譜圖，根據同位素稀釋公式（1），轉化為元素的質量流（Mass flow）譜圖。積分質量流譜圖中的峰面積可得到相應蛋白中該元素的絕對含量，依據液相進樣體積及蛋白所含元素個數，就可計算出蛋白的絕對濃度。

MFs=cspdspfspMsMspAbspAbs（Rm-Rsp）（Rs-Rm）（1）

式中， csp， dsp和fsp分別代表同位素稀釋劑的濃度（ng/g）、密度（g/mL）和流速（mL/min）； Ms和Msp分別表示樣品和稀釋劑中元素的原子量； Abs和Absp分別表示樣品和稀釋劑中核素b的豐度； Rm， Rsp和Rs分別表示混合樣品、稀釋劑和樣品中核素a與核素b的豐度比。

血清中目標蛋白的正常含量范圍不同：轉鐵蛋白2.35～3.00 g/L，白蛋白35～50 g/L；導致兩種蛋白中硫含量差別很大，為保證Rm比值合適，采用改變稀釋劑流速的方法，在液相時間程序的前15 min（轉鐵蛋白出峰部分），34S同位素稀釋劑的流速為0.03 mL/min；之后白蛋白出峰時間段，流速提高到0.2 mL/min。[TS（][HT5”SS]圖14種混合標準蛋白的液相色譜圖

Fig.1Liquid chromatogram of mixed standard proteins[HT5][TS）]

3結果與討論

3.1含硫標準蛋白的絕對定量

尺寸排阻液相色譜分離4種混合標準蛋白（Tf， Lacb， Myo和Lys）的譜圖如圖1所示， 4種蛋白按照分子量大小依次被洗脫出來，Tf， Lacb， Myo和Lys在紫外檢測器檢測的保留時間分別為21.9， 23.9， 26.3和29.9 min。

2.3高效液相色譜分離條件

2.3.1尺寸排阻色譜（SEC）分離混合標準蛋白尺寸排阻液相色譜常用的流動相中高濃度鹽（如NaCl等）在質譜錐上的堆積會影響ICPMS測量；文獻[18]研究發現，0.2 mol/L乙酸銨作為流動相時既能保證分離效果，又不會引入高濃度鹽；而且質譜連續工作8 h，沒有發現明顯的碳堆積。本實驗所用的流動相為0.1 mol/L 乙酸銨溶液，流速為0.4 mL/min， 紫外檢測器波長280 nm，分析時間40 min，等度洗脫。

2.3.2陰離子交換色譜（IEC）分離人血清由于轉鐵蛋白與白蛋白分子量接近，尺寸排阻色譜柱分離人血清時，兩者的保留時間重合，不能達到分離效果，因此采用陰離子交換柱Shodex QA825 IEC分離人血清。液相分離條件為 A相： 0.02 mol/L TrisHCl（pH 8.6）； B相： A+0.5 mol/L甲酸銨溶液，流速為0.7 mL/min， 時間程序： 0～30 min， 0～100% B； 梯度洗脫。 紫外檢測器波長為280 nm。

2.4HPLCIDICPMS分析

柱后同位素稀釋時，稀釋劑通過島津液相系統自帶的LC20AD泵加入，與液相色譜的洗脫液經過三通混合后在線進入ICPMS檢測。液相色譜實現混合蛋白分離，ICPMS檢測對蛋白定量分析。

質譜得到的同位素比值譜圖，根據同位素稀釋公式（1），轉化為元素的質量流（Mass flow）譜圖。積分質量流譜圖中的峰面積可得到相應蛋白中該元素的絕對含量，依據液相進樣體積及蛋白所含元素個數，就可計算出蛋白的絕對濃度。

MFs=cspdspfspMsMspAbspAbs（Rm-Rsp）（Rs-Rm）（1）

式中， csp， dsp和fsp分別代表同位素稀釋劑的濃度（ng/g）、密度（g/mL）和流速（mL/min）； Ms和Msp分別表示樣品和稀釋劑中元素的原子量； Abs和Absp分別表示樣品和稀釋劑中核素b的豐度； Rm， Rsp和Rs分別表示混合樣品、稀釋劑和樣品中核素a與核素b的豐度比。

血清中目標蛋白的正常含量范圍不同：轉鐵蛋白2.35～3.00 g/L，白蛋白35～50 g/L；導致兩種蛋白中硫含量差別很大，為保證Rm比值合適，采用改變稀釋劑流速的方法，在液相時間程序的前15 min（轉鐵蛋白出峰部分），34S同位素稀釋劑的流速為0.03 mL/min；之后白蛋白出峰時間段，流速提高到0.2 mL/min。[TS（][HT5”SS]圖14種混合標準蛋白的液相色譜圖

Fig.1Liquid chromatogram of mixed standard proteins[HT5][TS）]

3結果與討論

3.1含硫標準蛋白的絕對定量

尺寸排阻液相色譜分離4種混合標準蛋白（Tf， Lacb， Myo和Lys）的譜圖如圖1所示， 4種蛋白按照分子量大小依次被洗脫出來，Tf， Lacb， Myo和Lys在紫外檢測器檢測的保留時間分別為21.9， 23.9， 26.3和29.9 min。

2.3高效液相色譜分離條件

2.3.1尺寸排阻色譜（SEC）分離混合標準蛋白尺寸排阻液相色譜常用的流動相中高濃度鹽（如NaCl等）在質譜錐上的堆積會影響ICPMS測量；文獻[18]研究發現，0.2 mol/L乙酸銨作為流動相時既能保證分離效果，又不會引入高濃度鹽；而且質譜連續工作8 h，沒有發現明顯的碳堆積。本實驗所用的流動相為0.1 mol/L 乙酸銨溶液，流速為0.4 mL/min， 紫外檢測器波長280 nm，分析時間40 min，等度洗脫。

2.3.2陰離子交換色譜（IEC）分離人血清由于轉鐵蛋白與白蛋白分子量接近，尺寸排阻色譜柱分離人血清時，兩者的保留時間重合，不能達到分離效果，因此采用陰離子交換柱Shodex QA825 IEC分離人血清。液相分離條件為 A相： 0.02 mol/L TrisHCl（pH 8.6）； B相： A+0.5 mol/L甲酸銨溶液，流速為0.7 mL/min， 時間程序： 0～30 min， 0～100% B； 梯度洗脫。 紫外檢測器波長為280 nm。

2.4HPLCIDICPMS分析

柱后同位素稀釋時，稀釋劑通過島津液相系統自帶的LC20AD泵加入，與液相色譜的洗脫液經過三通混合后在線進入ICPMS檢測。液相色譜實現混合蛋白分離，ICPMS檢測對蛋白定量分析。

質譜得到的同位素比值譜圖，根據同位素稀釋公式（1），轉化為元素的質量流（Mass flow）譜圖。積分質量流譜圖中的峰面積可得到相應蛋白中該元素的絕對含量，依據液相進樣體積及蛋白所含元素個數，就可計算出蛋白的絕對濃度。

MFs=cspdspfspMsMspAbspAbs（Rm-Rsp）（Rs-Rm）（1）

式中， csp， dsp和fsp分別代表同位素稀釋劑的濃度（ng/g）、密度（g/mL）和流速（mL/min）； Ms和Msp分別表示樣品和稀釋劑中元素的原子量； Abs和Absp分別表示樣品和稀釋劑中核素b的豐度； Rm， Rsp和Rs分別表示混合樣品、稀釋劑和樣品中核素a與核素b的豐度比。

血清中目標蛋白的正常含量范圍不同：轉鐵蛋白2.35～3.00 g/L，白蛋白35～50 g/L；導致兩種蛋白中硫含量差別很大，為保證Rm比值合適，采用改變稀釋劑流速的方法，在液相時間程序的前15 min（轉鐵蛋白出峰部分），34S同位素稀釋劑的流速為0.03 mL/min；之后白蛋白出峰時間段，流速提高到0.2 mL/min。[TS（][HT5”SS]圖14種混合標準蛋白的液相色譜圖

Fig.1Liquid chromatogram of mixed standard proteins[HT5][TS）]

3結果與討論

3.1含硫標準蛋白的絕對定量

尺寸排阻液相色譜分離4種混合標準蛋白（Tf， Lacb， Myo和Lys）的譜圖如圖1所示， 4種蛋白按照分子量大小依次被洗脫出來，Tf， Lacb， Myo和Lys在紫外檢測器檢測的保留時間分別為21.9， 23.9， 26.3和29.9 min。