實(shí)驗(yàn)室自檢在實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量控制中的作用

關(guān)升起, 肖春蘭, 周正宇

(蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心, 蘇州 215123)

實(shí)驗(yàn)室自檢在實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量控制中的作用

關(guān)升起, 肖春蘭, 周正宇

(蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心, 蘇州 215123)

目的 對一年內(nèi)在我校隔離檢疫的不同來源的39批實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行病原體檢測，分析各類疫病感染的規(guī)律，進(jìn)一步完善隔離檢疫系統(tǒng)。方法 依照國家標(biāo)準(zhǔn)GB14922.2-2011和GB14922.1-2011進(jìn)行檢測,以細(xì)菌鑒定試劑盒法為補(bǔ)充。結(jié)果 整體合格率為79.49%,其中來自國外動物檢測合格率為100%(7批次來自美國，1批次來自日本);來源為國內(nèi)共31個批次合格率為74.19%，其中病毒檢出率為9.68%，致病菌檢出率為25.81%，寄生蟲檢出率25.81%。結(jié)論 國內(nèi)來源動物背景復(fù)雜，質(zhì)量有待提高。隔離檢疫和實(shí)驗(yàn)自檢室可有效阻止外來實(shí)驗(yàn)動物所攜帶病原微生物對動物設(shè)施可能帶來的危害。

實(shí)驗(yàn)室自檢; 隔離檢疫; 檢出率

隨著功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等研究的深入，遺傳修飾動物模型正受到越來越多的重視，各類轉(zhuǎn)基因、基因敲除動物快速增加，已日漸成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究的重要材料。目前國內(nèi)已有諸多科研機(jī)構(gòu)或企業(yè)提供商品化、個性化的遺傳修飾動物模型制作服務(wù)。同時近年來留學(xué)回國學(xué)者，不僅帶來了新的科研活力，也帶來了許多遺傳工程動物模型。這些新的模型的引入，對高校實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量控制工作提出了更高的要求，傳統(tǒng)的質(zhì)量管理模式已很難適應(yīng)現(xiàn)代高校實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量控制的需要。鑒于此，我校自2012年8月建成動物隔離檢疫室，并開展實(shí)驗(yàn)室病原體檢測工作，現(xiàn)將結(jié)果報告如下:

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

自2012年8月至2013年9月，共接收來自美國、日本, 及我國華南、華東、華北地區(qū)的16個單位39個批次的不同品系的SPF級實(shí)驗(yàn)鼠272只(雄鼠117只，雌鼠155只)，其中，基因工程小鼠221只，占總數(shù)的81.25%。8～10周齡SPF級ICR (作為基因工程小鼠的哨兵鼠)78只, 其中雄鼠32只,雌鼠46只。

1.2 主要試劑

中國藥品生物制品檢定所ELISA診斷試劑盒、梅里埃公司的API 20E鑒定試劑盒、API STAPH鑒定試劑盒、API 20 STREP 鑒定試劑盒、ID 32E鑒定試劑盒、ID STA PH鑒定試劑盒、A PI CORYNE鑒定試劑盒、API 20NE鑒定試劑盒、哥倫比亞血瓊脂、北京陸橋生物科技公司的多種細(xì)菌培養(yǎng)基等。

1.3 方法

1.3.1 隔離檢疫設(shè)施的設(shè)置與管理 準(zhǔn)備室: 門口設(shè)有擋鼠板。配置更衣柜、鞋架、消毒噴霧器。傳遞倉: 作為通過檢疫動物及其飼養(yǎng)所需器具和材料的運(yùn)輸通道。隔離檢疫室: 按照GB14925-2010中對無特定病原體級動物的要求設(shè)置和管理。另外，增設(shè)Ⅱ級生物安全柜1臺，無菌隔離器1臺，IVC 2臺。隔離檢疫室內(nèi)(除動物尸體外)的一切物品出檢疫室后均經(jīng)121℃, 30 m in，高壓滅菌。動物尸體按照國務(wù)院令第380 號《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》進(jìn)行處理。無菌手術(shù)室: 與隔離檢疫室相鄰。設(shè)置的目的是在必要時將不符合實(shí)驗(yàn)動物微生物與寄生蟲控制級別標(biāo)準(zhǔn)要求的實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行凈化升級。無菌凈化室: 與無菌手術(shù)室相鄰。設(shè)置目的是飼養(yǎng)凈化得到的實(shí)驗(yàn)動物, 其設(shè)置與管理與隔離檢疫室相同。

對隔離檢疫期間的實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行動物行為學(xué)和臨床癥狀觀測，對表現(xiàn)出被毛雜亂、皮膚破潰、眼部炎性反應(yīng)、口鼻粘膜潮紅、耳部發(fā)紺、四肢運(yùn)動失調(diào)、肛門紅腫潰爛、體型消瘦、精神沉郁、步態(tài)失常、躁動不安等癥狀的小鼠，按照GB14922.2-2011(實(shí)驗(yàn)動物微生物學(xué)等級及檢測)和GB14922.1-2011(實(shí)驗(yàn)動物寄生蟲學(xué)等級及檢測)的要求進(jìn)行取樣檢測。

1.3.2 哨兵鼠檢測法 哨兵鼠為本中心自主繁育的4至6周齡ICR小鼠(繁育群小鼠的病原體檢測每3個月一次，每年進(jìn)行一次平行檢測)。每個隔離品系放置哨兵鼠2只，隔離檢疫鼠飼養(yǎng)1周后產(chǎn)生的臟墊料飼養(yǎng)哨兵鼠，飼養(yǎng)6周后，對哨兵鼠進(jìn)行病原微生物和寄生蟲檢測。

1.3.3 病理剖檢 對哨兵鼠和有臨床表現(xiàn)的隔離檢疫期間的實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行剖檢, 觀察各組織器官的病變。

1.3.4 寄生蟲檢測 透明膠帶粘取法和刀片刮取皮層物取樣法進(jìn)行體外節(jié)肢寄生蟲檢測; ELISA法進(jìn)行弓形蟲檢測: 直接涂片法檢測蠕蟲、腸道鞭毛蟲和纖毛蟲[1]。

1.3.5 病原菌和病毒的檢測 ELISA法檢測漢坦病毒、鼠痘病毒、小鼠肝炎病毒、仙臺病毒、小鼠肺炎病毒、小鼠細(xì)小病毒、呼腸孤病毒Ⅲ型、支原體、泰澤病原體[1]; 使用梅里埃公司生產(chǎn)的ATB和API微生物系統(tǒng)及其配套的微生物鑒定試劑盒檢測以沙門菌、假結(jié)核耶爾森菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、鼠棒狀桿菌、大腸埃希菌O115a，C， K(B)、嗜肺巴斯德桿菌、肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、綠膿桿菌為主的550余種病原菌。其中，沙門菌、假結(jié)核耶爾森菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、鼠棒狀桿菌、大腸埃希菌O115a, C, K(B)、嗜肺巴斯德桿菌、肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、綠膿桿菌屬于假定存在病原, 這類菌按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB14926.1-2011[1]中的要求進(jìn)行分離培養(yǎng)后，用ATB和API微生物系統(tǒng)進(jìn)行鑒定; 對于國家標(biāo)準(zhǔn)未明確要求檢測的潛在病原菌采取伴隨檢測和取病灶于哥倫比亞血瓊脂涂板，37℃培養(yǎng)24 h后，挑取可疑菌，哥倫比亞血瓊脂純培養(yǎng)后取樣的方式進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

2 結(jié)果

2.1 病原微生物和寄生蟲的檢出情況

經(jīng)檢疫, 39個不同品系的實(shí)驗(yàn)鼠中, 8個品系檢出國家標(biāo)準(zhǔn)要求為陰性的病毒2種、病原菌4種、寄生蟲2種(表1)，從1個品系實(shí)驗(yàn)鼠中分離到1種未列入國家標(biāo)準(zhǔn)的人獸共患病病原菌， 5個品系實(shí)驗(yàn)鼠中檢出對人致病，但未歸入人獸共患病的病原菌5種，另有1個品系分離到1種具有新生化特性的潛在致病菌(表2)。

2.2 不同病原引發(fā)的癥狀和剖檢特點(diǎn)

檢出的病原體的臨床與剖檢特點(diǎn)(表3)。

3 討論

高校目前仍然是我國實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)及使用的主體之一，受體制等因素的影響，高校的實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量隱患一直客觀存在，不少高校尚未建立質(zhì)量檢測實(shí)驗(yàn)室[10]。同時，高校的實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施具有使用人員多、人員流動性大、動物品種多等特點(diǎn)，質(zhì)量控制也較其他單位難。根據(jù)1年來對來自國內(nèi)高校或科研院所的11批次動物的隔離檢疫，總體合格率為54.55%, 其中病原菌檢出率為36.36%, 病毒為18.18%，寄生蟲為54.55%。幾種病原中，以鞭毛蟲和螨蟲感染為特點(diǎn)的寄生蟲感染最為嚴(yán)重，而鞭毛蟲的發(fā)病率最高，近半數(shù)隔離檢疫鼠可檢到鞭毛蟲，其高發(fā)原因可能為: 1)外源引入病原體隨實(shí)驗(yàn)動物入侵，若未設(shè)置專門的隔離檢疫室而采取直接引入的方式，則可能造成感染; 2)人員帶入 高校動物設(shè)施進(jìn)出人員多、課題雜，存在病原隨實(shí)驗(yàn)人員在各實(shí)驗(yàn)室-動物設(shè)施-實(shí)驗(yàn)室間交叉?zhèn)鞑サ目赡? 3)檢測不力 鞭毛蟲屬隱性感染，從動物行為學(xué)和癥狀上很難發(fā)現(xiàn)，因此，動物設(shè)施管理中若缺少定期檢測機(jī)制，則可能造成鞭毛蟲感染的擴(kuò)大化; 4) 墊料或飼料消毒不徹底飼料墊料的消毒效果受很多方面的制約，肉眼難以判斷，消毒效果的評估常常被忽視，這也使病原隨飼料墊料帶入成為了可能; 5) 環(huán)境消毒不充分高校動物設(shè)施滿載或超載運(yùn)行的方式較為常見，過高的飼養(yǎng)密度給環(huán)境消毒造成了困難，導(dǎo)致環(huán)境消毒不充分。

表1 39個批次實(shí)驗(yàn)小鼠的病原檢測結(jié)果

表2 國家標(biāo)準(zhǔn)未做要求的對屏障系統(tǒng)具有威脅的病原微生物檢出結(jié)果

表3 攜帶不同病原的小鼠的臨床癥狀和剖檢結(jié)果

隔離檢疫主要針對境外引進(jìn)或其他微生物背景不明的動物引進(jìn)及使用，防止這些動物攜帶病原體引發(fā)感染。實(shí)踐證明, 隔離檢疫室的設(shè)立和正常運(yùn)行可有效控制引進(jìn)動物攜帶病原體入侵。在人才流動越加頻繁的大環(huán)境下，實(shí)驗(yàn)動物隨人才流動的情況越加頻繁，病原體隨實(shí)驗(yàn)動物流動的可能性也在逐漸增大，為了有效控制病原體的入侵, 及時發(fā)現(xiàn)并隔離患病動物，科研型高校設(shè)置隔離檢疫室是必要的。此外，隔離檢疫室的設(shè)立必然伴隨著病原檢測室的設(shè)立，其設(shè)立還可解決檢測不利、飼料墊料消毒不徹底、環(huán)境消毒不徹底的問題，而一旦在動物設(shè)施中發(fā)現(xiàn)患病動物或疑似患病動物，即可采取隔離措施，進(jìn)行病原微生物和寄生蟲的檢測，從而避免感染的擴(kuò)大化，及早解決問題。

隔離檢疫雖在一定程度上控制外來動物攜帶病原微生物的進(jìn)入，但也面臨一些亟待解決的問題。1) 隔離檢疫工作中最感困惑的是檢出了未被列入國家標(biāo)準(zhǔn)但卻有致病性的病原體。以我校為例，曾檢出類鼻疽假單胞菌，此菌不在國家標(biāo)準(zhǔn)要求不得檢出的病原菌范圍內(nèi)，但相關(guān)文獻(xiàn)卻證明這種菌可能會危害人員健康，影響實(shí)驗(yàn)正常進(jìn)行。為此，作者建議須不斷加強(qiáng)國標(biāo)的修訂與完善。2) 細(xì)菌的致病性可能是變化的，有些非致病菌有變化為致病菌的可能，在我校檢測過程中曾分離到具有強(qiáng)β-溶血特性的木糖葡萄球菌，該菌有可能是一種新的致病菌，在日后的工作中應(yīng)該加強(qiáng)對其致病性的跟蹤與觀察。

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Q95-33

B

1674-5817(2014)01-0071-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.01.017

2013-11-07

關(guān)升起(1982-), 男, 碩士, 獸醫(yī)師,

E-mail: guanshengqixy@163.com

周正宇, 副教授, E-mail: zacharyzhou@sohu.com