尿液中膀胱癌腫瘤標記物的研究進展

曲知專　卓育敏

【摘要】 目前膀胱癌診斷及隨訪主要依靠尿細胞學檢查與尿道膀胱鏡檢相結合，而膀胱鏡檢給患者帶來較大的痛苦，還有諸多并發癥及操作不便。因此，從尿液中尋找可用于膀胱癌早期診斷及判斷預后的無創指標非常重要。本文概述了主要的尿液中膀胱癌腫瘤標志物的研究進展

【關鍵詞】 腫瘤標記物； 膀胱癌

目前膀胱癌診斷及隨訪主要依靠尿細胞學檢查與尿道膀胱鏡檢相結合的手段，然而侵入性的尿道膀胱鏡檢操作不便，給患者帶來較大的痛苦，還有感染、出血等風險。因此，尋找可用于膀胱癌早期診斷及判斷預后的無創指標非常重要，尿液是膀胱癌理想的腫瘤標記物來源。理想的膀胱腫瘤標記物應該具有的實驗室特征：尿、血和腫瘤組織中存在并且其含量逐漸減少；不但精確預示腫瘤的存在，而且能夠預示腫瘤的侵襲狀態；標記物的水平須同疾病的嚴重程度相一致；檢測方法具有高度的敏感性和特異性。臨床潛在作用：篩選高危人群；對血尿和排尿刺激癥狀患者的檢查評價；患者術后的監測。臨床使用特點：檢測結果的可重復性；收集標本方法簡單實用；獲取結果迅速，成本不高；檢測方法簡單，最好能在門診進行。本文將近年來尿液中膀胱癌腫瘤標記物的研究進行了綜述。

1 目前通過美國食品和藥物管理局批準用于臨床的膀胱癌相關的無創診斷方法

1.1 尿細胞學（cytology） 尿細胞學不屬于腫瘤標記物范疇，作為膀胱腫瘤診斷金標準已多年，傳統細胞學（conventional cytology，CC）的涂片質量不十分理想，從而影響到細胞學的診斷。尿脫落細胞學檢測膀胱癌的敏感性為13%～75%，特異性為85%～100%，敏感性與腫瘤細胞分級密切相關。1996年FDA批準的液基細胞學檢測（1iquid based cytology，LBC）技術，從根本上改變了傳統涂片的制作方法，檢測膀胱癌的敏感性為達90%以上，特異度方面與傳統細胞學相當，對膀胱癌的診斷比傳統細胞學更準確[1]。目前常見的幾種液基細胞學檢查技術有：新柏氏TCT技術、超柏氏LCT技術、利普液基細胞學LPT技術、國產液基細胞學技術如LBP。尿細胞學對診斷高分級的膀胱腫瘤具有較高的敏感度，但對低分級的則敏感度較差，且其結果易受操作者影響等缺點，尋找理想的尿液中腫瘤標記物彌補其缺點，甚至與其一同成為診斷金標準顯得意義重大。

1.2 膀胱腫瘤抗原（bladder tumor antigen，BTA） 膀胱腫瘤抗原（bladder tumor antigen，BTA）又稱人補體因子H相關蛋白（human complement factor H related protein，HCFHrp）。腫瘤細胞分泌內源性基底蛋白與基底膜表面蛋白受體相結合，并釋放蛋白水解酶破壞基底膜，基底膜碎片進入膀胱內聚成高分子復合物即BTA。BTA檢測方法包括BTA、便攜式免疫分析（BTA stat）和實驗室ELISA（BTA TRAK）。其中早期的BTA方法是檢測基底膜降解復合物，BTA stat和BTA TRAK是BTA的改進方法，可通過單克隆抗體的方法檢測尿液中人類H相關蛋白補充因子，可在門診快速得到定性和定量結果。BTA的有優點是其高敏感度，缺點是其高的假陽性率，尤其是當患者存在非癌性血尿或感染[2]。在2008年一項前瞻性多中心臨床試驗501位患者中，BTA統計監測報告的膀胱癌復發的敏感性（56%）大于細胞學檢查（19.2%）的，特別是在1級病變（48%：13%），特異性仍不及細胞學（85.7%：98.3%）[3]。

1.3 核基質蛋白22（nuclear matrix protein 22，NMP22） 細胞核的成分之一，參與姊妹染色體的正確分離；腫瘤細胞在凋亡中釋放出來。膀胱癌患者尿中NMP22水平是正常人的25倍?？梢杂枚嗫寺】贵w（NMP22 test）或免疫定量分析（NMP22 bladder check）檢測尿液中NMP22水平監測膀胱癌復發，其在檢測原發膀胱癌方面較差，Vinod Kumar Arora等[4]研究表明NMP22和細胞學檢測膀胱腫瘤的敏感性分別為79%和65.8%，特異性分別為80%和100%。其在低級別的腫瘤中敏感性優于細胞學檢查的。FDA已承認其在監測膀胱癌復發方面的作用。Hosseini等[5]研究表明NMP22檢測和細胞學檢測復發的敏感性分別為78.8%和44.2%，特異性分別為69.6%和83.7%?，F很少單獨應用，多與細胞學聯合應用以提高癌檢出率。

1.4 ImmunoCyt ImmunoCyt是一種結合了尿細胞學和熒光免疫細胞化學的獨創技術，屬于免疫細胞學檢查，利用單抗19A211及抗體M344、LDQIO，通過免疫熒光顯微鏡去識別尿細胞表面的膀胱癌粘蛋白抗原（M344、LDQ10）和糖基化癌胚抗原的高分子量成分（19A211），其更普遍存在于低級別的表淺性膀胱癌中，具有較好的敏感性，較尿細胞學檢查有明顯優勢。最近1個單中心研究ImmunoCyt顯示其檢測膀胱腫瘤的敏感性為73%，特異性為49%[6]。有研究顯示ImmunoCyt在低級別腫瘤檢測方面比無論是尿細胞學或FISH都更為敏感。特異性無明顯差異[7]。但由于其高成本，對器械的要求及對檢驗醫生水平要求較高也限制了其推廣，目前它僅用于尿細胞學檢測之外的輔助檢測。

1.5 熒光原位雜交（FISH） FISH用于尿路上皮癌的診斷和術后監測，其靈敏度及特異度是現今尿液腫瘤標志物檢查方法中最高的一種。且其檢測結果不受卡介苗（BCG）治療的影響，可用于BCG膀胱灌注治療的監測。但由于FISH法的工作量大且費用高，因此在臨床應用受到限制。2008年Hajdinjak[8]對14項研究共2477次的FISH檢測結果進行Meta分析得出結論：fish診斷尿路上皮癌總的敏感性為72%，特異性83%，而尿脫落細胞學檢查的敏感性及特異性分別為42%及96%尤其對于低分級低分期腫瘤，fish檢測膀胱癌的敏感度要遠高于尿脫落細胞學檢查，將Ta期腫瘤去除后再進行分析，fish診斷膀胱癌的敏感度仍然高于尿脫落細胞學檢查，分別為86%及61%。國內雖有研究顯示我國膀胱癌患者的染色體號和畸變發生率與國外報道間存在顯著差異[9]。但近年來的國內相關研究也都表明FISH的敏感度和特異性在國人膀胱癌的診斷上亦是理想的一種。隨訪過程中當FISH檢查再次出現陽性時，則可認定是膀胱癌復發。FISH還可以作為尿細胞學或ImmunoCyt的一個確證試驗[7]。FISH檢查有望和細胞學一同成為診斷膀胱腫瘤金標準。endprint

2 處于研究階段的膀胱癌腫瘤標志物

2.1 膀胱特異性核基質蛋白（BLCA） 1996年，Getzenberg等[10]對17例膀胱癌組織和正常組織研究首次分離確定了9種膀胱核基質蛋白，其中6種只在膀胱癌組織中表達而在正常膀胱人膀胱組織中缺乏，這6種核基質蛋白命名BLCA1、2、3、4、5、6；另外3種只存在于正常人的膀胱組織中，命名為BLNL-1、2、3。對膀胱癌細胞系253j、T24和UMUC-2研究中發現6種BLCA的5種（BLCA-1、2、3、4、6）存在于3種癌細胞系中，BLNL1-BLNL3未發現存在于癌細胞系中，此組蛋白在膀胱癌轉化與形成中的相互聯系和作用尚不清楚，檢測BLCA-4的抗體多為抗人BLCA-4多克隆抗體，更加特異的單克隆抗體正在研究將使檢測結果更加準確；同時還需進行大量病例的研究，建立更高的正常臨界值，以提高其特異性，而不降低敏感性。國內有人制備了BLCA-4單克隆抗體并檢測15例膀胱癌標本，其敏感度和特異度分別為93.3%和100%[11]，最近一項研究表明BLCA-4高表達的膀胱癌患者預后差[12]。BLCA族其他成員在檢測膀胱癌中的價值也尚處于基礎階段。

2.2 透明質酸及透明質酸酶 HA為一種葡萄糖氨基聚糖，是真核細胞胞外基質和體液的基本成分。在腫瘤組織，升高的HA大部分集中在腫瘤基質中。HAase是一種降解HA的內生性糖苷酶，能促進腫瘤侵襲。目前發現有三種HAase基因，誘導膀胱癌的類型是HYALI型；多元統計分析則表明[13]，HYALI檢測腫瘤的肌層浸潤準確率為76.8%，腫瘤復發準確率為67.8%，在預測腫瘤肌層侵犯和轉移方面，是一個很有潛力的能獨立預測預后的標記物。

2.3 細胞角蛋白（eytokeratins，CK） 細胞角蛋白（eytokeratins，CK）是上皮細胞中間絲的組成成分，表達水平依賴于上皮類型、分化及惡性程度，也是一種常用的腫瘤免疫組織化學標記物，陽性表達見于上皮細胞、間皮細胞；癌，間皮瘤等。上皮組織存在20種不同的CK，幾乎所有上皮細胞在惡性轉化過程中均維持其表達量，因而是上皮來源腫瘤細胞的一種特征性變化。與膀胱癌相關的有CK8、CKl8、CKl9和CK20。應用酶聯免疫吸附試驗（UBC Ⅱ ELISA）測量尿液中的細胞角蛋白8和18對膀胱原位癌的診斷有一定意義，尤其是對膀胱原位癌，但其對膀胱腫瘤總的敏感性及特異性低[14]。CYFRA21-l是CKl9的可溶性片段，通過識別2株單克隆抗體BMl9-21和KSl9-l的雙抗體夾心法進行測定，對Gl期膀胱癌的敏感性較好。CK20并不是一個真的可溶性標記物，它需要對脫落細胞采用RT-PCR進行處理，檢測復雜、昂貴，在許多非惡性疾病甚至健康人群中也會增高，總之現今CK的檢測方法均不如尿脫落細胞學檢查，限制其發展和應用。

2.4 微衛星（Microsatelite MS） 微衛星是廣泛存在于原核及真核細胞基因組中高多形性短陣串聯的DNA重復序列（每對大概24個堿基）。目前在許多腫瘤中都發現了微衛星異常，包括雜合性缺失和微衛星不穩定性（體細胞微衛星位點的擴增、丟失和缺失），有學者發現國內膀胱癌患者微衛星異常較集中于D18S46、IFNA、D85S137、D16S47 6等位點[15]，檢出率約為80%，與國外報道顯著不同。由于MS數目龐大，分布較廣，敏感性和特異性受選擇的位點及其組合的影響，而位點及其組合的篩選需考慮種族、地域的影響，因此如何選擇恰當的位點，值得深入研究。

2.5 纖維連接蛋白（fibronectin，Fn） FN是一種大分子非膠原糖蛋白，在泌尿系統它只存在于尿路上皮的基底膜及黏膜下層。膀胱癌中基底膜FN均有不同程度的喪失，腫瘤侵犯基底膜以及誘導產生的蛋白酶增加了FN從基底膜中的釋放，而使尿中FN的含量上升。國內有學者首先報道用尿FN診斷膀胱癌[16]，近年來也已自主研究出一種FN試紙，可作為人群的篩檢和門診的初診手段，現已致力于FN試紙的臨床研究，正努力獲得國內的認可和批準。

2.6 存活素（survivin） 與抑制細胞凋亡細胞周期調控腫瘤血管形成腫瘤細胞耐藥等有關，是一個具有潛在價值的腫瘤標志物，與腫瘤的預后也密切相關。Survivin基因在胎兒的發育過程中有表達，成人健康組織中檢測不到，但許多腫瘤中豐富表達。Survivin能在膀胱癌尿液中檢測到，并與其復發、分期、預后和死亡率相關。利用RT-PCR技術檢測尿液中Survivin的mRNA，可用于篩選血尿患者，但診斷的穩定性需大量的樣本來驗證。

2.7 成纖維細胞生長因子受體3（FGFR3） 很多生長因子在文獻暈都有報道，如表皮生長因子受體、血管上皮生長因子、腫瘤壞死因子、纖維母細胞生長因子受體3（FGFR3）等。van Oers等[16]在一項280人的病例研究中發現FGFR3的變異率在膀胱癌和上尿道腫瘤的發生率相當，并且與低度惡性腫瘤相關。約50%的早期膀胱腫瘤中存在FGFR3突變，存在該突變的腫瘤患者多預后較好。

2.8 DNA甲基化 DNA甲基化腫瘤相關基因啟動子CpG島甲基化狀態異常廣泛見于腫瘤，有望作為臨床腫瘤診斷的分子標記。并與腫瘤浸潤發展、患者預后及總的生存率相關[17]。

2.9 其他 p53基因、癌胚抗原（carcinoma embryonic antigen，CEA）、端粒酶（Telomerase）、尿脫落細胞Lewis X抗原檢測、纖維蛋白原降解產物（FDP）、基質金屬蛋白酶（MMP）、尿激酶纖溶酶原激活物（Urinary urokinase-type plasminogen activator，uPA）、粘蛋白7（Mucin 7）、微小染色體維持蛋白5（minichromosome maintenance proteins 5，MCM5）、Upk3a、細胞分裂周期蛋白基因6（cell division cycle 6，CDC6）等均有待進一步研究及驗證。endprint

3 結論、存在問題及展望

許多腫瘤標志物檢測方法的敏感度尤其在低級別腫瘤檢測方面高于尿細胞學檢測的，可彌補其不足，但多有特異性低、需要進行標準化前瞻性的多中心研究以驗證其可行性、缺乏標準化和可重復性差等不足。BTA、FISH檢查在檢測低級別腫瘤較尿脫落細胞學更有優勢。NMP22適用于膀胱癌術后復發的監測，單獨使用易誤診。FISH有望和尿細胞學一同成為膀胱癌診斷金標準，尤其在原位癌及pTa期膀胱癌?，F仍沒有發現可用于檢測癌前病變的標記物，期望不久的將來，各種標志物試紙的出現會使膀胱癌的檢測更為無創、方便、快捷。

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（收稿日期：2013-10-14） （本文編輯：蔡元元）endprint