云紋石斑魚(♀)×七帶石斑魚(♂)受精過程的觀察

李炎璐, 王清印, 陳 超, 宋振鑫, 吳雷明, 賈瑞錦, 王曉梅, 李文升

(1. 中國水產科學研究院 黃海水產研究所, 山東 青島 266071; 2. 上海海洋大學 水產與生命學院, 上海201306; 3. 萊州明波水產有限公司, 山東 煙臺 261418)

云紋石斑魚(♀)×七帶石斑魚(♂)受精過程的觀察

李炎璐1,2, 王清印1,2, 陳 超1,2, 宋振鑫1,2, 吳雷明1,2, 賈瑞錦1,2, 王曉梅3, 李文升3

(1. 中國水產科學研究院 黃海水產研究所, 山東 青島 266071; 2. 上海海洋大學 水產與生命學院, 上海201306; 3. 萊州明波水產有限公司, 山東 煙臺 261418)

為研究雜交過程中精卵的結合以及相關生物學特征, 作者利用掃描電鏡觀察了云紋石斑魚(Epinephelus moara)卵子形態結構以及云紋石斑魚♀×七帶石斑魚(E. septemfasciatus)♂雜交時的精子入卵過程。結果發現, 云紋石斑魚(♀)×七帶石斑魚(♂)雜交與親本自交的精子入卵過程沒有本質的區別。云紋石斑魚卵表面布滿縱橫交錯、走向不確定的網紋, 在受精孔區可觀察到前庭、受精孔和微小孔。成熟的精卵相遇時相互激活, 產生一系列胞間反應。受精后0～25 s, 可觀察到精子附著在卵子受精孔周圍; 受精30～45 s, 已有精子進入卵子, 并且明顯可見精子尾部留在受精孔外; 精子入卵后, 受精孔內有受精錐形成, 周圍可觀察到絮狀的受精塞, 將受精孔封閉; 授精90 s～3 min, 卵表面處于修復狀態。整個過程未發現有多精入卵的現象。

云紋石斑魚(Epinephelus moara)(♀); 七帶石斑魚(E. septemfasciatus)(♂); 雜交; 精子入卵; 掃描電鏡

國內外有關利用掃描電鏡對魚類卵子結構及其受精過程的形態學觀察已有不少報道[1-12]。主要研究內容是對魚的卵子結構、受精孔及其周圍的形狀、結構的觀察以及精卵激活發生的一系列反應、精子如何進入受精孔, 并對受精前后精卵的變化等過程進行了較為詳細的描述。

近年來, 在海水養殖過程中應用人工雜交技術開展石斑魚種間雜交的研究已有不少報道, 但有關其精子入卵過程的研究還未見報道。云紋石斑魚(Epinephelus moara)和七帶石斑魚(E. septemfasciatus)同屬于鱸形目(Perciformes)、 科(Serranidae)、石斑魚亞科(Epinephelinae)、石斑魚屬(Epinephelus), 云紋石斑魚具有生長快、肉質好、耐高溫、可在中國南方養殖的特性; 七帶石斑魚具有耐低溫特性, 是可在北方沿海開展養殖生產的優良品種[13-17]。作者以云紋石斑魚(♀)和七帶石斑魚(♂)為材料進行雜交[18], 并利用掃描電鏡觀察了云紋石斑魚卵子形態結構以及云紋石斑魚(♀)×七帶石斑魚(♂)的精子入卵過程, 分析了雜交過程中精卵的結合以及相關生物學特征, 為闡明石斑魚種間雜交的受精生物學過程提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 取材

試驗材料于2011 年6 月13日取自萊州明波水產有限公司, 挑選性腺成熟飽滿的 5～6齡云紋石斑魚親魚母本與 4～5齡七帶石斑魚親魚父本進行人工授精, 受精卵孵化溫度為21～22.5℃。

1.2 樣品的固定

精卵混合后每間隔 5 s 取樣1次, 至混合后 3 min,所取樣品用 5%的戊二醛固定, 次日, 更換一次固定液, 置于4℃冰箱保存。

取l mL已激活的七帶石斑魚精液, 用等體積的5%的戊二醛固定, 置于4℃冰箱保存。

1.3 樣品的制備

將固定的樣品用磷酸緩沖液沖洗, 經酒精系列脫水, 加入乙酸異戊酯進行置換, 放入型號為Eiko.Model No.DX-1 的零界點干燥儀中干燥, 經Eiko IB-3 型離子濺射儀噴金后, 于 JEOL JSM-840型掃描電鏡下觀察和拍照。精子掃描電鏡樣品的制備方法與受精卵相同。

2 結果

2.1 云紋石斑魚卵子的形態結構

云紋石斑魚(♀)×七帶石斑魚(♂)雜交的成熟卵子呈圓球形, 無色透明, 浮性, 卵徑(862.7±31.2) μm。卵膜包被于卵子外層, 卵表面凹凸不平, 布滿縱橫交錯、走向不確定的網紋, 網紋較淺(圖 1-1)。在掃描電鏡下可觀察到卵膜表面有一個較小、較淺的凹陷區域, 為精孔區, 呈漏斗狀; 在凹陷區域中央位置的是受精孔(Micropyle), 受精孔完全敞開(圖1-2, 圖1-3); 周圍有呈放射狀排列的微小孔(Micropore); 受精孔是穿過卵膜的管狀結構, 稱為精孔管, 管道上粗下細, 管壁呈環紋螺旋狀。

2.2 七帶石斑魚精子的形態結構

圖1 云紋石斑魚卵子Fig.1 Mature egg of E.moara

七帶石斑魚精子(圖 2-1, 圖 2-2)由頭部和尾部兩部分組成。頭部無頂體, 呈橢球形, 頭部前端主要分布有高電子密度染色質的球形細胞核, 細胞核由核膜包圍, 將其與細胞質分開; 頭部后端是由質膜包圍的延伸至后部袖套結構, 其中分布有線粒體、中心粒復合體和囊泡等。尾部(鞭毛)細長, 與頭部細胞核緊密連接, 主要結構為軸絲, 軸絲與鞭毛間的質膜空隙狹窄, 僅有少量細胞質[19]。

2.3 精子入卵過程的觀察

精子與卵子接觸, 卵子本身發生一系列的變化。卵子的變化主要表現為受精膜舉起及皮層反應。精子與卵子表面接觸后, 與卵子表面的受體相結合, 并激發卵黃膜舉起。卵黃膜舉起變成受精膜, 受精膜盡管沒有增厚, 但由軟變硬。皮層顆粒胞吐時, 沒有方向性。胞吐的介質形成不規則棘狀突起。

從掃描電鏡的結果發現, 精子入卵的過程大致可分為4個階段: 即卵膜對精子的吸引、精子對內膜的錨定、精核的進入和受精孔封閉等。精子入卵的速度很快。授精后0～25 s, 可觀察到精子附著在卵子受精孔周圍(圖2-3); 授精30～45 s, 已有精子進入卵子, 明顯可見精子尾部留在受精孔外(圖 2-4); 精子入卵后, 授精50～60 s , 卵表面的微絨毛將精子的頭部包裹, 形成受精錐(圖 2-5), 可協助精子入卵, 周圍可觀察到呈絮狀的受精塞, 將受精孔封閉(圖2-6); 授精70～80 s, 受精孔周圍呈蜂窩狀, 并可看到大小不一的分泌物(圖2-7);授精 90 s～3 min, 卵表面處于修復狀態, 逐漸變平坦(圖2-8)。整個過程未發現有多精入卵的現象。

3 討論與結論

3.1 異源精卵的相互識別與結合

精卵的相互識別與結合是受精過程發生的前提條件, 其實質是性細胞表面的糖蛋白及其受體的相互作用。據報道, 在一些雙殼類如牡蠣(Conchaostreae)、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)和珍珠貝(Pinctada)等的遠緣雜交中, 受精一般沒有問題[20]。本實驗也可正常受精, 說明異源精卵能夠互相識別,其機理可能是異源精卵接觸后, 精卵表面的識別分子間啟動了一系列復雜的分子水平上的變化, 精子結合素與受體蛋白之間相互誘導, 造成蛋白質構象的變化, 使結合素與受體緊密結合。異源精卵相互識別機制的深入研究, 將有助于對遠緣雜交的認識和更廣泛深入的利用。

從染色體組型方面來看, 云紋石斑魚與七帶石斑魚染色體數目均為2n= 48, 但在核型上存在一定差異。七帶石斑魚染色體的核型為 2n=48t, NF=48,屬于原始類群, 染色體均為單臂染色體[21]; 云紋石斑魚染色體的核型為2n= 2st + 46t(st, 亞端著絲粒染色體; t, 端著絲粒染色體), 染色體臂數 NF = 50,屬于特化類群, 有1對特征性的雙臂染色體[22]。據有關報道, 魚類雜交育種中核型越相近雜交成功的可能性越大[23]。在本實驗中, 云紋石斑魚與七帶石斑魚雖屬不同類群, 但雜交依然成功, 說明云紋石斑魚與七帶石斑魚具有相近的親緣關系。

圖2 七帶石斑魚精子及精子入卵過程Fig.2 Sperm and initial stages of penetration of E. Septemfasciatus

3.2 云紋石斑魚(♀)×七帶石斑魚(♂)精子入卵過程的特點

云紋石斑魚卵殼膜表面布滿縱橫交錯、走向不確定的網紋結構, 并且均勻分布著微小孔, 微小孔內未發現其他物質。大量研究表明, 多數硬骨魚類的卵表面均有微孔分布[24], 但不同魚種的卵表面形態和結構具有一定差異, 例如金魚(Carassius auratus)卵動物極殼膜表面有5～10條寬度不一的溝和脊, 并向卵膜孔匯集[7]; 鲃魚(Barbus conchonius)卵膜孔區也有7～10條溝和脊的特異結構, Amanze[25]指出精子一旦位于該區, 其受精率就能提高到99.7%, 這種結構可能與數學物理的動力因素有關, 為精子集中于卵膜孔區提供了有利條件; 赤眼鱒(Squaliobarbus curriculus)卵表面平滑光潔, 除了均勻分布著微小孔外, 無明顯的溝或嵴[10]。

掃描電鏡觀察顯示, 云紋石斑魚(♀)×七帶石斑魚(♂)的受精過程中精子入卵是相當迅速的, 在授精30 s后已有精子開始進入, 授精 60 s 受精孔完全被堵塞, 因此, 在做人工授精時操作要迅速。云紋石斑魚(♀)×七帶石斑魚(♂)的受精與其他硬骨魚一樣, 精子是通過卵子獨有的一個卵膜孔入卵。有學者認為,卵膜孔區有一種小肽物質能吸引精子進入[26]; Laale[27]認為精子是被卵膜孔釋放的一種物質吸引入卵的。整個受精過程未發現有多精入卵的現象。據報道其原因是精孔管內孔直徑比精子頭部直徑略大,只能允許一個精子進入, 這一特點保證了單精受精,第一個精子入卵后精孔管內立刻形成有一團絮狀物質, 能堵塞受精孔, 阻止其他精子的進入[1,8,28-37],是保證單精入卵的有力屏障。受精錐是在精子入卵處形成的形狀不同的細胞質突起, 并不是所有魚類的受精過程都會出現受精錐。吳瑩瑩[35]等發現大菱鲆(Psetta maxima)的精子入卵時會形成受精錐; Kudo[2]發現鯉魚(Cyprinus carpio)在精子入卵時有受精錐的形成; 張天蔭等[7]在鳙魚(Hypophthalmichthysnobilis)精卵結合過程未觀察到明顯的受精錐; 孫際佳[10]等觀察赤眼鱒精卵結合過程的觀察中也未發現有明顯的受精錐形成。

[1] Brummett A, Dumont J. Initial stages of sperm penetration into the egg ofFundulus heteroclitus[J]. Journal of Experimental Zoology, 1979, 210(3): 417-433.

[2] Kudo S. Sperm penetration and the formation of a fertilization cone in the common carp egg[J]. Growth Diff, 1980, 22(3): 403-414.

[3] Hart N H, Yu S F. Cortical granule exocytosis and cell surface reorganization in eggs ofBrackudanio rerio[J]. Zool, 1980, 213(1): 137-l57.

[4] Ohta T, Iwamatsu T. Electron microscopic observations on sperm entry into eggs of the rose bitterling,Rhodeus ocellatus[J]. Zool, 1983, 227(1): 109-119.

[5] Wolenski T, Hart N. Scanning electron microscope studies of sperm incorporation into the zebrafishBrach ydanioeggs[J]. Zool, 1987, 243: 259-273.

[6] Kobayaski W, Yamamoto T S. Light and electron microscopic observation of sperm entry in the chum salmon egg[J]. Zool, 1987, 243(2): 311-322.

[7] 張天蔭, 封樹芒, 潘忠宗, 等. 鳙魚受精早期掃描電鏡觀察[J]. 動物學報, 1991, 37(3): 293-296.

[8] 高洪娟, 張天蔭, 劉廷禮, 等. 金魚卵的皮層反應[J].山東大學學報(自然科學版), 1996, 31(1): 82-89.

[9] 陳軍, 劉偉, 趙春剛, 等. 雜交鯰精子入卵掃描電鏡觀察[J]. 吉林農業大學學報, 2004, 26(3): 343-346.

[10] 孫際佳, 郭云貴, 李桂峰, 等. 赤眼鱒精子入卵的掃描電鏡觀察[J].中國水產科學, 2006, 13(5): 740-743.

[11] 王永玲, 楊彩根, 宋學宏, 等. 黃顙魚精子入卵的掃描電鏡觀察[J]. 淡水漁業, 2007, 37(4): 41-44.

[12] 何振邦, 洪萬樹, 陳仕璽, 等. 中華烏塘鱧精子入卵過程的掃描電鏡觀察[J].廈門大學學報(自然科學版), 2009, 48(1): 128-133.

[13] Nagano N, Hozawa A, Fujiki W, et al. Skeletal development and deformities in cul tured larval and juvenile seven-band grouper,Epinephelus septemfasciatus(Thunberg)[J]. Aquacult Res, 2007, 38(2): 121-130.

[14] 王新安, 馬愛軍, 陳超, 等. 七帶石斑魚兩個野生群體形態差異分析[J]. 海洋與湖沼, 2008, 39(6): 655-660.

[15] 陳超, 趙明, 柳學周, 等. 七帶石斑魚胚胎及仔稚魚形態觀察[J]. 漁業科學進展, 2011, 32(5): 24-31.

[16] 程波, 陳超, 王印庚, 等. 七帶石斑魚肌肉營養成分分析與品質評價[J]. 漁業科學進展, 2009, 30(5): 51-57.

[17] 謝菁, 區又君, 李加兒, 等. 七帶石斑魚胚體和卵黃囊期仔魚的發育[J]. 海洋通報, 2009, 28(2): 41-49.

[18] 李炎璐, 王清印, 陳超, 等. 云紋石斑魚(♀)×七帶石斑魚(♂)雜交子一代胚胎發育及仔稚幼魚形態學觀察[J]. 中國水產科學, 2012, 19(5): 1-12.

[19] 廖光勇, 區又君, 李加兒, 等.七帶石斑魚精子的超微結構[J]. 上海海洋大學學報, 2011, 20(1): 71-75.

[20] 陳來釗, 王子臣. 溫度對海灣扇貝與蝦夷扇貝及其雜交受精、胚胎和早期幼體發育的影響[J]. 大連水產學院學報, 1994, 9(4): 1-9.

[21] 鐘聲平, 陳超, 王軍, 等. 七帶石斑魚染色體核型研究[J]. 中國水產科學, 2010, 17(1): 150-155.

[22] 郭豐, 王軍, 蘇永全, 等. 云紋石斑魚染色體核型研究[J]. 海洋科學, 2006, 30(8): 1-3.

[23] 王祖熊, 張錦霞. 魚類雜交不親和性的研究[J]. 水生生物學報, 1986, 10(2): 171-179.

[24] 洪一江. 興國紅鯉成熟卵子卵膜的掃描電子顯微鏡觀察[J]. 江西大學學報(自然科學版), 1990, 14(3): 97-102.

[25] Amanze D, Iyengar, A. The micropyle: a sperm guidance system in teleost fertilization[J].Development, 1990, 109(2): 495-500.

[26] Yamamoto T. Physiology of fertilization in fish egg[J]. Inter Reu Cytol, 1961 , 12: 361-405.

[27] Laale H W. The perivitelline space and egg envelopes of bony fishes: A review[J]. Copcia, 1980, 2: 210-226.

[28] Hart N, Donovan M. Fine structure of the chorion and site of sperm entry in the egg ofBrachydanio[J]. Zool, 1983, 227(2): 277-296.

[29] 王瑞霞, 張毓人, 傅侖生, 等. 魴魚受精早期精子入卵的掃描電鏡觀察[J]. 水產學報, 1982, 6(4): 313-320.

[30] Hart NH. Fertilization in the teleost fishes: mechanisms of sperm egg interaction[J]. Int Rev Cytol, 1990, 121: 1-66.

[31] 黃永松. 尼羅羅非魚成熟卵結構及精子入卵早期電鏡研究[J]. 動物學報, 1990, 36(3): 227-230.

[32] 鄭文彪, 潘炯化, 安東, 等. 革胡子鯰受精過程的掃描電鏡觀察[J]. 動物學研究, 1991, 12(2): 111-115.

[33] Ginsberg A. Sperm egg association and its relationship to the activation of the egg in salmonid fishes[J]. Morpho, 1963, 1(1): 13-33.

[34] 高令秋. 泥鰍精子入卵程序的掃描電鏡觀察[J]. 武漢大學學報(自然科學版), 1995, 41(6): 741-744.

[35] 吳瑩瑩, 柳學周, 王清印. 大菱鲆成熟精子、卵子及精子入卵早期過程的電鏡觀察[J]. 漁業科學進展. 2012, 33(3): 42-47.

[36] 張筱蘭, 叢嬌日, 姚斐, 等. 黑鯛成熟精、卵和精子入卵早期過程的初步觀察[J]. 海洋湖沼通報, 1998, 4: 62-68.

[37] 黃樹慶, 閻淑珍.黃海太平洋鯡受精前后卵膜的動態變化[J]. 青島海洋大學學報, 1997, 27(2): 196-202.

(本文編輯: 譚雪靜)

Observation of the fertilization process of F1byEpinephelus moara(♀)×E. septemfasciatus(♂)

LI Yan-lu1,2, WANG Qing-yin1,2, CHEN Chao1,2, SONG Zhen-xin1,2, WU Lei-ming1,2, JIA Rui-jin1,2, WANG Xiao-mei3, LI Wen-sheng3
(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 2. College of Fisheries and Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Laizhou Mingbo Fisheries Limited Company, Yantai 261418, China)

Jan., 24, 2013

Epinephelus moara(♀);E.septemfasciatus(♂); crossbreeding; sperm penetration; scanning electron microscopy

To study the sperm penetration during hybrid process and the biological characteristics, the morphology of mature egg ofEpinephelus moaraand the fertilization process of F1byE.moara(♀)×E.septemfasciatus(♂) were observed by using scanning electron microscopy. The results showed that there were no significant differences in the process of fertilization between crossbreeding and inbreeding of these two species.Some reticulate structures with Criss-cross and uncertain towards were found on the outer chorionic surface ofE.moara.Vestibule, micropyle and micropore can be observed in the micropyle area. When the mature eggs and sperms encountered, they activated mutually and caused a series of responses. During 0～25 seconds post insemination, sperm attaching to the micropyle of mature egg was observed; during 30～45 seconds post insemination, the spermatozoon entering into the egg and the flagellum from the outside of micropyle were observed; The fertilization cone was formed in micropyle after the spermatozoon entered into the egg, and the fertilization plug was observed around the fertilization cone, and close to the micropyle. During 90 seconds～3 minutes post insemination, the egg surface began to repair. The polyspermy was not observed during the crossbreeding insemination.

S917.4

A

1000-3096(2014)04-0039-05

10.11759/hykx20130124001

2013-01-24;

2013-07-16

科技部國際合作項目(2012DFA30360); 國家科技支撐項目(2011BAD13B01)

李炎璐(1986-), 女, 山東菏澤人, 碩士研究生, 主要從事動物遺傳育種與繁殖研究, 電話: 0532- 85844459, E-mail: ysfriliyanlu @126.com; 陳超, 通信作者, 電話: 0532- 85844459, E-mail: ysfrichenchao@126.com