可自動對焦的電動顯微成像系統

王文歡，劉 威

（武漢大學 物理科學與技術學院，武漢 430072）

當下，科技突飛猛進，一些傳統工作的操作方式和實現方法都可以借助更先進的技術來提升其方便性和有效性，傳統的顯微鏡系統[1]主要使用人工操作和肉眼識別，對觀察者的經驗和知識儲備有較高的要求。為了使顯微鏡這種在各個方面都用途甚廣的儀器能更方便地被各類工作人員使用，研制了一套可自動掃描樣片獲取目標信息的顯微成像系統，將顯微鏡用機械、電子以及計算機技術武裝起來，使之能實現更智能化的控制，并具有更強大的功能。

1 系統概述

整個系統的功能劃分如圖1所示，它由獨立的幾部分組成的。硬件部分包括一個自帶電機可實現載玻片移動的載物臺，一套相對獨立的單片機控制系統和相應的電機驅動，可換鏡頭的光學顯微鏡，單反相機（攝像頭）等等。軟件部分主要包括PC機上的系統控制軟件和寫入單片機主控芯片的下位機軟件，兩者通過串口進行通信以實現系統的自動化控制。

圖1 系統結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of system framework

真實系統整體結構示意圖如圖2所示。

圖2 真實系統整體結構示意圖Fig.2 Diagram of physical system

系統的工作流程是將待測樣片或樣品放在可移動載物臺13上的某一個載玻片放置處，開啟系統的上位機控制終端1和下位機控制系統2，打開照明光源4，調節使之達到適宜的亮度，待一切就緒后可通過上位機控制終端1的預覽功能觀察由圖像獲取裝置3采集并顯示在屏幕中的圖像，并可同時發出各種指令與下位機控制系統2進行互動，可控制電機10、11實現載物臺13的移動來實現視野的變換以便對樣品不同部分進行觀察，控制電機9實現鏡頭的上下移動以實現對焦，對焦可選用手動方式和自動方式。如果發現感興趣的觀測目標，可以控制圖像采集裝置3進行拍照保存，經上位機控制終端1的圖像處理功能進行后續分析，給出參考數據并保存。對于每一個感興趣的目標，都可以進行自動尋回再觀察。系統操作流程如圖3所示。

圖3 系統操作流程圖Fig.3 Operate flow chart of the system

2 系統功能設計

根據需要，整個系統可分為儀器自動控制部分和圖像獲取與處理部分，這兩部分互相配合，圓滿實現整個系統的功能。

2.1 儀器自動控制部分

儀器自動控制部分的主要工作是實現對儀器各個部分的統籌控制，使整個系統的各個功能部件都能有條不紊地工作。

該部分的主要工作由下位機控制系統完成，該系統的主控芯片是一塊ATmega128單片機，主要完成對系統三個電機的控制，對載物臺位置傳感器狀態的讀取，對與控制鏡頭上下移動的電機9配套的編碼器信息的讀取以及通過串口與上位機控制軟件進行通信。

本系統的可移動載物臺主要通過1號和2號電機來實現移動，經實際測算，以10倍物鏡鏡頭觀測為例，在實現正確對焦之后，每一個視野的水平實際距離大約為1.5 mm，垂直實際距離大約為0.94 mm，在水平方向電機的精度可以達到0.04 mm，在垂直方向電機的精度可達0.02 mm，4個光電傳感器分別確定了電機可以到達的極限位置，系統的自動尋回功能正是依賴電機的高精度和光電傳感器標定的原點位置來實現的，下位機控制系統用一個單獨的線程來查詢位置傳感器和編碼器的相關信息。

下位機主控芯片與上位機控制終端之間采用全雙工的串行通信方式進行數據和指令的交流。系統設計初期就設定了一些有特定形式的字符串，為其賦予特殊的意義，比如驅動某個電機運行一定步數或者讀取當前編碼器信息等，作為指令在上下位機之間使用。

整個儀器自動控制部分的操作流程如圖4所示。

圖4 自動控制部分操作流程圖Fig.4 Operate flow chart of the system’s auto-control part

2.2 圖像獲取與處理部分

圖像獲取與處理部分旨在對觀測到的圖像進行分析和處理，這部分的主要工作由上位機控制終端的軟件配合圖像采集裝置和儀器自動控制部分來完成，可以說，這部分是本系統能夠實現智能化控制的關鍵。

在整個系統中，相當關鍵的一步是實現鏡頭對當前所觀測樣品的自動對焦，即通過特定的算法使電機能驅動鏡頭自行到達可以觀測到最清晰圖像的位置。只有觀察到清晰的圖像，圖像中的細節才可能被準確發現，對圖像的后續處理才更準確，更有意義。

在本系統中，自動對焦主要通過上位機軟件的算法來實現，在硬件層面上用3號電機來配合鏡頭完成這一工作，3號電機的精度經測算可以達到0.01 mm。此算法的核心是對當前位置圖像的清晰度進行評價，通過控制電機調整鏡頭與載物臺的相對位置，直至圖片最清晰為止。

對圖片清晰度進行評價的判據在這里非常重要，一個優質的圖片清晰度評價函數應該在圖片最清晰的位置出現峰值，并且能相應地判定次清晰與模糊等各種不同位置圖片的清晰度。查閱了一些文獻，選用并實現了以下一些方法，主要包括圖片的灰度信息熵、灰度方差、梯度和、拉普拉斯算子、梯度向量模方和、點銳度等[4-6]。

在此選用以圖5為代表的一組圖像進行測試，這組圖像是觀測一個洋蔥鱗片葉表皮細胞樣片所得，共取離焦距離不同的28幅圖片進行測試（圖5中選用了其中比較有代表性的5幅圖片作直觀展示）。

圖5 自動對焦測試圖片Fig.5 Test pictures of automatic focus

圖 5中編號（1）～（5）為對該樣片同一視野中離焦距離分別為：-1.25 mm，-0.11 mm，0，+0.11 mm，+1.11 mm的位置進行觀察而拍攝到的圖片，其中“-”代表當前位置在正確對焦位置一側，“+”代表當前位置在正確對焦位置另一側。

通過VS+openCV實現上述算法[7-8]并分析，本系統最終選取灰度方差作為對焦清晰度評價參數，設為p，p越大，則表明鏡頭在當前位置觀察到的圖像越清晰。實現自動對焦的算法流程如圖6所示，需要說明的是，本系統中用于控制鏡頭的電機的運行位置可由圖2中編碼器8讀出，每次進行自動對焦操作前，根據該編碼器的值判斷當前位置與默認初始位置之間的距離，并以此確定初始運動步長m的大小，指定的值d是一個很小的值，可以認為在當前位置的基礎上，電機再運行d指定的距離對最終結果的影響可以忽略，故以m與d之間的相對大小來確定是否實現自動對焦，最終可以使系統自動運行到能觀察到清晰度如圖5（3）圖像的位置。

圖6 自動對焦算法流程Fig.6 Flow chart of the autofocus algorithm

實現自動對焦后，系統可以獲得清晰的待處理圖片，并通過給上位機軟件添加一些圖像處理功能來實現對所獲得的圖像的初步分析。圖像處理功能一般按圖7所示的步驟進行工作，當前主要用VS+openCV平臺實現了灰度變換、濾波、邊緣檢測、目標識別等操作，可實現對圖片進行一定的分析處理并生成觀察報告。

圖7 圖像處理基本流程Fig.7 Image processing procedure

比如說觀察包含一組簡單幾何圖形的目標樣片，可以使用本系統的圖像處理功能實現各個小目標圖像的提取和顯示，如圖8所示，并且可以得到所有小目標的個數以及各個目標的相對大小 （面積、周長等）及基本信息（圓形度等），而且可以得到從載物臺指定原點位置運行到某一目標時控制載物臺的各電機運行的步數，從而方便對感興趣目標的再次觀察。與此同時，可以將這些信息保存下來，方便以后的查閱或者使用。

圖8 提取觀察到的部分目標后的顯示結果（初步）Fig.8 Preliminary result of the targets which had been extracted and observed

3 結語

本文研究的可自動對焦的電動顯微成像系統，在需要使用顯微鏡的各個領域，包括物理、生物、醫學等方面都有很好的應用前景。目前在實驗室已可以使用此系統來進行一些以往需要使用者進行繁復手動操作和肉眼觀察分析的工作，且觀察效果良好，操作簡便。在此基礎上還可以添加一些更加實用的功能，比如通過更強大的圖像處理功能直接實現腫瘤細胞的初步分析標定，使之成為一套實用性更強，功能更完善的自動化系統。

[1] 舍英.現代光學顯微鏡[M].北京：科學出版社，1997.

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[8] 孫鑫，余安萍.VC++深入詳解[M].北京：電子工業出版社，2006.■