芥菜種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系的SRAP分析

（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

芥菜種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系的SRAP分析

李 寧 司 軍 任雪松 宋洪元 李成瓊*

（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

利用SRAP標(biāo)記對(duì)111份芥菜種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，并記載了其形態(tài)特征。從300對(duì)SRAP引物中篩選出21對(duì)多態(tài)性明顯、條帶清晰、反應(yīng)穩(wěn)定的引物組合，共擴(kuò)增出150條條帶，其中106條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為70.67%。SRAP聚類分析結(jié)果表明，111份芥菜材料的遺傳相似系數(shù)在0.38～0.89之間，分為5大類和若干亞類。對(duì)芥菜的葉片性狀及根、莖、葉、薹的發(fā)育狀況等農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查分析，結(jié)果表明111份芥菜材料的遺傳相似系數(shù)在0.39～1.00之間，分為4大類和若干亞類。這兩種方法的聚類結(jié)果基本一致，表明SRAP標(biāo)記可以應(yīng)用于芥菜種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究。

芥菜；農(nóng)藝性狀；SRAP標(biāo)記；遺傳多樣性

芥菜〔Brassica juncea（L.）Czern. et Coss.〕是十字花科蕓薹屬一年或二年生草本植物（魏文麟，1982）。我國(guó)芥菜栽培歷史悠久，分布廣泛，其變種和分化程度超過(guò)同屬的白菜類和甘藍(lán)類蔬菜（楊以耕 等，1989）。20世紀(jì)30年代，我國(guó)開(kāi)始對(duì)芥菜進(jìn)行種內(nèi)定名和分類研究。由于芥菜變種豐富及收集到的材料有限，對(duì)芥菜類蔬菜的分類提出了諸多觀點(diǎn)，但這些研究大多停留在傳統(tǒng)的形態(tài)描述上，而且在形態(tài)學(xué)分類和品種區(qū)分上說(shuō)法不甚一致（孟秋峰 等，2007），給芥菜類蔬菜遺傳育種研究帶來(lái)不便。

SRAP標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于十字花科蕓薹屬作物的種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)、遺傳圖譜構(gòu)建和重要基因標(biāo)記等研究（單曉政 等，2009；謬體云 等，2010；李桂花 等，2011；楊仕春 等，2013）。本試驗(yàn)對(duì)111份芥菜材料進(jìn)行了農(nóng)藝性狀觀察和SRAP標(biāo)記分析，研究芥菜的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，以期為芥菜遺傳育種研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試芥菜材料共111份（表1），均由西南大學(xué)十字花科蔬菜研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)藝性狀調(diào)查 田間試驗(yàn)于2012年9月至2013年3月在西南大學(xué)十字花科蔬菜研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行，每份材料種植30株，常規(guī)田間管理。在產(chǎn)品器官成熟期，每份材料選取10株典型植株，調(diào)查裂片對(duì)數(shù)、葉色、葉形、葉緣、葉裂刻、葉面、蠟粉、刺毛、葉柄形狀、根、莖、葉、薹的形態(tài)特征（表2）。采用NTSYS-pc 2.1軟件進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樹(shù)狀圖。

1.2.2 基因組DNA提取 每份材料分別于生育中期取10株單株的幼嫩葉片，采用改良的CTAB法提取基因組DNA（苗明軍，2010）。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并用蛋白核酸檢測(cè)儀測(cè)定其濃度和純度。

表1供試芥菜材料名稱及來(lái)源地

表2芥菜主要性狀記錄標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜，在相同遷移率位置上有帶記為1，無(wú)帶記為0，構(gòu)建二元數(shù)據(jù)矩陣。采用NTSYS-pc 2.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用SM相似系數(shù)法（Charles，2004）計(jì)算111份芥菜材料的相似系數(shù)。采用非加權(quán)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，得到芥菜親緣關(guān)系樹(shù)狀圖。同時(shí)進(jìn)行多態(tài)性分析，計(jì)算多態(tài)性比率（P）和多態(tài)性信息含量（PIC）（趙永峰 等，2011）。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)藝性狀分析

根據(jù)農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果計(jì)算各材料間的SM相似系數(shù)，111份芥菜材料的相似系數(shù)在0.39～1.00之間。構(gòu)建聚類分析樹(shù)狀圖（圖1），在相似系數(shù)為0.68處將111份芥菜材料分為4大類：I類為薹芥類，共7份材料。Ⅱ 類為葉用芥菜類，共64份材料，在相似系數(shù)為0.74處又分為2個(gè)亞類，其中Ⅱ-a共30份材料，Ⅱ-b共34份材料。Ⅲ類為莖用芥菜類，在相似系數(shù)為0.72處又分為3個(gè)亞類，其中Ⅲ-a為莖瘤芥類，共14份材料；Ⅲ-b為筍子芥類，共7份材料；Ⅲ-c為抱子芥類，共6份材料。Ⅳ類為根芥類，共13份材料。

2.2 SRAP標(biāo)記聚類分析

利用21對(duì)引物對(duì)111份芥菜材料進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出150條條帶，其中多態(tài)性條帶106條，多態(tài)性比率為70.67%，多態(tài)性信息含量平均值為0.87（表3）。引物me14-em1擴(kuò)增出的條帶數(shù)最多，為11條，其對(duì)部分芥菜材料的擴(kuò)增圖譜見(jiàn)圖2；引物me9-em9和me14-em6擴(kuò)增出的條帶數(shù)最少，均為4條。多態(tài)性最高的引物是me20-em4和me4-em1，多態(tài)性比率均達(dá)100%；多態(tài)性信息含量最高的引物是me14-em1，為0.93。說(shuō)明SARP標(biāo)記擴(kuò)增效率高且多態(tài)性好。

根據(jù)SRAP擴(kuò)增結(jié)果計(jì)算各材料間的SM相似系數(shù)，111份芥菜材料的相似系數(shù)在0.38～0.89之間，表現(xiàn)出豐富的多樣性。其中香芥菜和特選棒菜之間的相似系數(shù)最小，為0.38，表明其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；特大兒菜和神女峰兒菜之間的遺傳相似系數(shù)最大，為0.89，表明其親緣關(guān)系較近。

截至2018年6月底，全縣培育壯大專業(yè)合作社、農(nóng)業(yè)企業(yè)等1000個(gè)，發(fā)展“黃水人家”1000戶；農(nóng)業(yè)實(shí)現(xiàn)“成百上千”目標(biāo)（即建成100萬(wàn)畝特色種植基地和1000萬(wàn)只／頭養(yǎng)殖基地）；各類生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)主體帶動(dòng)貧困戶增收脫貧實(shí)現(xiàn)了全覆蓋。

構(gòu)建SRAP聚類分析樹(shù)狀圖（圖3），在相似系數(shù)為0.584處將111份芥菜材料分為5類：Ⅰ類為薹芥類，共4份材料，該類芥菜抽薹早，花莖或側(cè)薹發(fā)達(dá)，為主要食用部位。Ⅱ類共90份材料，主要為葉用芥菜類和莖用芥菜類，這類芥菜地上部分發(fā)達(dá)，葉或者莖為主要食用部位，在相似系數(shù)為0.638處又分為5個(gè)亞類：Ⅱ-a共44份材料，包括所有莖用芥菜類和極少數(shù)葉用芥菜類，可分為筍子芥、葉芥、抱子芥和莖瘤芥4個(gè)分支（筍子芥肉質(zhì)莖為棒狀，無(wú)明顯突起物；抱子芥莖及各側(cè)芽肥大，側(cè)芽為紡錘形或圓錐形；莖瘤芥肉質(zhì)莖為紡錘形、近球形或扁球形，莖上有瘤狀凸起物）；Ⅱ-b、Ⅱ-c、Ⅱ-d、Ⅱ-e均為葉用芥菜類，主要食用部位為葉片，包括大葉芥、小葉芥、卷心芥、結(jié)球芥、寬柄芥、長(zhǎng)柄芥、花葉芥、葉瘤芥等，這些形態(tài)各異的葉用芥菜在SRAP標(biāo)記聚類分析中并未明顯分類，Ⅱ-b共20份材料， Ⅱ-c共22份材料，Ⅱ-d共3份材料，Ⅱ-e僅1份材料。Ⅲ 類為根芥類，共11份材料，該類芥菜根部膨大，多為圓柱形或圓錐形，肉質(zhì)根為主要食用部位。Ⅳ類共3份材料，該類芥菜葉色均為紫紅色，為紫葉芥菜類。Ⅴ類共3份材料，為薹芥和長(zhǎng)柄芥。

圖1 111份芥菜材料農(nóng)藝性狀聚類分析樹(shù)狀圖（UPGMA法）

表3 21對(duì)SRAP引物組合對(duì)111份芥菜材料的擴(kuò)增結(jié)果

圖2引物me14-em1對(duì)部分芥菜材料的SRAP擴(kuò)增圖譜

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)利用SRAP標(biāo)記對(duì)111份芥菜材料進(jìn)行分析，結(jié)果表明芥菜在分子水平上遺傳多樣性較豐富，這可能是由于芥菜在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中為適應(yīng)不同環(huán)境分化出了不同的種質(zhì)資源。其中特大兒菜和神女峰兒菜之間的遺傳相似系數(shù)最大，為0.89，親緣關(guān)系較近，可能為同物異名；香芥菜與其他芥菜材料之間的遺傳相似系數(shù)均較小，在0.38～0.68之間，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，有利于育種材料的篩選。

圖3 111份芥菜材料SRAP標(biāo)記聚類分析樹(shù)狀圖（UPGMA法）

SRAP聚類分析結(jié)果表明，111份芥菜種質(zhì)可分為5類，Ⅰ類為薹芥類，Ⅱ類為葉用芥菜類和莖用芥菜類，Ⅲ類為根芥類，Ⅳ類為紫葉芥菜類，Ⅴ類為薹芥類和長(zhǎng)柄芥類；在Ⅱ類中，莖用芥菜類和少數(shù)葉用芥菜類聚為一個(gè)亞類，分為筍子芥、莖瘤芥、抱子芥和葉芥4個(gè)分支。此結(jié)果與付杰（2005）、齊曉花（2009）、宋明等（2009）利用AFLP、RAPD、ISSR等分子標(biāo)記技術(shù)研究芥菜遺傳多樣性的結(jié)果不同。在前人的研究中，許多形態(tài)上相近的芥菜種質(zhì)并未聚為一類，各種群之間存在混雜聚類，而本試驗(yàn)結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類結(jié)果（劉佩瑛，1995）總體一致，這可能與不同分子標(biāo)記所揭示的基因組片段的變異方式不同有關(guān)。

SRAP聚類分析結(jié)果與根據(jù)表型特征分類的結(jié)果總體一致，多數(shù)種質(zhì)資源之間的親緣關(guān)系與不同器官變異有較大的相關(guān)性；但兩種方法的聚類結(jié)果也存在一些差別，主要體現(xiàn)在：① 親緣關(guān)系方面，表型特征聚類結(jié)果表明薹芥和葉芥親緣關(guān)系較近，而根芥與其他芥菜類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；SRAP聚類結(jié)果表明葉芥和莖芥親緣關(guān)系較近，而薹芥與其他芥菜類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。② SRAP聚類分析將3份葉片為紫色的芥菜聚為一類，而在表型特征分類中并未體現(xiàn)出來(lái)。③ 在SRAP聚類結(jié)果中少數(shù)葉芥與莖芥聚為一類。存在這些差異可能是由于長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，自然選擇和人工選擇的雙重作用對(duì)芥菜的表型影響較大，而對(duì)芥菜的基因型影響較小，促使一些表型差異較大的芥菜有相似的基因遺傳背景。在聚類分析中，基于表型特征的分類體現(xiàn)了芥菜形態(tài)學(xué)特征，而SRAP標(biāo)記分析則體現(xiàn)了芥菜基因型的特點(diǎn)，兩種方法結(jié)合運(yùn)用能更好地指導(dǎo)芥菜育種工作的進(jìn)行。

研究表明雜種優(yōu)勢(shì)的強(qiáng)弱取決于雙親性狀間的互補(bǔ)性，在一定范圍內(nèi)雙親的基因型差異越大，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，雜種優(yōu)勢(shì)越明顯（Burton et al.，2004；Seyis et al.，2006；丘漫宇 等，2012）。在育種過(guò)程中單憑表型性狀選擇的親本，其基因型遺傳背景可能相似，不利于育種工作的進(jìn)行，因此有必要結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)芥菜種質(zhì)進(jìn)行更深入研究，為芥菜種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)、利用等提供更科學(xué)的依據(jù)。

付杰．2005．中國(guó)芥菜遺傳多樣性與親緣關(guān)系的研究〔碩士論文〕．杭州：浙江大學(xué)．

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Abstract：The paper analyzed the genetic diversity of 111 mustards 〔Brassica juncea（L.）Czern. et Coss.〕materials using SRAP markers，and recorded their morphological characteristics．21 primer combinations with high polymorphism were screened from 300 SRAP primer combinations．106 polymorphic bands among 150 bands were amplified by 21 SRAP primer combinations，and the polymorphic rate was 70.67%．The SRAP clustering results showed that the genetic similarity of 111 mustards ranged from 0.38 to 0.89，and 111 mustards were divided into 5 groups and several subgroups．The agronomic traits including leaf blade traits，and root，stem，leaf，bolting development were investigated and analyzed．The results showed that the genetic similarity of 111 mustards ranged from 0.39 to 1.00，and they could be divided into 4 groups and several subgroups．These two results were nearly the same，indicating that SRAP markers could be applied in studying the genetic diversity and relationships of mustard germplasm resources．

SRAP Analysis of Mustard Germplasm Genetic Diversity and Genetic Relationship

LI Ning，SI Jun，REN Xue-song，SONG Hong-yuan，LI Cheng-qiong*

（Key Laboratory of Olericulture，Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions，Ministry of Education，College of Horticulture and Landscape Architecture，Southwest University，Chongqing 400715，China）

Mustard；Agronomic trait；SRAP marker；Genetic diversity

李寧，女，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜育種學(xué)與生物技術(shù)，E-mail：891993844@qq.com

*通訊作者（Corresponding author）：李成瓊，女，教授，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜育種學(xué)與生物技術(shù)，E-mail： chqli@swu.edu.cn

2013-12-20；接受日期：2014-02-19

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD02B01），重慶市農(nóng)作物良種創(chuàng)新工程資助項(xiàng)目〔CSTC2012GG（80005）〕，星火計(jì)劃項(xiàng)目（2011GA811001），中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資金資助項(xiàng)目（XDJK2010C068），中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資金資助項(xiàng)目（XDJK2010C069）