氣體分子信號硫化氫和缺血再灌注損傷

馮磊綜述 李文志審校

綜 述

氣體分子信號硫化氫和缺血再灌注損傷

馮磊綜述 李文志審校

缺血再灌注損傷；炎性反應；硫化氫

氣體信號分子為脂溶性，內源產生的氣體信號分子可以自由通過細胞膜，到達細胞的內部，直接激活細胞內的目標，減少膜結合受體的需要。氣體信號分子家族包括3個主要成員：NO、CO、H2S。H2S是最后發現和描述的氣體信號分子，其性質與其他2個氣體超家族的成員一樣，在缺血再灌注損傷中的作用逐漸闡明。調控內源性H2S的生成，應用外源性H2S在多種器官組織已經證明其有細胞保護作用。Warenycia等[1]在研究急性H2S中毒的時候首先報道了機體可以產生極低濃度的H2S。Abe 等證明H2S是一種內源性神經調節劑，生理濃度的H2S可以提高NMDA受體介導的反應，以及在海馬的長時程電位起作用。另有報道一種合成H2S的酶存在于回腸、門靜脈和胸部大血管，因此推測H2S可能是一種內源性的平滑肌松弛劑。

1 H2S的生理作用

在哺乳動物組織有3種催化H2S合成的酶：胱硫醚β-合成酶(CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(CSE)和3MST。在多種組織中，主要是CBS和CSE催化生成H2S。最初認為腦組織中CBS通過激活Ca2+/鈣調蛋白通路是產生H2S的主要方式，但研究發現腦組織內90%的H2S是由3MST催化生成的。L-半胱氨酸、α-酮戊二酸和半胱氨酸氨基轉移酶在3MST的催化作用下生成H2S[2]。

在生理條件下，2/3的H2S解離為H+和HS-，剩下的1/3以非解離形式存在。體內產生的大多數H2S在線粒體氧化為硫酸。剩下的H2S經S-腺苷甲硫氨酸甲基化生成甲硫醇和二甲硫，或者結合正鐵血紅蛋白形成硫高鐵血紅蛋白。硫酸和硫代硫酸鹽是H2S主要終產物，主要經尿液排泄。

2 內源性/外源性H2S的細胞保護作用

H2S的生理作用使其成為心臟、腦、肝、腎和肺缺血再灌注損傷的保護劑。近幾年，內源性和外源性H2S的細胞保護作用在體內和體外缺血性損傷的模型中得到證實[3]。內源性H2S的作用最初應用藥理學抑制劑CGL研究，而研究外源性H2S的作用是通過應用NaHS、Na2S或者吸入H2S氣體[4]。

2.1 H2S與心肌缺血再灌注 一系列研究證明H2S在心肌缺血再灌注損傷中具有細胞保護作用[5，6]。Johansen研究H2S在心肌缺血再灌注損傷中的保護作用，在灌注前10min，維持至再灌注后10min持續給予NaHS(1μmol/L)，觀察到梗死面積減小接近20%。Bian等[7]研究離體心臟在局部缺血情況下內源性產生的H2S和外源性應用NaHS對心臟節律的影響，發現給予NaHS治療組由缺血再灌注引起的心律失常的持續時間和嚴重性會顯著減輕。Bliksoen證明在心臟缺血再灌損傷中，應用H2S缺血預處理，涉及了H2S參與的蛋白激酶磷酸化，梗死面積顯著減少，說明內源性H2S在心肌缺血再灌注損傷起到關鍵作用。內源性和外源性H2S的心臟保護作用都得到了證實。Sivarajah等[8]首先證實在心肌損傷中內源性H2S有細胞保護作用，增加內源性H2S的生成與外源性應用H2S具有相似的細胞保護作用。抑制內源性H2S的生成可以引起高血壓和減少內皮依賴性血管舒張，同樣小鼠的心肌缺血再灌注損傷會加重[9]。體內和體外的研究表明內源性和外源性H2S有心肌細胞保護作用，H2S對心血管疾病可能有治療作用。

2.2 H2S與腦缺血再灌注 已有研究表明缺血再灌注損傷引起的氧化應激主要損傷神經細胞。體外研究H2S對神經細胞氧化應激的細胞保護作用，采用的谷氨酸鹽和NaHS，結果表明NaHS可以防止神經細胞的谷氨酸鹽毒性作用。Kimura等[10]證明H2S的神經細胞抗氧化作用不是本身的功能，而是增加了具有強抗氧化作用的谷胱甘肽的生成。然而更多的研究表明體內極低濃度的H2S具有保護作用。Florian研究大鼠在全腦缺血期間吸入H2S氣體，使大鼠腦內H2S的濃度從(1.12±4.6) μg/g增加到(2.70±5.3) μg/g，可以使梗死面積減少50%。 Minamishima等[11]采用鼠科動物心臟驟停/心肺復蘇的模型來研究H2S(Na2S, 0.55 mg/kg)的神經細胞保護作用。在大鼠心肺復蘇前1min經股靜脈給予Na2S，觀察到其可以改善神經功能，減少海馬區活化的凋亡蛋白Caspase-3，增加大腦皮質磷酸化的抗凋亡蛋白GSK-3β。

以上研究揭示了H2S多樣的神經保護作用。體內和體外研究表明低濃度的H2S在腦內參與氧化應激反應。然而，高濃度的H2S在急性腦卒中模型中既有加重腦損傷作用，也有神經細胞保護作用。

2.3 H2S與肝臟缺血再灌注 H2S的細胞保護作用也涉及肝臟。Jha[12]證明在小鼠肝臟經歷60min缺血，5 h再灌注，H2S具有肝細胞保護作用。在再灌注前5 min檢測天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和丙氨酸氨基轉移酶(ALT)，此時這2種酶顯著升高。經Na2S治療后，AST下降71%，ALT下降69%，證明了H2S可以減輕肝臟缺血再灌注損傷。H2S的肝細胞保護作用是通過降低脂質過氧化，增加抗氧化信號，增加抗凋亡信號的表達實現的。

2.4 H2S與腎缺血再灌注 Tripatara研究內源性與外源性H2S在腎臟缺血再灌注損傷中的作用。在缺血前1h給予CSE的抑制劑 PAG，發現大鼠血漿肌酸水平升高，腎功能下降。在實行雙側腎動脈結扎的大鼠，在缺血前15 min給予NaHS，觀察到腎功能顯著提高，這說明H2S在腎臟缺血損傷中起到關鍵作用。Xu等[3]發現腎臟經歷45 min缺血，6 h再灌注會影響H2S和肌酸的濃度，在大鼠腎臟缺血過程，會觀察到H2S的濃度顯著下降，血漿肌酸水平顯著上升。證明在腎臟缺血再灌注過程中腎臟損傷來源于CBS活性降低。H2S能改善腎功能障礙相關的缺血損傷，改善腎臟供血，增高肌酐清除率，減輕氧化損傷[13]。

2.5 H2S與肺缺血再灌注 Fu等發現H2S可以作為一種肺保護藥物。他們發現在大鼠肺缺血再灌注損傷中，肺缺血引起CSE的活性增加46%，引起H2S的濃度增加54%。他們在肺缺血前5 min用H2S氣體(50μmol/L,100μmol/L)灌注大鼠肺組織，在肺組織形態學方面，經過H2S預處理的肺組織肺功能得到明顯的改善。H2S也可以改善缺血再灌注過程中肺組織的組織學改變，改善肺的通氣速率，降低肺的干濕比，改善肺組織順應性。丙二醛常用于測定細胞內氧化水平，他們發現H2S能顯著降低細胞內丙二醛的水平，說明H2S可以減輕肺的氧化應激損傷。

2.6 H2S與腸缺血再灌注 在體外培養的大鼠腸細胞分別缺氧1h、2h或3h，均復氧3h，均在缺氧(或缺血)前20min給予NaHS，發現H2S(10μmol/L)可使缺氧1h的細胞凋亡指數明顯減低；缺氧3h后給予1μmol/L、10μmol/L和 100μmol/L H2S同樣可使細胞凋亡指數明顯降低。在大鼠體內H2S(10μmol/L或100μmol/L)可使I/R(1h/3h)的腸保持正常的顏色、絨毛形態，缺血2h再灌注3h后，只有10μmol/L H2S處理的腸沒有損傷，上述研究表明H2S可明顯減輕腸的I/R損傷[14，15]。

2.7 H2S與肌肉缺血再灌注 在培養的小鼠骨骼肌細胞缺氧復氧模型中，發現給予10μmol/L H2S其保護作用明顯。在小鼠下肢骨骼肌I/R(3h/3h)模型中，10μmol/L H2S可明顯減輕I/R所致的細胞損傷，降低凋亡指數[16]。

3 H2S的作用機制

3.1 KATP Bian等[7]對離體心肌細胞I/R(9 min/10min)研究表明，在缺血前間斷3次給予NaHS(100μmol/L,每次3min)可明顯減輕I/R損傷作用，細胞活力增強，細胞內鈣濃度降低，給予膜KATP特異性抑制劑HMR-1098和非選擇性KATP抑制劑格列苯脲均使NaHS對大鼠心肌I/R的保護作用消失，而給予線粒體KATP通道抑制劑(5-HD，100μmol/L)無上述作用，說明膜KATP在H2S減輕心肌I/R中發揮著重要作用。

以上研究表明，H2S在許多器官系統有保護作用。研究H2S在這些器官系統的作用機制很重要。在神經系統，H2S作為神經調質，通過誘導cAMP生成來調節NMDA受體，作為過氧化硝基的抑制劑。在心血管系統，已經證明H2S有許多生理作用：血管舒張劑，通過開放KATP發揮抗凋亡作用[17]，通過氧化磷酸化Akt發揮降壓作用，調節白細胞介導的炎性反應，上調抗炎信號，通過保護線粒體功能發揮細胞保護作用。

3.2 H2S和凋亡 H2S的心臟保護作用的機制不只局限于調節KATP和鈣超載。有許多證據表明H2S在心肌缺血再灌注中還有抗凋亡作用。激活的2個重要細胞存活通路，細胞外信號調節通路(ERK1/2)/絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI-3-kinase)，他們與PKCε相互作用或者分別抑制Bad和Caspase-9，鈍化促凋亡通路。Elrod等[18]用成熟的離體肌細胞，經歷6 h缺氧，12h再灌注，發現經過NaHS治療的肌細胞會減少Caspase-3的激活，同樣會減少片段樣的DNA產生。這些數據表明在心肌缺血再灌注后H2S會抑制凋亡的級聯。另外，Sivarajah等證明大鼠心臟局部缺血再灌注會增加心臟磷酸化的p38、MAPK、JNK1/2以及促凋亡蛋白，但是在缺血前15 min給予NaHS會顯著減少磷酸化的 p38、MAPK和JNK1/2。另一種促凋亡蛋白、細胞色素C是電子傳遞鏈的基本成分，一旦受到促凋亡的刺激，會把電子從線粒體傳遞到細胞質。它會激活另一種凋亡蛋白，包括凋亡的活化劑Caspase-3。經過 Na2S治療的小鼠會增加未活化的Caspase-3，減少活化的Caspase-3，減少線粒體內細胞色素C轉移至細胞質。因此， Na2S在心肌缺血再灌注中保護心臟組織、防止凋亡信號的激活。

信號轉導與轉錄激活通路(STAT)在心肌梗死中參與重要的心肌反應，高表達STAT-3亞型，表現出心臟保護作用。抑制STAT-3亞型會增加Caspase-3在心臟中的表達，因此會加重缺血再灌注損傷[19]。Calvert等[5]證明在體內H2S通過磷酸化PKCε和STAT-3，抑制了促凋亡因子Bad、上調了促存活因子Bcl-2和Bax-xL、上調熱休克蛋白。因此，證明H2S在心肌缺血再灌注損傷中有抗凋亡作用。

3.3 H2S與保護線粒體 一個細胞的生存能力依靠線粒體的功能。缺血再灌注期間，線粒體經歷氧剝奪、活性氧族產生過剩、線粒體膜超極化。Roth等證明高濃度的H2S在小鼠體內可以引起體溫過低，通過抑制細胞色素C氧化酶，導致代謝率下降和核心溫度降低。Elrod在體外模型利用Na2S治療來評價H2S介導的線粒體保護的可能機制，他們利用離體的線粒體，缺氧30min后，用Na2S (10μmol/L)治療后，缺氧后呼吸速率有很好的恢復。小鼠在再灌注期間給予Na2S治療，也會減少線粒體腫脹，增加線粒體基質密度。

3.4 H2S和炎性反應 炎性反應是缺血再灌注損傷早期的主要組成。發現H2S的供體可以顯著降低血漿內促炎介質白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，同時會增加抗炎介質白細胞介素-10(IL-10)，其他的研究也表明這些機制可能參與H2S的抗炎反應。缺血再灌注后，早期的炎性反應使白細胞黏附內皮細胞。Zanardo等[20]證明H2S是一種內源性調節劑，調節白細胞介素與內皮的相互作用。在白細胞黏附前30min給予Na2S (1～100μmol/kg) 或者NaHS (100μmol/kg)，觀察到應用H2S治療大鼠會減少白細胞黏附內皮細胞，并且呈劑量依賴性。許多機制研究H2S在缺血再灌注后保護組織防止炎性損傷。H2S作為一個炎性調節器的作用越來越得到認可。

4 小結

無論是內源性還是外源性的H2S，其在身體各處缺血再灌注損傷中都有保護功能。其中涉及的機制包括：通過開放 KATP通道控制細胞內Ca2+的濃度、激活抗凋亡通絡(ERK1/2/MAPK、PI-3kinase/Akt, JAK-STAT)、通過保持線粒體膜電位和抑制mPTP 開放來保護線粒體功能、通過激活eNOS和 p38MAPK發揮抗炎作用。自從發現了H2S的細胞保護作用，上調內源性H2S的產生或者提供生成H2S的有效供體成為科學家和臨床醫師的焦點。雖然H2S在缺血再灌注損傷中有治療作用，潛在的問題是傳統的H2S供體如NaHS和Na2S，作用時間短，不能連續釋放H2S[21～23]。

雖然H2S的生理作用和細胞保護作用已經得到證實，但其中涉及的機制還沒有完全了解。在過去的20年中，H2S已經從一個毒性氣體變成了一個有治療缺血再灌注潛在作用的治療藥物。最近的研究揭示了在多種組織的缺血性損傷中，H2S有許多有益作用。例如，在缺血前或者缺血時，內源性或者外源性應用H2S都有心肌細胞保護作用、H2S引起的體溫過低可以起到神經細胞保護作用、通過減少脂質過氧化和增加抗氧化、抗凋亡信號起到肝細胞保護作用、通過激活 CBS起到腎臟保護作用、通過激活 CSE防止肺缺血性損傷。盡管關于H2S在不同器官的生理作用的研究有許多進展，但仍有很大的研究空間。

1 Warenycia MW,Goodwin LR,Francom DM,et al.Dithiothreitol liberates non-acid sulfide from brain tissue of H2S-poisoned animals[J].Arch Toxicol,1990,64(8):650-655.

2 Shibuya N, Tanaka M, Yoshida M, et al. 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase produces hydrogen sulfide and bound sulfane sulfur in the brain[J]. Antioxid Redox Signal，2009，11(4):703-714.

3 Xu Z, Prathapasinghe G, Wu N, et al. Ischemia-reperfusion reduces cystathionine-beta-synthase-mediated hydrogen sulfide generation in the kidney[J]. Am J Physiol Renal Physiol，2009，297(1):F27-35.

4 康凱，姜洪池.氣體信號分子硫化氫與疾病[J].中國普外基礎與臨床雜志，2009，16(2)：170-173.

5 Calvert JW, Jha S, Gundewar S, et al. Hydrogen sulfide mediates cardioprotection through nrf2signaling[J]. Circ Res，2009，105(4):365-374.

6 Osipov RM, Robich MP, Feng J, et al. Effect of hydrogen sulfide in a porcine model of myocardial ischemia-reperfusion:comparison of different administration regimens and characterization of the cellular mechanisms of protection[J]. J Cardiovasc Pharmacol，2009，54(4):287-297.

7 Bian J S，Yong Q c，Pan TT，et a1．Role of hydrogen sulfide in the cardioprotection caused by ischemic preconditioning in the rat heart and cardiac myocytes[J]．J Pharmacol Exp Ther，2006，316(2)：670-678．

8 Sivarajah A, Collino M, Yasin M, et al. Anti apoptotic and anti-inflammatory effects of hydrogen sulfide in a rat model of regional myocardial i/r[J]. Shock，2009，31(3):267-274.

9 Calvert JW, Coetzee WA, Lefer DJ. Novel insights into hydrogen sulfide mediated cytoprotection[J].Antioxid Redox Signal，2009，94(7)：805-814.

10 Kimura Y, Goto Y, Kimura H. Hydrogen sulfide increases glutathione production and suppresses oxidative stress in mitochondria[J]. Antioxid Redox Signal，2010，12(1):1-13.

11 Minamishima S, Bougaki M, Sips PY, et al.Hydrogen sulfide improves survival after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation via a nitric oxide synthase 3-dependent mechanism in mice[J].Circulation，2009，120(10):888-896.

12 Jha S, Calvert JW, Duranski MR, et al. Hydrogen sulfide attenuates hepatic ischemia-reperfusion injury: role of antioxidant and antiapoptotic signaling[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，295(2):H801-806.

13 Ganster F，Burban M，de La Bourdonnaye M，et a1．Effects of hydrogen sulfide on hemodynamics，inflammatory response and oxidative stress during resuscitated hemorrhagic shock in rats[J]．Crit Care，2010，14(5)：R165.

14 Henderson PW，Weinstein AL，Sung J，et a1．Hydrogen sulfide attenuates ischemia-reperfusion injury in in vitro and in vivo models of intestine free tissue transfer[J]．Plast Re constr Surg，2011，127(1)：487-488．

15 王新寶.氣體信號分子硫化氫與缺血再灌注損傷[J].首都醫科大學學報，2012,33(1)：131-135.

16 Henderson P W，Singh S P，Weinstein A L，et a1．Therapeutic metabolic inhibition：hydrogen sulfide significantly mitigates skeletal muscle isehemia reperfusion injury in vitro and in vivo[J]．Plast Reconstr surg，2010，126(6)：1890-1898．

17 Yusof M, Kamada K, Kalogeris T, et al.Hydrogen sulfide triggers late-phase preconditioning in postischemic small intestine by an no- and p38mapk-dependent mechanism[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，296(3):H868-876.

18 Elrod JW, Calvert JW, Morrison J, et al. Hydrogen sulfide attenuates myocardial ischemia reperfusion injury by preservation of mitochondrial function[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2007，104:15560-15565.

19 Wang M, Wang Y, Abarbanell A, et al. Both endogenous and exogenous testosterone decrease myocardial stat3activation and socs3expression after acute ischemia and reperfusion[J]. Surgery，2009，146(2):138-144.

20 Zanardo RC, Brancaleone V, Distrutti E, et al. Hydro-gen sulfide is an endogenous modulator of leukocyte-mediated inflammation[J].FASEB J，2006，20:2118-2120.

21 Florian B, Vintilescu R, Balseanu AT, et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia[J].Neurosci Lett，2008，438(2):180-185.

22 Tyagi N, Moshal KS, Sen U, et al. H2S protects against methionine-induced oxidative stress in brain endothelial cells[J].Antioxid Redox Signal，2009，11(1):25-33.

23 Linden DR, Levitt MD, Farrugia G, et al.Endogenous production of H2S in the gastrointestinal tract: still in search of a physiologic function[J].Antioxid Redox Signal，2010，12(9):1135-1146.

150086 哈爾濱醫科大學附屬第二臨床醫學院麻醉科

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.03.039

2013-07-18)