一種基于干擾肌動蛋白基因?qū)е路叫尉W(wǎng)紋溞(Ceriodaphnia quadrangula)死亡的RNA干擾(RNAi)模型構(gòu)建*

陳宏健 謝 松, 李理想 柳峰松,①

(1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 保定 071002;2.河北省無脊椎動物系統(tǒng)學(xué)與應(yīng)用實驗室 保定 071002)

枝角類是一種小型水生浮游動物,多數(shù)為淡水種,少數(shù)海水種,是魚類的天然餌料之一。由于其形體較小、生長周期短、繁殖速度快、敏感性高,1984年美國 Mount和 Norberg率先利用模糊網(wǎng)紋溞(Ceriodaphnia dubia)進行毒性實驗后,國內(nèi)外研究人員已經(jīng)將其發(fā)展成為研究病理毒理的重要實驗動物(Koivisto,1995;Sarmaet al,2003;Komjarovaet al,2009;Thanhet al,2010)。另外,鑒于枝角類所特有的諸多優(yōu)點,它也是研究水生動物基因功能的良好材料。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指通過雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)特異性地抑制靶基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的現(xiàn)象,通過人為地引入與內(nèi)源靶基因具有相同序列的 dsRNA,誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因mRNA降解,達(dá)到抑制基因表達(dá)的目的(Gheysenet al,2007;La Fauceet al,2009)。RNAi技術(shù)已發(fā)展成為了基因功能研究的重要手段。目前以化學(xué)合成 siRNA(Small interfering RNA),并以注射、投喂等方法對生物體內(nèi)內(nèi)源基因進行干擾最為常見(Shan,2010)。但化學(xué)合成siRNA的方法價格相對昂貴。近年來,研究者開始致力于采用構(gòu)建 RNA干擾載體,并用細(xì)菌表達(dá)dsRNA的方法來進行RNAi實驗,這種方法的優(yōu)點是價格低廉,并一次能表達(dá)出大量的dsRNA,但在實驗的穩(wěn)定性和特異性方面有待進一步實驗驗證。

肌動蛋白(actin)普遍存在于真核生物,是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要蛋白之一,可分為α、β、γ三種類型。actin的保守性很高,并且在各個發(fā)育時期的表達(dá)量十分穩(wěn)定,因而β-actin常作為基因定量的內(nèi)參之一。由于 actin具有上述特點,故十分適合于研究并在構(gòu)建物種RNAi模型時使用。

本研究中的材料為方形網(wǎng)紋溞,屬枝角目,溞科,網(wǎng)紋溞屬。莊德輝曾對其毒理(莊德輝,1996)及生物學(xué)(莊德輝,1994)方面做了相關(guān)的研究,因此方形網(wǎng)紋溞的生長和繁殖等方面相對清楚。本研究的目的在于以方形網(wǎng)紋溞actin基因為目標(biāo),得到其序列,構(gòu)建其RNAi模型,探討枝角類等水生生物基因功能與表達(dá)規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

2011年 9月在河北保定護城河?xùn)|風(fēng)路段撈取混合溞類,而后對方形網(wǎng)紋溞進行純培養(yǎng)。方法是取一只懷卵的方形網(wǎng)紋溞的孤雌生殖雌體進行培養(yǎng),在其所產(chǎn)生的子代中挑選一只個體大,繁殖量多的雌體進行后續(xù)培養(yǎng),之后所產(chǎn)生的子代即為純種。

1.2 主要試劑與質(zhì)粒菌種

RNAiso Plus、pMD-19T simple vector、T4 連接酶、限制性內(nèi)切酶、SYBR Green為Takara公司產(chǎn)品;Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品、DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒為康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品;引物及測序由南京金斯瑞科技有限公司完成。L4440質(zhì)粒和大腸桿菌 HT115菌種由河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李繼剛博士惠贈。

1.3 方形網(wǎng)紋溞總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

將100只方形網(wǎng)紋溞置于離心管中,加入RNAiso Plus研磨,依照說明書提取總RNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和UV檢測和定量后,取1μg總RNA,以AOLP(序列見表1)為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4 方形網(wǎng)紋溞actin部分cDNA序列的克隆

根據(jù)National Center of Biotechnology Information(NCBI) 網(wǎng) 站 上 大 型溞(Daphnia magna)的actin(GenBank登錄號為AJ292554.1)的mRNA序列設(shè)計引物ACT-F1和ACT-R1(表1)。PCR擴增,反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性3 min;94°C變性30s,55°C退火30s,72°C延伸90s,35個循環(huán);最后72°C延伸10min。電泳分離PCR產(chǎn)物并回收目的片段,連入T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽性克隆后提取質(zhì)粒測序。

1.5 actin的RNA干擾載體Actin-L4440的構(gòu)建

根據(jù)測序得到的actin基因部分cDNA序列,設(shè)計一對引物cACT-LF和cACT-LR(表1),引物5′末端分別引入BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點。PCR擴增得到片段,電泳回收后用BamHⅠ和XhoⅠ對其進行雙酶切,并連入L4440質(zhì)粒,構(gòu)建actin RNAi載體Actin-L4440。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,菌落PCR篩選陽性克隆,擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒測序驗證。

1.6 dsRNA的誘導(dǎo)表達(dá)

用Actin-L4440質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌HT115感受態(tài)細(xì)胞,同時以空載L4440質(zhì)粒作為陰性對照。選取陽性克隆,在含有氨芐青霉素、四環(huán)素的液體LB培養(yǎng)基中于37°C,200 r/min搖菌培養(yǎng)至OD600達(dá)0.8,加入(IPTG)至終濃度為0.8mmol/L誘導(dǎo)5h。12000r/min離心2min收集菌體,并利用RNAiso Plus提取總RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測dsRNA的表達(dá)情況。

1.7 細(xì)菌介導(dǎo)RNA干擾

取上述誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒 Actin-L4440的HT115菌液 200mL,離心收集菌體后用 100mL去離子水(dH2O)重懸,并以每組1mL分裝于試管中。同時,采用轉(zhuǎn)入L4440空載質(zhì)粒的大腸桿菌HT115作為實驗對照,以同樣的方法進行。以60只/組的方形網(wǎng)紋溞(5齡,即2齡成體)加入經(jīng)誘導(dǎo)的Actin-L4440-HT115菌液以及對照 L4440-HT115菌液中(RNAi組與對照組分別設(shè)置多組重復(fù),以滿足后續(xù)實驗的要求)。浸泡12h后分別提取總 RNA,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因,用Real-Time PCR方法對actin的表達(dá)進行定量分析,以確定 RNAi效果,數(shù)據(jù)處理采用 2?ΔΔCT法(Livaket al,2001)以及 SPSS17.0 統(tǒng)計軟件的單因素方差分析(one-way analysis of variance,one-way ANOVA)的方法進行。當(dāng)尾概率P>0.05時,各組數(shù)據(jù)之間無差異;0.01

表1 實驗所用引物Tab.1 Primers used in experiments

2 結(jié)果

2.1 目的基因actin的部分克隆

根據(jù)近緣物種 actin基因序列設(shè)計同源引物,從方形網(wǎng)紋溞中克隆得到其 actin cDNA片段序列,長度為858 bp的序列(見圖1),全部為編碼序列,提交序列至 NCBI,GenBank登錄號為 JX442202。利用NCBI網(wǎng)站的Blastn程序比對發(fā)現(xiàn)(見圖2),此序列與大型溞D.magna(GenBank:AJ292554.1)、蚤狀溞D.pulex(GenBank:AJ245733.1)、美洲狗蜱Dermacentor variabilis(GenBank:EF488512.2)等的actin具有較高相似性(Indentity均為86%)。

圖1 方形網(wǎng)紋溞的部分actin序列Fig.1 A part of actin sequence of C.quadrangular

2.2 RNAi載體的構(gòu)建和dsRNA的誘導(dǎo)表達(dá)

根據(jù)所得actin序列設(shè)計引物擴增得到359bp的片段(見圖1),將其連入L4440質(zhì)粒得到dsRNA表達(dá)載體 Actin-L4440,并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌 HT115。經(jīng)IPTG誘導(dǎo) 5h后,提取 HT115菌體的總 RNA,RNA電泳圖(圖3)顯示,泳道 1和 2為轉(zhuǎn)入 L4440空載質(zhì)粒的HT115的總RNA,其中泳道2為誘導(dǎo)后的L4440空載,它與泳道1在200bp處有差異條帶(載體自身特性),由于它與細(xì)菌 RNA降解的部分發(fā)生重疊,而看不到差異條帶,但空載誘導(dǎo)的序列與方形網(wǎng)紋溞沒有同源關(guān)系,因此在實驗中以此作為對照;泳道3表明 actin序列連入質(zhì)粒,在不誘導(dǎo)情況下無特異的目的條帶;泳道4表明actin序列連入質(zhì)粒,需誘導(dǎo)才產(chǎn)生特異條帶,大小約為500bp。證明泳道4代表的菌液誘導(dǎo)后的目的基因是正確的,數(shù)量上也滿足實驗要求。由此說明成功誘導(dǎo)出dsRNA。

由于細(xì)菌所誘導(dǎo)出來的dsRNA能長時間穩(wěn)定存在(Liet al, 2011;王根洪等,2011;唐婷等,2012),因此可以用于后續(xù)實驗。

2.3 RNAi的結(jié)果與鑒定

Real-time PCR基因定量結(jié)果顯示,投喂表達(dá)actin dsRNA的HT115菌的方形網(wǎng)紋溞actin的相對表達(dá)量明顯低于投喂空載L4440質(zhì)粒的HT115菌的方形網(wǎng)紋溞。經(jīng) ANOVA檢驗,在檢驗水平P≤0.01時,兩組間差異極顯著。投喂12h后,實驗組actin基因的表達(dá)量只是對照組表達(dá)量的15.3%,說明此方法能有效地敲降方形網(wǎng)紋溞actin基因的表達(dá)(圖4)。

同時觀察發(fā)現(xiàn),隨著培養(yǎng)時間增長,actin敲降組方形網(wǎng)紋溞死亡率明顯高于對照組,尤其是 36h后,實驗組死亡率平均值達(dá)到 71.67%,而此時對照組死亡率為37.78%。在48h,實驗組死亡率達(dá)到97.22%,而此時對照組死亡率為54.44%(圖5)。

3 討論

RNAi現(xiàn)象廣泛存在于線蟲、昆蟲、兩棲類及哺乳動物中。在線蟲中發(fā)現(xiàn),RNAi信號能在細(xì)胞與細(xì)胞之間傳播,引發(fā)多數(shù)組織細(xì)胞或全身性的RNAi效應(yīng),稱為系統(tǒng)性基因沉默(systemic gene silencing)。大多數(shù)昆蟲也存在RNAi信號的系統(tǒng)性傳播現(xiàn)象,可以將dsRNA直接注射進昆蟲的卵、血腔或局部組織,引發(fā)遠(yuǎn)距離靶基因的特異性沉默。基于此,開發(fā)出了直接注射或飼喂dsRNA的適用于卵、幼蟲、蛹及成蟲各發(fā)育階段的昆蟲RNAi技術(shù)(何正波等,2009)。但在枝角類動物中能否利用RNAi技術(shù)進行基因敲降尚無報道。

圖2 方形網(wǎng)紋溞actin基因序列與其他物種actin的多序列比對以及序列的GenBank序列號Fig.2 Multiple alignment of actin sequences from C.quadrangular with those of other species Actin序列的GenBank登錄號:Daphnia magna(AJ292554.1);Daphnia pulex(AJ245733.1);Dermacentor variabilis(EF488512.2);Drosophila melanogaster(K00674.1);Culex nigripalpus(EU301432.1);Rhipicephalus haemaphysaloides(HM140790.1)

本研究證實投喂表達(dá)actin dsRNA的大腸桿菌能有效干擾方形網(wǎng)紋溞體內(nèi)基因的表達(dá),證明枝角類動物同樣存在RNAi信號的系統(tǒng)性傳播現(xiàn)象。枝角類可作為水生動物基因功能研究的優(yōu)良材料。如前所述,枝角類有形體較小、生長周期短、繁殖速度快,相對于許多如魚、蝦、貝類等中大型水生生物而言,不會存在繁育期時間長,養(yǎng)殖技術(shù)不完善的問題,而且進行枝角類 RNA干擾時往往以群體的形式進行研究,去除了大型生物只能進行個體研究的不足。另外枝角類可以以細(xì)菌為食,這樣就使得采用投喂方式進行RNAi成為可能。本研究選用5齡的方形網(wǎng)紋溞(即2齡成體,1.0mm左右)作為實驗材料,這是因為經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn),方形網(wǎng)紋溞自幼溞 成長至 5齡的時間并不長,且此期的持續(xù)時間相對較長,這個時期直至之后的齡期其個體變化差別不大(莊德輝,1994),因此 5齡的方形網(wǎng)紋溞是十分適合進行RNAi實驗的齡期。

通過細(xì)菌表達(dá) dsRNA價格低廉,能表達(dá)出大量dsRNA,也易于操作。因此近年來,構(gòu)建并使用dsRNA表達(dá)載體,達(dá)到RNAi效果的方法得到廣泛應(yīng)用(王根洪等,2011;唐婷等,2012)。本文在枝角類中進行的RNAi實驗,能夠為研究水生動物基因功能方法提供一定參考。1:未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的L4440-HT115菌液的總RNA,2:經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的L4440-HT115菌液的總RNA,3:未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的Actin-L4440-HT115菌液的總RNA,4:經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的Actin-L4440-HT115菌液的總RNA,箭頭所示為差異條帶(目的條帶)

圖3 dsRNA的誘導(dǎo)Fig.3 The induction of dsRNA

圖4 定量PCR分析方形網(wǎng)紋溞actin表達(dá)水平Fig.4 The expression analysis of actin from C.quadrangular by real-time quantitative PCR

圖5 投喂dsRNA后C.quadrangula的死亡率Fig.5 The mortality rate of C.quadrangular after fed dsRNA

本研究中,定量 PCR顯示出明顯的基因表達(dá)水平的敲降效果,通過往水體中加入經(jīng)誘導(dǎo)的 Actin-L4440-HT115菌,使得actin受到干擾,引起群體死亡率上升,表明群體水平與分子水平的實驗效果是一致的。由于actin是真核生物細(xì)胞骨架的組成蛋白之一,因此它的表達(dá)量下降可能會導(dǎo)致實驗個體的死亡,本研究的結(jié)果也確實說明了RNAi增加了方形網(wǎng)紋溞的死亡率。

以上研究結(jié)果說明可以對方形網(wǎng)紋溞進行RNAi實驗,且可以通過構(gòu)建 RNAi干擾載體的方法去進行。對 actin基因的干擾后,在宏觀上也能觀察到實驗組種群顯著死亡。可以依此方法,利用RNAi技術(shù)對枝角類乃至與其他水生動物的基因進行研究,通過敲降基因,隨即進行觀察檢測,對這些基因的功能有進一步的闡述,故而具有一定的意義。

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