牙鲆(Paralichthys olivaceus)β諾達病毒衣殼蛋白重組表達及復性條件優化*

蔣嫣冉 張亦陳① 劉逸塵 耿緒云 孫金生,

(1.天津市動植物抗性重點實驗室 天津師范大學生命科學學院 天津 300387;2.天津市水生動物疫病預防控制中心 天津 300221)

β諾達病毒(Betanodavirus)亦被稱為神經壞死病毒(viral nervous necrosis,NNV),是已發現的最小魚類病毒(Chiet al,2001;Groveet al,2003;黃劍南等,2005),其基因組包括2條正義的、不含有poly(A)末端的單鏈RNA,分別為RNA1和RNA2。RNA1的大小約為3.1kb,編碼非結構A蛋白,A蛋白是病毒的依賴RNA的RNA聚合酶(RNA-dependant RNA polymerase,RdRp)(Johnsonet al,2000;Tanet al,2001)。RNA2 的大小約為 1.4kb,編碼病毒主衣殼蛋白(major capsid protein,MCP)(Krondiriset al,2002)。該病毒能感染5個目17科的40多種經濟魚類,引發病毒性神經壞死癥(Viral nervous necrosis,VNN),對仔魚和稚魚的致死率極高,是國際獸疫組織確定的嚴重疫病[Mundayet al,1992;世界動物衛生組織(OIE)魚病專家委員會,2001]。該病自1985年暴發至今,已在世界范圍蔓延,我國水產養殖也深受其害。Lin等(2001)首次在我國大陸地區的石斑魚體內分離獲得β諾達病毒,基因型分析顯示屬于 RGNNV型。2006年本實驗室從天津地區養殖牙鲆體內也檢出該病毒(PONNV毒株)(毛海濤,2008),其基因型與RGNNV型相似性最高,這是我國大陸地區首次發現該病毒感染牙鲆的病例,近幾年本地區β諾達病毒感染養殖牙鲆的狀況頻發,亟需建立有效的防控方法。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)屬硬骨魚綱、輻鰭亞綱、鰈形目、鰈亞目、鲆科、牙鲆屬,是名貴海水經濟魚類,極具經濟價值,在我國漁業養殖中占有非常重要的地位。但隨著養殖規模擴大和養殖密度提高,各種病害暴發越來越頻繁,其中由β諾達病毒引起的病毒性神經壞死癥是嚴重危害魚苗的重大病害之一,由于魚苗普遍易感染,且死亡率極高,經濟損失巨大(顧中華等,2012)。研制有針對性的疫苗對病毒性疫病的防控至關重要,基于天然病毒的滅活和減毒疫苗雖然具有較好的免疫效果,但安全性等方面亦存在問題,因此通過基因工程手段制備亞單位疫苗等方法越來越受到重視。利用大腸桿菌表達外源基因,具有工藝簡單、產量高、成本低等優點,但直接表達的蛋白質通常會形成包涵體,需復性后才具有生物學活性,因此,復性效率的高低對產品質量和生產成本至關重要(吳正輝等,2008)。不同蛋白質結構和構象復雜多樣,復性條件差別較大,因此,有針對性地探索目的蛋白的包涵體復性條件對工業化生產具有重要意義。本研究構建了感染牙鲆的β諾達病毒完整衣殼蛋白原核表達載體,優化誘導表達參數,在獲得目的蛋白高效表達的基礎上,利用正交分析獲得包涵體復性的最適條件,為今后的工業化生產提供了重要依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 實驗材料、菌株、質粒E.coliDH5α和BL21(DE3)plsS菌株購自天根生化科技有限公司,表達載體Pet21a和帶有PONNV毒株RNA2完整cDNA序列的質粒RNA2-PMD18T 由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器

試劑:LA-Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內切酶、DL-2000 DNAMarker和Premixed Protein Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司;膠回收試劑盒和質粒小提試劑盒均購自 Axygen;PageRuler Unstained Protein Ladder購自Fermentas。

儀器:PCR儀(Bio-Rad);Duo flow蛋白純化儀(BIO-RAD);LGJ-10C凍干機(北京四環科學儀器廠有限公司);JY92-2D超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司);恒溫培養箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠);蛋白電泳儀(BIO-RAD);微量核酸蛋白測定儀(BIO-RAD);臺式冷凍離心機(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據 PONNV毒株序列特點(KF841612),使用Primer Premier 5.0軟件在其衣殼蛋白完整編碼框兩端設計正反向引物,并在終止密碼子前引入His標簽編碼序列。引物序列如下:正向引物(NYQf0001e):5’-CATATG GTACGCAAAGGTGAG-3’,反向引物(NYQr1014He):5’-AAGCTT AGTGGT GGTGGTGGTGGTGGTTTTCCGAGTCAACCCT-3’。引物序列下劃線為酶切位點。引物由生工生物(上海)有限公司合成。

1.2.2 重組表達載體的構建 使用前述設計的引物,以RNA2-PMD18T質粒為模板擴增病毒衣殼蛋白編碼區,PCR反應體系為:10×LA-Taq buffer 2.5μL,上下游引物(10μmol/L)各 1μL,LA-Taq DNA 聚合酶1U,dNTP(10mmol/L)2μL,模 板 1μL,雙 蒸 水17.3μL。PCR 反應條件為:94°C 預變性 4min;94°C 變性 1min,50—55°C退火 1min(6個循環,每循環降1°C),72°C延伸1min;94°C變性1min,51°C退火1min,72°C延伸1min,24個循環;72°C總延伸 10min。擴增產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳分離,目的條帶采用Axygen凝膠回收試劑盒抽提并以 2.5μL擴增片段,2.1μL Solution I和 0.4μL PMD-18T 載體的體系 16°C連接過夜。連接產物轉化 DH5α感受態細胞,經氨芐平板篩選轉化子進行PCR檢測后送北京華大生物公司測序并保種。抽提帶有克隆片段的質粒和Pet21a質粒,分別經NdeI和HindIII雙酶切后將帶有His標簽的病毒衣殼蛋白克隆片段接入Pet-21a質粒構建表達載體 RNA2-Pet21a,連接接產物轉化DH5α感受態細胞,經 PCR及測序檢測無誤后保存備用。

1.2.3 重組蛋白的誘導表達與質譜鑒定 將 RNA2-Pet21a質粒轉化表達菌株BL21(DE3)plsS,挑取陽性克隆接種于含有氨芐和卡那抗性的LB液體培養基中,37°C震蕩培養至OD = 0.5—0.6,取1mL未誘導菌液作為對照,其余加入 IPTG至終濃度為 1mmol/L,分別于誘導 0.5h、1h、2h、3h、4h、5h收集菌液,10000g離心2min,棄上清。用PBS清洗沉淀后,10000g離心2min 加入 1mL Lysis Buffer(50mmol/L NaH2PO4?2H2O,300mmol/L NaCl,10mmol/L Iminazole),進行超聲破碎,程序為:400W,5s/次,間隔5s,破碎5min,至半透明。4°C,10000g離心20min,收集上清與沉淀,分別適量加 1×SDS上樣緩沖液,煮沸 10min,10000g離心1min后,取上清經 15% SDS-PAGE分離,將目的條帶切下送華大生物科技公司進行質譜鑒定。

1.2.4 重組蛋白的純化 將1L誘導表達的重組菌液經 10000r/min離心 10min收集菌體,按 1g濕菌10mL BufferA破碎緩沖液(含 1% TritionX-100,2mmol/LEDTA)的比例重懸菌體,冰浴超聲破碎3次。破碎后溶液4°C,10000r/min,離心10min,棄去上清留沉淀。BufferB洗滌緩沖液(300mmol/L NaCl,50mmol/L NaH2PO4?2H2O,5mmol/L Iminazole,2mmol/L Urea,pH 7.4)洗滌沉淀3次,可得初步純包涵體。上述包涵體經 WashI buffer(500mmol/L NaCl,20mmol/L Iminazole,20mmol PB,8mol/L Urea)溶解,渦旋振蕩20min,4°C,10000r/min離心10min,上清經0.22μm濾膜過濾后結合于鎳離子親和柱純化,具體操作按照Bio-Scale Mini profanity IMAC操作手冊進行。

1.2.5 重組蛋白復性條件優化 參考稀釋復性主要優化條件(吳正輝等,2008;龐懷宇等,2010),以大腸桿菌表達產生的重組衣殼蛋白包涵體為材料,利用正交試驗優化重組蛋白的稀釋復性條件。以鹽離子濃度即PBS濃度(A)、尿素濃度(B)、溫度(C)以及 pH(D)四個因素做為主要優化參數,針對每個參數設置 4個實驗條件進行綜合正交分析,研究不同因素對重組蛋白復性影響的大小并找出適宜的匹配條件。參照表1設計將分別將 400μL濃度為1.06μg/μL的重組包涵體蛋白溶液加入到 4mL不同復性緩沖液中在不同溫度下復性 12h。復性產物10000g離心10min,收集上清凍干后用1×PBS溶解,利用微量核酸蛋白測定儀進行蛋白濃度測定,計算可溶蛋白總量。

表1 重組蛋白復性中的因素與水平參數值Tab.1 Refolding factors and levels of recombinant protein

2 結果

2.1 原核表達載體的構建

以RNA2-PMD18T質粒為模板,利用引物NYQf0001e和NYQr1014He擴增長度為1017bp的β諾達病毒衣殼蛋白編碼區,電泳檢測在約1kb處有單一條帶,測序結果與預期一致。目的片段經HindIII和NdeI雙酶切連入表達載體Pet-21a,測序顯示含有T7啟動子驅動的C端融合His標簽的完整病毒衣殼蛋白表達盒,表明載體構建成功。

2.2 目的蛋白誘導表達與質譜鑒定

含有RNA2-Pet21a表達載體的大腸桿菌在37°C條件下培養至OD = 0.5—0.6,加入IPTG至終濃度為1mmol/L,進行誘導表達,分別在0、0.5、1、2、3、4、5h點取樣,破碎菌體后分別取上清和沉淀,經15%SDS-PAGE分離檢測。結果顯示對照組在預期大小沒有明顯條帶,實驗組在 37kDa左右有預期大小條帶,且隨誘導時間延長表達量也隨之增加并在約5h后達到峰值(圖1)。用潔凈手術刀小心切取目標條帶經質譜鑒定,利用 LC-ESI-MS進行分析和鑒定,結果采用BioWorks軟件與SEQUEST數據庫進行比對,發現目標蛋白有-ISQAVLPAGTGTDGYVVVDATIVPDLLPR-、-LILLCVGNNTDVVNVSVLC R-、-FAGNAGTPAGWFR-、-QILLPVGTVCTR-4條肽段與預期蛋白中的相應氨基酸序列完全匹配(圖2),由此判定上述蛋白條帶即為表達的重組衣殼蛋白。

圖1 重組衣殼蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)plsS中的表達Fig.1 Expression of recombinant capsid protein in E.coli BL21(DE3)plsS

2.3 衣殼蛋白純化及復性條件優化

離心收集誘導后的發酵菌體,破碎后取上清經鎳離子親和柱純化,SDS-PAGE電泳檢測表明獲得單一條帶,純度>98%(圖3)。正交試驗中包涵體溶液經12h稀釋復性后,離心取上清,凍干后用1×PBS溶解并測量蛋白濃度,計算可溶蛋白總量。測量結果見表2,直接分析表明,重組衣殼蛋白初步復性的最佳條件為A1B1C1D1,即在溫度為4°C,復性緩沖液中PBS濃度0.05mol/L,尿素濃度0.8mol/L,pH為7的條件下復性效果最好,其復性前蛋白總量為 424μg,復性后可溶蛋白總量為73.08μg,蛋白復性率為17.24%。極差大小為B >D >A >C,表明尿素濃度對重組蛋白復性的影響最大,其次是復性緩沖液的pH,PBS濃度和溫度對復性影響較小。方差分析結果見表3,計算得到因素的偏差平方和、自由度、F比、臨界值,顯示出各因素對重組蛋白復性影響的顯著性,因素顯著性程度為B >D >C >A。

圖2 重組蛋白的質譜鑒定Fig.2 Mass spectrum verified the recombinant capsid protein

圖3 純化后重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein

表2 L16(4)4正交試驗結果分析Tab.2 Analysis of orthogonal test

3 討論

諾達病毒(Nodaviradae)可分為主要感染昆蟲的α諾達病毒屬(Alphanodavirus)以及以魚類為主要感染對象的β諾達病毒屬(Betanodavirus)(劉傳鳳等,2011),其中β諾達病毒根據來源、感染宿主以及致病性等方面的不同可分為4種基因型。β諾達病毒衣殼蛋白具有大量抗原表位,可誘導宿主產生保護性抗體,因此可通過體外表達該病毒的衣殼蛋白來研制抗病毒疫苗(Hegdeet al,2002)。但是,不同β諾達病毒株系衣殼蛋白之間雖具有較高的相似性,但也存在差異,主要原因是其復制所依賴的聚合酶RdRp校正能力弱,容易引發突變,從而產生針對不同宿主細胞表面受體的表位,因此該病毒具有非常廣泛的宿主侵染性?；讦轮Z達病毒這一特點,有必要研制有針對性的疫苗產品,以提高保護效率;另一方面也可為進一步研究其與特定宿主細胞表面相互識別及結合位點的信息提供參考。近年來已有一些研究嘗試利用原核表達系統制備β諾達病毒衣殼蛋白。陳曉艷等(2005)將斜帶石斑魚(Epinephlus coioides)神經壞死病毒(orange-spotted nervous necrosis virus,OGNNV)衣蛋白基因連接到 pet32a表達載體,轉化至大腸桿菌BL21(DE3),表達獲得分子量為 55.3kDa的融合蛋白。蘇友祿等(2010)將赤點石斑魚(Epinephelus akaara)神經壞死病毒(RGNNV)主衣殼蛋白(MCP)基因進行原核重組表達,得到分子量約為44.5kDa的重組蛋白。Tanaka等(2001)將七帶石斑魚(Epinephelus septemfasciatusThunberg)β諾達病毒的MCP基因在大腸桿菌中進行了融合表達,提取包涵體溶液免疫動物后,用不同滴度的病毒液進行攻毒。低劑量病毒攻毒組的相對存活率達69%—88%,平均為78.5%,高劑量病毒攻毒組的相對存活率為 35%—37%,因此可利用重組β諾達病毒衣殼蛋白制備疫苗。本研究針對感染牙鲆的β諾達病毒,利用大腸桿菌表達系統,構建用于制備該病毒衣殼蛋白的表達載體RNA2-Pet21a,轉化BL21(DE3)plysS后經誘導表達獲得約37kDa的重組蛋白,質譜鑒定為β諾達病毒衣殼蛋白,這將有助于進一步研制有針對性的疫苗或檢測制品。

表3 正交試驗方差分析Tab.3 Analysis of variance for orthogonal test

工業生產重組蛋白藥物,一半以上是在大腸桿菌中表達的,并多以包涵體形式存在,因此,復性過程對生產效率和生產成本至關重要,對工業生產影響巨大(馮小黎,2001;吳正輝等,2008)。通常,天然構象的蛋白較包涵體形式具有更多的抗原表位,免疫原性亦更高,因此利用復性后的衣殼蛋白有望獲得更佳的免疫效果,但目前對于重組該病毒衣殼蛋白的包涵體復性條件的分析鮮有報道。本研究構建的β諾達病毒衣殼蛋白表達載體轉化宿主菌,經誘導表達后利用 SDS-PAGE分析發酵液以及菌體裂解液等組分,發現表達的重組蛋白主要以包涵體的形式存在,這與已報道的一些β諾達病毒衣殼蛋白重組表達結果一致(陳曉艷等,2005;蘇友祿等,2010)。產物經鎳離子親和柱純化后得到目的蛋白的單一的條帶,在此基礎上,嘗試了對重組蛋白的包涵體進行復性條件的優化。通過正交試驗著重分析了4種關鍵因素對復性效果的影響,數據分析中極差是反映試驗因素影響的關鍵參數,極差越大表明其對試驗結果的影響越大,本研究中極差最大的為 B,說明尿素對該包涵體復性的影響較大,其次是復性緩沖液 pH,PBS濃度和溫度相對影響較小。復性后蛋白濃度最高的因素組合為A1B1C1D1,即在4°C條件下,利用PBS濃度0.05mol/L,尿素濃度為0.8mol/L,pH為7的緩沖液對包涵體進行稀釋復性可以獲得較好的效果,其蛋白復性率為17.24%,是較理想的復性條件。本研究成功構建了β諾達病毒衣殼蛋白原核表達載體,實現重組蛋白高效表達,并優化了復性條件,可為今后批量放大生產提供技術支持,亦可為同類研究提供重要參考。

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