牙鲆(Paralichthys olivaceus)β諾達(dá)病毒衣殼蛋白重組表達(dá)及復(fù)性條件優(yōu)化*

蔣嫣冉 張亦陳① 劉逸塵 耿緒云 孫金生,

(1.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 天津 300387;2.天津市水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 天津 300221)

β諾達(dá)病毒(Betanodavirus)亦被稱(chēng)為神經(jīng)壞死病毒(viral nervous necrosis,NNV),是已發(fā)現(xiàn)的最小魚(yú)類(lèi)病毒(Chiet al,2001;Groveet al,2003;黃劍南等,2005),其基因組包括2條正義的、不含有poly(A)末端的單鏈RNA,分別為RNA1和RNA2。RNA1的大小約為3.1kb,編碼非結(jié)構(gòu)A蛋白,A蛋白是病毒的依賴RNA的RNA聚合酶(RNA-dependant RNA polymerase,RdRp)(Johnsonet al,2000;Tanet al,2001)。RNA2 的大小約為 1.4kb,編碼病毒主衣殼蛋白(major capsid protein,MCP)(Krondiriset al,2002)。該病毒能感染5個(gè)目17科的40多種經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi),引發(fā)病毒性神經(jīng)壞死癥(Viral nervous necrosis,VNN),對(duì)仔魚(yú)和稚魚(yú)的致死率極高,是國(guó)際獸疫組織確定的嚴(yán)重疫病[Mundayet al,1992;世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)魚(yú)病專(zhuān)家委員會(huì),2001]。該病自1985年暴發(fā)至今,已在世界范圍蔓延,我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖也深受其害。Lin等(2001)首次在我國(guó)大陸地區(qū)的石斑魚(yú)體內(nèi)分離獲得β諾達(dá)病毒,基因型分析顯示屬于 RGNNV型。2006年本實(shí)驗(yàn)室從天津地區(qū)養(yǎng)殖牙鲆體內(nèi)也檢出該病毒(PONNV毒株)(毛海濤,2008),其基因型與RGNNV型相似性最高,這是我國(guó)大陸地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)該病毒感染牙鲆的病例,近幾年本地區(qū)β諾達(dá)病毒感染養(yǎng)殖牙鲆的狀況頻發(fā),亟需建立有效的防控方法。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)屬硬骨魚(yú)綱、輻鰭亞綱、鰈形目、鰈亞目、鲆科、牙鲆屬,是名貴海水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi),極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值,在我國(guó)漁業(yè)養(yǎng)殖中占有非常重要的地位。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度提高,各種病害暴發(fā)越來(lái)越頻繁,其中由β諾達(dá)病毒引起的病毒性神經(jīng)壞死癥是嚴(yán)重危害魚(yú)苗的重大病害之一,由于魚(yú)苗普遍易感染,且死亡率極高,經(jīng)濟(jì)損失巨大(顧中華等,2012)。研制有針對(duì)性的疫苗對(duì)病毒性疫病的防控至關(guān)重要,基于天然病毒的滅活和減毒疫苗雖然具有較好的免疫效果,但安全性等方面亦存在問(wèn)題,因此通過(guò)基因工程手段制備亞單位疫苗等方法越來(lái)越受到重視。利用大腸桿菌表達(dá)外源基因,具有工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高、成本低等優(yōu)點(diǎn),但直接表達(dá)的蛋白質(zhì)通常會(huì)形成包涵體,需復(fù)性后才具有生物學(xué)活性,因此,復(fù)性效率的高低對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)成本至關(guān)重要(吳正輝等,2008)。不同蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象復(fù)雜多樣,復(fù)性條件差別較大,因此,有針對(duì)性地探索目的蛋白的包涵體復(fù)性條件對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。本研究構(gòu)建了感染牙鲆的β諾達(dá)病毒完整衣殼蛋白原核表達(dá)載體,優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)參數(shù),在獲得目的蛋白高效表達(dá)的基礎(chǔ)上,利用正交分析獲得包涵體復(fù)性的最適條件,為今后的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料、菌株、質(zhì)粒E.coliDH5α和BL21(DE3)plsS菌株購(gòu)自天根生化科技有限公司,表達(dá)載體Pet21a和帶有PONNV毒株RNA2完整cDNA序列的質(zhì)粒RNA2-PMD18T 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器

試劑:LA-Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、DL-2000 DNAMarker和Premixed Protein Marker均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒均購(gòu)自 Axygen;PageRuler Unstained Protein Ladder購(gòu)自Fermentas。

儀器:PCR儀(Bio-Rad);Duo flow蛋白純化儀(BIO-RAD);LGJ-10C凍干機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司);JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);蛋白電泳儀(BIO-RAD);微量核酸蛋白測(cè)定儀(BIO-RAD);臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù) PONNV毒株序列特點(diǎn)(KF841612),使用Primer Premier 5.0軟件在其衣殼蛋白完整編碼框兩端設(shè)計(jì)正反向引物,并在終止密碼子前引入His標(biāo)簽編碼序列。引物序列如下:正向引物(NYQf0001e):5’-CATATG GTACGCAAAGGTGAG-3’,反向引物(NYQr1014He):5’-AAGCTT AGTGGT GGTGGTGGTGGTGGTTTTCCGAGTCAACCCT-3’。引物序列下劃線為酶切位點(diǎn)。引物由生工生物(上海)有限公司合成。

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 使用前述設(shè)計(jì)的引物,以RNA2-PMD18T質(zhì)粒為模板擴(kuò)增病毒衣殼蛋白編碼區(qū),PCR反應(yīng)體系為:10×LA-Taq buffer 2.5μL,上下游引物(10μmol/L)各 1μL,LA-Taq DNA 聚合酶1U,dNTP(10mmol/L)2μL,模 板 1μL,雙 蒸 水17.3μL。PCR 反應(yīng)條件為:94°C 預(yù)變性 4min;94°C 變性 1min,50—55°C退火 1min(6個(gè)循環(huán),每循環(huán)降1°C),72°C延伸1min;94°C變性1min,51°C退火1min,72°C延伸1min,24個(gè)循環(huán);72°C總延伸 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳分離,目的條帶采用Axygen凝膠回收試劑盒抽提并以 2.5μL擴(kuò)增片段,2.1μL Solution I和 0.4μL PMD-18T 載體的體系 16°C連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)氨芐平板篩選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR檢測(cè)后送北京華大生物公司測(cè)序并保種。抽提帶有克隆片段的質(zhì)粒和Pet21a質(zhì)粒,分別經(jīng)NdeI和HindIII雙酶切后將帶有His標(biāo)簽的病毒衣殼蛋白克隆片段接入Pet-21a質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體 RNA2-Pet21a,連接接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng) PCR及測(cè)序檢測(cè)無(wú)誤后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與質(zhì)譜鑒定 將 RNA2-Pet21a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)plsS,挑取陽(yáng)性克隆接種于含有氨芐和卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中,37°C震蕩培養(yǎng)至OD = 0.5—0.6,取1mL未誘導(dǎo)菌液作為對(duì)照,其余加入 IPTG至終濃度為 1mmol/L,分別于誘導(dǎo) 0.5h、1h、2h、3h、4h、5h收集菌液,10000g離心2min,棄上清。用PBS清洗沉淀后,10000g離心2min 加入 1mL Lysis Buffer(50mmol/L NaH2PO4?2H2O,300mmol/L NaCl,10mmol/L Iminazole),進(jìn)行超聲破碎,程序?yàn)?400W,5s/次,間隔5s,破碎5min,至半透明。4°C,10000g離心20min,收集上清與沉淀,分別適量加 1×SDS上樣緩沖液,煮沸 10min,10000g離心1min后,取上清經(jīng) 15% SDS-PAGE分離,將目的條帶切下送華大生物科技公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.2.4 重組蛋白的純化 將1L誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌液經(jīng) 10000r/min離心 10min收集菌體,按 1g濕菌10mL BufferA破碎緩沖液(含 1% TritionX-100,2mmol/LEDTA)的比例重懸菌體,冰浴超聲破碎3次。破碎后溶液4°C,10000r/min,離心10min,棄去上清留沉淀。BufferB洗滌緩沖液(300mmol/L NaCl,50mmol/L NaH2PO4?2H2O,5mmol/L Iminazole,2mmol/L Urea,pH 7.4)洗滌沉淀3次,可得初步純包涵體。上述包涵體經(jīng) WashI buffer(500mmol/L NaCl,20mmol/L Iminazole,20mmol PB,8mol/L Urea)溶解,渦旋振蕩20min,4°C,10000r/min離心10min,上清經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后結(jié)合于鎳離子親和柱純化,具體操作按照Bio-Scale Mini profanity IMAC操作手冊(cè)進(jìn)行。

1.2.5 重組蛋白復(fù)性條件優(yōu)化 參考稀釋復(fù)性主要優(yōu)化條件(吳正輝等,2008;龐懷宇等,2010),以大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)生的重組衣殼蛋白包涵體為材料,利用正交試驗(yàn)優(yōu)化重組蛋白的稀釋復(fù)性條件。以鹽離子濃度即PBS濃度(A)、尿素濃度(B)、溫度(C)以及 pH(D)四個(gè)因素做為主要優(yōu)化參數(shù),針對(duì)每個(gè)參數(shù)設(shè)置 4個(gè)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行綜合正交分析,研究不同因素對(duì)重組蛋白復(fù)性影響的大小并找出適宜的匹配條件。參照表1設(shè)計(jì)將分別將 400μL濃度為1.06μg/μL的重組包涵體蛋白溶液加入到 4mL不同復(fù)性緩沖液中在不同溫度下復(fù)性 12h。復(fù)性產(chǎn)物10000g離心10min,收集上清凍干后用1×PBS溶解,利用微量核酸蛋白測(cè)定儀進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定,計(jì)算可溶蛋白總量。

表1 重組蛋白復(fù)性中的因素與水平參數(shù)值Tab.1 Refolding factors and levels of recombinant protein

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以RNA2-PMD18T質(zhì)粒為模板,利用引物NYQf0001e和NYQr1014He擴(kuò)增長(zhǎng)度為1017bp的β諾達(dá)病毒衣殼蛋白編碼區(qū),電泳檢測(cè)在約1kb處有單一條帶,測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致。目的片段經(jīng)HindIII和NdeI雙酶切連入表達(dá)載體Pet-21a,測(cè)序顯示含有T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的C端融合His標(biāo)簽的完整病毒衣殼蛋白表達(dá)盒,表明載體構(gòu)建成功。

2.2 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與質(zhì)譜鑒定

含有RNA2-Pet21a表達(dá)載體的大腸桿菌在37°C條件下培養(yǎng)至OD = 0.5—0.6,加入IPTG至終濃度為1mmol/L,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),分別在0、0.5、1、2、3、4、5h點(diǎn)取樣,破碎菌體后分別取上清和沉淀,經(jīng)15%SDS-PAGE分離檢測(cè)。結(jié)果顯示對(duì)照組在預(yù)期大小沒(méi)有明顯條帶,實(shí)驗(yàn)組在 37kDa左右有預(yù)期大小條帶,且隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量也隨之增加并在約5h后達(dá)到峰值(圖1)。用潔凈手術(shù)刀小心切取目標(biāo)條帶經(jīng)質(zhì)譜鑒定,利用 LC-ESI-MS進(jìn)行分析和鑒定,結(jié)果采用BioWorks軟件與SEQUEST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白有-ISQAVLPAGTGTDGYVVVDATIVPDLLPR-、-LILLCVGNNTDVVNVSVLC R-、-FAGNAGTPAGWFR-、-QILLPVGTVCTR-4條肽段與預(yù)期蛋白中的相應(yīng)氨基酸序列完全匹配(圖2),由此判定上述蛋白條帶即為表達(dá)的重組衣殼蛋白。

圖1 重組衣殼蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)plsS中的表達(dá)Fig.1 Expression of recombinant capsid protein in E.coli BL21(DE3)plsS

2.3 衣殼蛋白純化及復(fù)性條件優(yōu)化

離心收集誘導(dǎo)后的發(fā)酵菌體,破碎后取上清經(jīng)鎳離子親和柱純化,SDS-PAGE電泳檢測(cè)表明獲得單一條帶,純度>98%(圖3)。正交試驗(yàn)中包涵體溶液經(jīng)12h稀釋復(fù)性后,離心取上清,凍干后用1×PBS溶解并測(cè)量蛋白濃度,計(jì)算可溶蛋白總量。測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表2,直接分析表明,重組衣殼蛋白初步復(fù)性的最佳條件為A1B1C1D1,即在溫度為4°C,復(fù)性緩沖液中PBS濃度0.05mol/L,尿素濃度0.8mol/L,pH為7的條件下復(fù)性效果最好,其復(fù)性前蛋白總量為 424μg,復(fù)性后可溶蛋白總量為73.08μg,蛋白復(fù)性率為17.24%。極差大小為B >D >A >C,表明尿素濃度對(duì)重組蛋白復(fù)性的影響最大,其次是復(fù)性緩沖液的pH,PBS濃度和溫度對(duì)復(fù)性影響較小。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3,計(jì)算得到因素的偏差平方和、自由度、F比、臨界值,顯示出各因素對(duì)重組蛋白復(fù)性影響的顯著性,因素顯著性程度為B >D >C >A。

圖2 重組蛋白的質(zhì)譜鑒定Fig.2 Mass spectrum verified the recombinant capsid protein

圖3 純化后重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein

表2 L16(4)4正交試驗(yàn)結(jié)果分析Tab.2 Analysis of orthogonal test

3 討論

諾達(dá)病毒(Nodaviradae)可分為主要感染昆蟲(chóng)的α諾達(dá)病毒屬(Alphanodavirus)以及以魚(yú)類(lèi)為主要感染對(duì)象的β諾達(dá)病毒屬(Betanodavirus)(劉傳鳳等,2011),其中β諾達(dá)病毒根據(jù)來(lái)源、感染宿主以及致病性等方面的不同可分為4種基因型。β諾達(dá)病毒衣殼蛋白具有大量抗原表位,可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生保護(hù)性抗體,因此可通過(guò)體外表達(dá)該病毒的衣殼蛋白來(lái)研制抗病毒疫苗(Hegdeet al,2002)。但是,不同β諾達(dá)病毒株系衣殼蛋白之間雖具有較高的相似性,但也存在差異,主要原因是其復(fù)制所依賴的聚合酶RdRp校正能力弱,容易引發(fā)突變,從而產(chǎn)生針對(duì)不同宿主細(xì)胞表面受體的表位,因此該病毒具有非常廣泛的宿主侵染性。基于β諾達(dá)病毒這一特點(diǎn),有必要研制有針對(duì)性的疫苗產(chǎn)品,以提高保護(hù)效率;另一方面也可為進(jìn)一步研究其與特定宿主細(xì)胞表面相互識(shí)別及結(jié)合位點(diǎn)的信息提供參考。近年來(lái)已有一些研究嘗試?yán)迷吮磉_(dá)系統(tǒng)制備β諾達(dá)病毒衣殼蛋白。陳曉艷等(2005)將斜帶石斑魚(yú)(Epinephlus coioides)神經(jīng)壞死病毒(orange-spotted nervous necrosis virus,OGNNV)衣蛋白基因連接到 pet32a表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3),表達(dá)獲得分子量為 55.3kDa的融合蛋白。蘇友祿等(2010)將赤點(diǎn)石斑魚(yú)(Epinephelus akaara)神經(jīng)壞死病毒(RGNNV)主衣殼蛋白(MCP)基因進(jìn)行原核重組表達(dá),得到分子量約為44.5kDa的重組蛋白。Tanaka等(2001)將七帶石斑魚(yú)(Epinephelus septemfasciatusThunberg)β諾達(dá)病毒的MCP基因在大腸桿菌中進(jìn)行了融合表達(dá),提取包涵體溶液免疫動(dòng)物后,用不同滴度的病毒液進(jìn)行攻毒。低劑量病毒攻毒組的相對(duì)存活率達(dá)69%—88%,平均為78.5%,高劑量病毒攻毒組的相對(duì)存活率為 35%—37%,因此可利用重組β諾達(dá)病毒衣殼蛋白制備疫苗。本研究針對(duì)感染牙鲆的β諾達(dá)病毒,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建用于制備該病毒衣殼蛋白的表達(dá)載體RNA2-Pet21a,轉(zhuǎn)化BL21(DE3)plysS后經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得約37kDa的重組蛋白,質(zhì)譜鑒定為β諾達(dá)病毒衣殼蛋白,這將有助于進(jìn)一步研制有針對(duì)性的疫苗或檢測(cè)制品。

表3 正交試驗(yàn)方差分析Tab.3 Analysis of variance for orthogonal test

工業(yè)生產(chǎn)重組蛋白藥物,一半以上是在大腸桿菌中表達(dá)的,并多以包涵體形式存在,因此,復(fù)性過(guò)程對(duì)生產(chǎn)效率和生產(chǎn)成本至關(guān)重要,對(duì)工業(yè)生產(chǎn)影響巨大(馮小黎,2001;吳正輝等,2008)。通常,天然構(gòu)象的蛋白較包涵體形式具有更多的抗原表位,免疫原性亦更高,因此利用復(fù)性后的衣殼蛋白有望獲得更佳的免疫效果,但目前對(duì)于重組該病毒衣殼蛋白的包涵體復(fù)性條件的分析鮮有報(bào)道。本研究構(gòu)建的β諾達(dá)病毒衣殼蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后利用 SDS-PAGE分析發(fā)酵液以及菌體裂解液等組分,發(fā)現(xiàn)表達(dá)的重組蛋白主要以包涵體的形式存在,這與已報(bào)道的一些β諾達(dá)病毒衣殼蛋白重組表達(dá)結(jié)果一致(陳曉艷等,2005;蘇友祿等,2010)。產(chǎn)物經(jīng)鎳離子親和柱純化后得到目的蛋白的單一的條帶,在此基礎(chǔ)上,嘗試了對(duì)重組蛋白的包涵體進(jìn)行復(fù)性條件的優(yōu)化。通過(guò)正交試驗(yàn)著重分析了4種關(guān)鍵因素對(duì)復(fù)性效果的影響,數(shù)據(jù)分析中極差是反映試驗(yàn)因素影響的關(guān)鍵參數(shù),極差越大表明其對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響越大,本研究中極差最大的為 B,說(shuō)明尿素對(duì)該包涵體復(fù)性的影響較大,其次是復(fù)性緩沖液 pH,PBS濃度和溫度相對(duì)影響較小。復(fù)性后蛋白濃度最高的因素組合為A1B1C1D1,即在4°C條件下,利用PBS濃度0.05mol/L,尿素濃度為0.8mol/L,pH為7的緩沖液對(duì)包涵體進(jìn)行稀釋復(fù)性可以獲得較好的效果,其蛋白復(fù)性率為17.24%,是較理想的復(fù)性條件。本研究成功構(gòu)建了β諾達(dá)病毒衣殼蛋白原核表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)重組蛋白高效表達(dá),并優(yōu)化了復(fù)性條件,可為今后批量放大生產(chǎn)提供技術(shù)支持,亦可為同類(lèi)研究提供重要參考。

毛海濤,2008.養(yǎng)殖牙鲆(Paralichthys olivaceus)病毒性神經(jīng)壞死病的調(diào)查及診斷技術(shù)研究.天津:天津師范大學(xué)碩士學(xué)位論文,12—13

世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)魚(yú)病專(zhuān)家委員會(huì),2001.水生動(dòng)物病害診斷手冊(cè).北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,80—83

馮小黎,2001.重組包涵體的折疊復(fù)性.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,28(4):482—485

劉傳鳳,張珈敏,胡遠(yuǎn)揚(yáng),2011.野田村病毒RNA的復(fù)制機(jī)制.微生物學(xué)通報(bào),38(9):1418—1424

蘇友祿,郭志勛,馮 娟等,2010.赤點(diǎn)石斑魚(yú)神經(jīng)壞死病毒主衣殼重組蛋白多克隆抗體的制備.南方水產(chǎn),6(6):8—13

吳正輝,郜金榮,佘應(yīng)龍等,2008.不同復(fù)性條件對(duì)重組人組織纖溶酶原激活劑復(fù)性的影響.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版),54(4):462—466

陳曉艷,翁少萍,殷志新等,2005.斜帶石斑神經(jīng)壞死病毒主衣殼蛋白的原核表達(dá)和純化.中山大學(xué)學(xué)報(bào),44(6):83—86

龐懷宇,吳嬌嬌,李素霞等,2010.正交試驗(yàn)優(yōu)化黏質(zhì)沙雷菌脂肪酶包涵體復(fù)性條件.食品與藥品,12(1):4—6

顧中華,張亦陳,耿緒云等,2012.牙鲆β諾達(dá)病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立.天津水產(chǎn),(1):10—14

黃劍南,林 蠡,翁少萍等,2005.赤點(diǎn)斑神經(jīng)壞死病毒外殼蛋白全基因克隆與序列分析.水產(chǎn)學(xué)報(bào),29(3):429—432

Chi S C,Lo B J,Lin S C,2001.Characterization of grouper nervous necrosis virus.Journal of Fish Diseases,24(1):3—13

Grove S,Johansen R,Dannevig B Het al,2003.Experimental infection of Atlantic halibutHippoglossus hippoglossuswith nodavirus:tissue distribution and immune response.Diseases of Aquatic Organisms,53(3):211—221

Hegde A,Chen C L,QIN Q Wet al,2002.Characterization,pathogenicity and neutralization studies of a nervous necrosis virus isolated from grouper,Epinephelus tauvina,in Singapore.Aquaculture,213(1):55—72

Johnson K N,Zeddam J L,Ball L A,2000.Characterization and construction of functional cDNA clones of pariacoto virus,the firstAaphanodavirusisolated outside Australasia.Journal of Virology,74(11):5123—5132

Krondiris J V,Sideris D C,2002.Intramolecular disulfide bonding is essential for betanodavirus coat protein conformation.Journal of General Virology,83(9):2211—2214

Lin L,He J,Mori Ket al,2001.Mass mortalities associated with viral nervous necrosis in hatchery-reared groupers in the People’s Republic of China.Fish Pathology,36(3):186—188

Munday B L,Langdon J S,Hyatt Aet al,1992.Mass mortality associated with a viral-induced vacuolating encephalopathy and retinopathy of larval and juvenile barramundi,Lates calariferBloch.Aquaculture,103(3):197—211

Tan C,Huang B,Chang S Fet al,2001.Determination of the complete nucleotide sequences of RNA1 and RNA2 from greasy grouper(Epinephelus tauvina)nervous necrosis virus,Singapore strain.Journal of General Virology,82(3):647—653

Tanaka S,Mori K,Arimoto Met al,2001.Protective immunity of sevenband grouper,Epinephelus septemfasciatusThunberg,against experimental viral nervous necrosis.Journal of Fish Diseases,24(1):15—22