長鰭裸頰鯛(Lethrinus erythropterus)血細胞的發生*

曹伏君 葉 寧 羅 杰 林華貴

(廣東海洋大學水產學院 湛江 524025)

長鰭裸頰鯛(Lethrinus erythropterus)隸屬于鱸形目Perciformes、鱸亞目Percoidei、裸頰鯛科Lethrinidae、裸頰鯛屬Lethrinus。分布于印度-西太平洋區,在我國主要分布于南海。個體大的體長可長到50cm。其肉質細嫩,滋味鮮美,營養豐富,肉質和味道優于養殖的鯛科魚類,具有食性廣、抗病能力特別強等優點,因此長鰭裸頰鯛是一種理想的優良養殖新品種。魚類血液中的白細胞直接參與免疫應答及其相關過程,肩負著機體非特異性免疫和特異性免疫的機能,在魚類疾病的發生和防治中發揮著重要作用。對淡水魚類血細胞的發生研究較多(吳維寧,1990;郭瓊林等,1994;林光華等,1998;肖義軍等,2001;金麗等,2007),海水魚類的報道中陳剛等(2006)對美國紅魚血細胞的發生進行了研究,李長玲等(2001)分析了大彈涂魚的血紅細胞、嗜中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞等發生過程,張健東等(2007)對 卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)血細胞的發生進行了觀察。本文對長鰭裸頰鯛血細胞的發生過程的形態學進行了研究,為研究魚類血細胞分化提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

取湛江雷州市流沙鎮網箱養殖的長鰭裸頰鯛5尾,活體運回實驗室,檢查無明顯病變,體重1—2kg。

1.2 方法

1.2.1 細胞學觀察 拭干魚體表,剖開胸腹腔迅速取出頭腎、體腎、脾臟、肝臟,用刀片將每個器官分別作橫切、縱切4個斷面,每個斷面在干凈的載玻片上輕輕印上 5個以上跡面。每條魚每個器官印跡20張?？諝飧稍锖笥肳right染液染5min,再滴加等量pH 6.4磷酸緩沖液,靜置8min,用水沖洗凈,晾干封片,Olympus BX-51系統顯微鏡油鏡下觀察拍照。每種細胞隨機取樣 20個,測量其大小,求平均值和標準差。

1.2.2 細胞發育階段的判定 各階段細胞形態標準參照王鳳計(1980)《血細胞圖譜》中標準。

2 結果

2.1 血細胞計數

頭腎、體腎、脾臟和肝臟等組織涂片中,各種類型血細胞的原始、未成熟和成熟型細胞的個數和百分比(表1)。

根據各細胞系原始和未成熟細胞平均百分比結果推斷,長鰭裸頰鯛的脾臟、體腎、頭腎印片中均可以發現各種原始和未成熟的血細胞,但是三種器官組織中的血細胞含量卻各不相同。頭腎印片中可以發現紅細胞系、淋巴細胞系、單核細胞系還有粒細胞系的原始類型和未成熟類型的各類細胞,粒細胞系的數量是最大的,其次為淋巴細胞和紅細胞,單核細胞次之;體腎主要是粒細胞和單核細胞的發生場所,其它細胞系的細胞也可以在體腎中發現,如淋巴細胞;而脾臟是紅細胞、粒細胞和淋巴細胞的主要發生場所,單核細胞次之。而肝臟中沒有發現有原始類型的血細胞,肝臟可能不是長鰭裸頰鯛的血細胞發生場所。

表1 長鰭裸頰鯛4種組織中各種血細胞的分類計數Tab.1 The percentages of different blood cells in four tissues of L.erythropterus

2.2 血細胞測量

結果見表2。在長鰭裸頰鯛的4種器官組織涂片中,各發育階段不同類型血細胞大小如表2 ,分別包括:紅細胞系、單核細胞系、淋巴細胞系、粒細胞系和其它細胞等。各系中單核細胞系較其它各系細胞都大。巨噬細胞和網狀細胞也都是大型細胞。

2.3 細胞的形態特征

2.3.1 原紅細胞(圖1a) 圓形或橢圓形,胞體較大,胞體長徑為(9.98±0.68)μm,短徑為(9.54±0.52)μm。胞質染成深藍色,偶有偽足。細胞核圓形,占細胞的絕大部分,核多居中,有的稍偏,胞核周圍有淺色環帶區存在。深紫紅色的染色質較濃,不均勻,呈粗網狀,核仁邊界不清,內凹或平坦。頭腎涂片上可見處于有絲分裂中的原紅細胞(圖4f)。

2.3.2 早幼紅細胞(圖1b,圖1c) 圓形或橢圓形。胞體、胞核均較原紅細胞小,核質比仍較大,核內染色質染成紫紅色,核仁逐漸消失。此階段的早期胞體較大,胞質周圍有一夾窄的灰藍色的環帶區。隨著細胞的發育,胞體逐漸變小,胞質顏色逐漸變淺,由灰藍色變成淺藍色,核內染色質變粗呈車輪狀,胞質開始出現血紅蛋白,到晚期細胞體積達到發育過程中的最小階段,細胞呈圓形,核內染色質更粗糙。

表2 長鰭裸頰鯛各階段不同類型血細胞的大小Tab.2 Sizes of blood cells in different stages of L.erythropterus

2.3.3 晚幼紅細胞(圖1d,圖1e) 細胞卵圓形或橢圓形,胞質成桔黃色或磚紅色,核質更致密。其階段早期細胞體積較小,胞質由灰藍色逐漸變成桔黃色。細胞核圓形,核質比較成熟紅細胞大。隨著細胞的發育,胞質中血紅蛋白豐富而呈現桔紅色,胞核周圍著色稍淺,核周圍有一無色透明帶。

2.3.4 紅細胞(圖1f) 胞體卵圓形或橢圓形,偶見圓形,胞體長徑為(10.18±0.77)μm,短徑為(7.91±0.54)μm。胞核中位或稍偏,圓形或橢圓形,染色質致密呈團塊狀,深紫紅色。胞質豐富,血紅蛋白含量最高,胞質呈桔紅色或磚紅色。核質比是紅細胞系中最大的。衰老紅細胞(圖1g)呈不規則圓形或橢圓形,較正常的紅細胞體積小,核固縮,深染。脾臟印片上發現了無核紅細胞,即紅細胞的胞質小體(圖1h)。這種胞質小體的體積較正常紅細胞的體積小。溶解紅細胞(圖1i)在腎臟中有發現,其核染色質呈彌散狀,質形成許多突起。

圖1 長鰭裸頰鯛不同發育階段的血細胞(1)Fig.1 Blood cells in different stages of L.erythropterus(1)

2.3.5 原粒細胞(圖2a) 胞體圓形或卵圓形,與原紅細胞相似。胞體長徑為(11.68±0.37)μm,短徑為(10.66±0.72)μm。但原粒細胞胞質的嗜堿性稍弱,染色質成更細的粒狀。核質比大,胞質量少,染成藍色,著色均勻透明無顆粒。胞核圓形或橢圓形,居中或稍偏一側,染色質呈紫紅色細沙狀均勻分布,核仁可見有外凸感。

圖2 長鰭裸頰鯛不同發育階段的血細胞(2)Fig.2 Blood cells in different stages of L.erythropterus(2)

2.3.6 早幼粒細胞(圖2b) 胞體圓形或卵圓形,胞體長徑為(11.45±1.49)μm,短徑為(10.43±1.27)μm。胞質較原粒細胞豐富,淺藍色,胞質中有淺紫紅色的嗜天青顆粒出現,核質比大。胞核橢圓形,偏于細胞一側,內染色質較原粒細胞粗糙,核仁模糊不清或消失。從中幼粒細胞開始,嗜天青顆粒逐漸減少,而細胞內的特殊顆粒的數量逐漸增多。

2.3.7 中性中幼粒細胞(圖2c) 細胞圓形或橢圓形,胞體長徑為(11.05±1.32)μm,短徑為(10.28±0.97)μm,核質比約為1/3—1/2。核圓形或橢圓形,常偏于細胞的一側,核內染色質濃聚,核仁完全消失。胞質較多,呈淺藍色或淺紫色,內有很多特殊的嗜中性顆粒,顆粒著色淺,成淡粉紅色,分布較均勻,有的顆粒覆蓋于細胞核上面,核膜不清晰。

2.3.8 中性晚幼粒細胞(圖2d) 細胞圓形或橢圓形,體積較中幼粒細胞小,胞體長徑為(10.54±0.90)μm,短徑為(9.91±0.99)μm。胞核多為細胞體積的1/2。胞核橢圓形或一側凹陷成腎形,但凹陷程度不深。核內染色質致密成塊狀,胞質豐富,染成淺藍色至淺紫色。

2.3.9 中性粒細胞(圖2e) 細胞圓形或橢圓形,胞體長徑為(10.50±1.02)μm,短徑為(9.62±0.92)μm。核多偏位,核為不規則的圓形、腎形、棒狀,偶見核分葉。細胞質呈無色或極淺的淡藍色,內彌散分布著細小的淺紅色和紫紅色顆粒。為白細胞中數量最多的一種。

2.3.10 嗜酸性中幼粒細胞(圖2f) 細胞圓形或近圓形,胞體長徑為(9.80±0.57)μm,短徑為(9.50±0.42)μm。胞核約占整個細胞的一半,常偏于細胞的一側。核內染色質致密,染成淡桔紅色。細胞質桔黃色或磚紅色,內有許多細小均勻的顆粒,顆粒偶有覆蓋在細胞核而使胞核邊界不清。

2.3.11 嗜酸性晚幼粒細胞(圖2g) 細胞圓形或近圓形,體積較嗜酸性中幼粒細胞小。胞體長徑為(9.20±0.54)μm,短徑為(8.49±0.30)μm。胞核圓形或橢圓形,核質比嗜酸性粒細胞大,核多偏位,核內染色質更加致密,染成淡桔紅色塊狀。胞質桔黃色或磚紅色,內有許多特異性顆粒,使核邊界不清。

2.3.12 嗜酸性粒細胞(圖2h,圖2i) 細胞圓形,胞體較小,胞體長徑(8.73±1.10)μm,短徑為(7.91±1.27)μm。胞核彎曲或成為長橢圓形、腎形,偶見分葉或不規則形。胞質中充滿了嗜酸性顆粒被染成深桔紅色,胞質成桔黃色。染色質濃縮致密,染成深的橘紅色。

2.3.13 嗜堿性中幼粒細胞(圖3a) 細胞圓形或近圓形,體積較早幼粒細胞小。胞核圓形或不規則圓形,核常偏位,核質比較大,染色質固縮,染成黑紫色。細胞質充滿大而不均勻的嗜堿性顆粒,嗜堿性顆粒有時覆蓋在細胞核上,導致核膜不清。

2.3.14 嗜堿性晚幼粒細胞(圖3b) 細胞圓形或近圓形,胞體積較嗜堿性中幼粒細胞小。胞核圓形或近圓形,核常偏位,核質比小,染色質更加固縮,染成深黑紫色。胞質中充滿了嗜堿性顆粒,有時使得核膜不清。

2.3.15 嗜堿性粒細胞(圖3c) 細胞圓形或近圓形,胞核呈圓形或不規則圓形,胞核常偏于一側。胞質中充滿了許多粗大的圓形或橢圓形嗜堿性顆粒,深藍紫色,這些顆粒往往將細胞核覆蓋起來,致使核膜不清。

2.3.16 原單核細胞(圖3d) 圓形或不規則圓形,胞體是白細胞三系中最大的,胞體長徑為(15.29±2.35)μm,短徑為(13.04±1.41)μm。胞漿豐富,呈灰藍色或藍色。細胞核偏位,細胞核形態多樣,呈不規則圓形、腎形或扭曲折疊,呈淡紫色,染色質呈纖細網狀,是白細胞三系中最纖細的,分布不均勻,核仁清晰明顯。

2.3.17 幼單核細胞(圖3e) 胞體較大,胞體長徑為(14.76±1.56)μm,短徑為(13.08±1.21)μm,呈橢圓形或不規則形。胞漿豐富,呈灰藍色,常有偽足突起,胞漿內開始出現細小的紫紅色嗜天青顆粒,且胞漿內有少量的空泡。胞核多呈腎形或不規則形狀,染色質呈細網狀,有少量凝結,淡紫紅色。核仁不明顯。

2.3.18 單核細胞(圖3f) 胞體大,胞體長徑為(14.78±1.84)μm,短徑為(11.62±1.50)μm,呈橢圓形或不規則圓形。胞漿豐富,呈藍色或淡藍色,可見細小的紫紅色的嗜天青顆粒,有時發現大量的空泡。細胞核形態多樣,有腎形、馬蹄形、不規則形狀,多偏于細胞一側,染色質呈疏松網狀,呈紫紅色,核仁不清晰。

2.3.19 原淋巴細胞(圖4a) 圓形或卵圓形。胞體較小,胞體長徑為(8.84±0.78)μm,短徑為(8.52±0.73)μm,是原血細胞中最小的。胞質深藍色,量稍多,常有偽足,絲狀或短片狀。胞核圓形或橢圓形,核質比較大,核中位或稍偏。核仁可見,周界清晰、明顯,有凹陷。近核處常有一明顯的淺色環帶區,核周圍明顯。

圖3 長鰭裸頰鯛不同發育階段的血細胞(3)Fig.3 Blood cells in different stages of L.erythropterus(3)

圖4 長鰭裸頰鯛不同發育階段的血細胞(4)Fig.4 Blood cells in different stages of L.erythropterus(4)

2.3.20 幼淋巴細胞(圖4b) 圓形或卵圓形,胞體長徑為(9.22±0.55)μm,短徑為(8.66±0.53)μm。胞質深藍色或灰藍色,胞質較原淋巴細胞稍多,常有偽足。胞核圓形或橢圓形,偶有凹陷,占細胞絕大部分。胞質偶有嗜天青顆粒。染色質呈深紫紅色,粗糙、緊密。核仁清晰,但逐漸消失。

2.3.21 淋巴細胞 淋巴細胞在發育的過程中會分化成大淋巴細胞和小淋巴細胞兩種類型,小淋巴細胞占大多數。

小淋巴細胞(圖4c) 胞體小,胞體長徑為(7.09±1.01)μm,短徑為(6.47±1.16)μm。胞質量極少,類似裸核,少量的胞質在核周圍成極薄的一層,淡藍色,且只偏于核一側。胞核呈圓形、卵圓形或不規則形狀,染色質致密成塊狀,呈紫黑色。

大淋巴細胞(圖4d) 胞體圓形、卵圓形或不規則形體,胞體長徑為(8.94±0.65)μm,短徑為(8.08±0.57)μm。胞質淡藍色,為極薄的一層,有時不明顯,胞核呈圓形或卵圓形。染色質濃密,呈紫黑色,核仁消失。

2.3.22 其它細胞

巨噬細胞(圖3g) 細胞體積大,胞質中有許多空泡,核染色質著色淺,核邊界不清,近細胞邊緣。

幼巨噬細胞(圖3h) 胞體較大,胞質中同樣有許多空泡,核染色質著色較淺,核邊界不清晰,多偏位。核質比較巨噬細胞大。

網狀細胞(圖3i) 細胞很大,圓形或橢圓形,不規則。細胞核大,橢圓形或圓形,染色質濃聚,染成暗紅色。胞質淺藍色,細胞內有大量圓形的氣泡。常常聚群發現,常常有白細胞附在旁邊。

血栓細胞(圖4e) 細胞體積小,圓形、橢圓形或紡錘形。核質比非常大。細胞核梭形或不規則形狀,染成暗紫紅色,比淋巴細胞核的染色深,細胞質極薄,或繞核零星分布,甚至成裸核狀。

在頭腎中還見到處在有絲分裂中的原紅細胞(圖4f)、早幼粒細胞(圖4g)、原淋巴細胞(圖4h)和原淋巴細胞(圖4i)。

3 討論

3.1 長鰭裸頰鯛血細胞發育的規律

紅細胞在發育過程中,其形態與功能是相適應的。細胞核由大變小,核仁逐漸消失,核染色質隨著發育漸漸固縮,著色由淺到深;胞質由少到多,胞質嗜堿性由強到弱,再到嗜酸性的變化,是血紅蛋白出現和含量逐漸豐富的過程,反映了其攜帶、運輸氧氣和二氧化碳能力的逐漸增強。完成功能的紅細胞通過直接分裂,產生兩個衰老紅細胞或一個衰老紅細胞和一個紅細胞胞質小體,到了后期,衰弱的紅細胞破裂成為溶解的紅細胞,在外周血液中稱為“血影”,最后被巨噬細胞吞噬而消亡。衰弱的紅細胞和紅細胞胞質小體在脾臟涂片中數量較多,這可能與脾臟破壞衰老紅細胞的功能有關。

硬骨魚血細胞發育過程是不相同的,一般是原紅細胞向幼紅細胞發育過程中細胞逐漸變小,而幼紅細胞向成熟紅細胞發育過程中細胞逐漸變大,如興國紅鯉(林光華等,1998)、大彈涂魚(李長玲等,2001)、暗紋東方鲀(顧曙余等,2007)等,而草魚(郭瓊林等,1994)、海鰻(謝嘉華,2004)等紅細胞的發育趨勢是原紅細胞最大,成熟過程逐漸變小,但南方鯰(陳曉耘,2000)卻是在發育過程中不斷增大,這種差異應該屬于種間差異。

淋巴細胞發育過程分為原淋巴細胞、幼淋巴細胞、成熟淋巴細胞三個階段,細胞一般由大變小,與美國紅魚(陳剛等,2006)、長吻(金麗等,2007)等相同。而與南方鯰(陳曉耘,2000)、大彈涂魚(李長玲等,2001)、泥鰍(肖義軍等,2001)等的不同。胞核的體積亦逐漸變小,但核質比越來越大,核仁從明顯到不明顯最后消失。

單核細胞發育過程分為原單核細胞、幼單核細胞和成熟單核細胞三個階段(肖義軍等,2001)。細胞、細胞核一般由大變小,核仁從有到無,染色質由纖細的網狀到粗網狀,染色更深。有的硬骨魚由原單核細胞發育成幼單核細胞過程中,細胞體積增大,以后的發育中胞體逐漸變小,如興國紅鯉(林光華等,1998);有的卻是由大到小再大,如斜帶石斑魚(張海發等,2004)、大彈涂魚(李長玲等,2001)等;有的胞質中由無空泡到有空泡,如大彈涂魚(李長玲等,2001)、興國紅鯉(林光華等,1998)等;但有的在原單核細胞時就有空泡,如南方鯰(陳曉耘,2000);有的在其發育過程中看不到嗜天青顆粒,如興國紅鯉(林光華等,1998)。這可能是由于種間差異造成其不同的發育過程。

Hamers(1995)認為幼稚的未成熟單核細胞染色質比成熟單核細胞的更致密,而 Fijan(2002)認為較小體積的核致密細胞是衰老細胞。長鰭裸頰鯛成熟單核細胞比幼稚單核細胞染色質更致密,染色更深。胞漿量增多,胞質由藍灰色到灰藍色,嗜天青顆粒由無到有。

較幼稚的巨噬細胞形態、染色情況均與單核細胞相似,推測單核細胞在進一步發育變化過程中轉化為巨噬細胞,吞噬能力進一步增強。巨噬細胞在脾臟中數量較多,這與脾臟清除衰老紅細胞的功能有關,衰老紅細胞和紅細胞胞質小體通過被巨噬細胞吞噬而消亡。

三種粒細胞在不同魚類的存在情況是有差異的。幾乎所有的硬骨魚類都有中性粒細胞。在中性粒細胞發育過程中,其細胞體積先變大后變小,這與大彈涂魚(李長玲等,2001)、軍曹魚(陳剛等,2005)、長吻(金麗等,2007)相同,而與南方鲇(陳曉耘,2000)、興國紅鯉(林光華等,1998)、泥鰍(肖義軍等,2001)等不同。細胞核由圓形逐漸變為半圓形,直到開始出現分葉核。早幼粒細胞的胞質呈嗜堿性,開始出現嗜天青顆粒;中性中幼粒細胞的胞質嗜酸性增強,并出現許多中性小顆粒;中性晚幼粒細胞的胞質呈嗜酸性,胞質內充滿嗜中性顆粒。外周血中粒細胞出現雙葉或多葉核的中性粒細胞是其衰老的標志(Roughet al,2005)。

嗜酸性中幼粒細胞在長鰭裸頰鯛的頭腎印片中可觀察到。期間發育要經過:嗜酸性中幼粒細胞、嗜酸性晚幼粒細胞、嗜酸性粒細胞。細胞體積沒有明顯的變化,這與長吻(金麗等,2007)不同。胞質由少變多,嗜酸性顆粒也會隨著發育會更加明顯。細胞核也由大變小,染色質會逐漸加深。細胞質中充滿細小均勻的顆粒,胞質的桔紅色會越來越深。而長吻的嗜酸性中幼粒細胞的細胞質成淺藍色或藍色,胞質中含有嗜天青顆粒。

哺乳動物嗜酸性粒細胞(金麗等,2007)在外周血與組織中的比例約為1 :300,嗜酸性粒細胞從造血器官釋放后在外周血中停留很短的時間就進入組織,執行功能。嗜酸性粒細胞在魚類組織中的分布也表現出類似的特點,外周血中其數量很少可能是因為這兩種粒細胞在魚體內的數量本身就很少,加之在外周血中停留的時間很短,因而難以見到。

目前的報道中,少數魚的外周血中發現了嗜堿性粒細胞(劉金蘭等,2002;顧曙余等,2007)。嗜堿性粒細胞的發育在其它相關文獻中并未找到相關的描述(Grizzleet al,1976;Williamset al,1976;Petrie-Hansonet al,2000)。嗜堿性粒細胞的發育也是經歷3個階段:嗜堿性中幼粒細胞、嗜堿性晚幼粒細胞、嗜堿性粒細胞。隨著發育胞質越來越豐富,胞質中的嗜堿性特殊顆粒會越來越多。細胞質中的特殊顆粒——嗜堿性顆粒是一直存在的。

3.2 血細胞發育的場所

陳剛等(2005)認為軍曹魚的各類血細胞主要在頭腎和體腎中產生,脾臟是軍曹魚粒細胞發生的另一個場所,而肝臟也具有產生粒細胞和淋巴細胞的作用。長吻的頭腎是最主要的血細胞發育場所(金麗等,2007),各類細胞的原始類型都可以在頭腎中找到;其次是脾臟,而肝臟中沒有發現各類細胞的原始類型,所以懷疑肝臟不是造血器官。張健東等(2007)對卵形鯧 鲹的研究結果表明,紅細胞的發生場所主要在脾臟,其次為體腎和頭腎;淋巴細胞的發生場所在體腎、脾臟和頭腎;粒細胞的發生場所主要為頭腎,其次為體腎,脾臟次之;單核細胞在四個造血器官中均有發生,之間沒有明顯的差異。

長鰭裸頰鯛頭腎、體腎、脾臟是其主要的造血器官。紅細胞、粒細胞、淋巴細胞和單核細胞主要在頭腎和體腎中發生,其次是脾臟。肝臟中無原始型血細胞,可能不是其造血器官,這與長吻(金麗等,2007)和泥鰍(肖義軍等,2001)等魚類的一致。

比較以上這些魚類的研究結果,可以看出頭腎、體腎和脾臟是大多數魚類的主要造血器官;至于肝臟是否作為造血器官,研究者各有不同的看法。

3.3 關于其它細胞的發育

生血器官中血栓細胞與和外周血液中的血栓細胞形態差別很大,呈梭形,胞質極少,細胞體積也遠遠比外周血液上的大。而外周血液里的血栓細胞體積小,類似一裸核,呈圓形。染色質緊密,染成深紫黑色。

血栓細胞在外周血經常成群分布,但在生血器官中少見分布,只在在肝臟涂片中也可以觀察到少量。Rowley等(1988)解釋這是由于涂片過慢,在此之前血樣已有部分凝固所致。

巨噬細胞的發育也可以在頭腎中發現,巨噬細胞的發育變化是隨細胞核和細胞質的核質比變化的。細胞體積大,細胞質中含有許多空泡。這與單核細胞較相似。巨噬細胞也有可能是單核細胞發育來的。

長鰭裸頰鯛頭腎印片中還發現一類體積達 20—25μm、類圓形不規則具偽足樣突起的網狀細胞。網狀細胞周緣眾多的偽足樣突起之間鑲嵌有淋巴細胞、粒細胞等,推測其為這些發育中的細胞提供支撐。這與長吻(金麗等,2007)腎臟印片中的網狀細胞相似。

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