層層自組裝法制備雙重修飾脂質體及其體外消化穩定性

劉 珍，鄒立強，劉 偉*，劉瑋琳，牛 靜

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

層層自組裝法制備雙重修飾脂質體及其體外消化穩定性

劉 珍，鄒立強，劉 偉*，劉瑋琳，牛 靜

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

以粒徑、電位、包覆率、沉淀量為指標，采用層層自組裝法制備海藻酸鈉（sodium alginate，AL）、殼聚糖（chitosan，CH）雙重修飾脂質體海藻酸鈉-殼聚糖-脂質體（AL-CH-L），研究AL-CH-L的物化性質、微觀形貌及其體外消化穩定性。結果表明：0. 6%殼聚糖和0.5%海藻酸鈉制備的AL-CH-L平均粒徑為（330.6±37.3）nm，分布集中，Zeta電位為（-15.8±0.7）mV，透射電鏡觀察雙重修飾脂質體的外層成功包裹了海藻酸鈉和殼聚糖聚合物，呈現典型的核-殼結構。以鈣黃綠素為熒光標記物對未修飾和雙重修飾脂質體進行體外消化實驗，結果表明雙重修飾脂質體表現出更高的體外消化穩定性。

雙重修飾脂質體；殼聚糖；海藻酸鈉；層層自組裝；消化穩定性

脂質體（liposome）是由磷脂雙分子層形成的內部包含水相的封閉囊泡[1]，具有緩釋性、細胞親和性、組織相容性和靶向性等優點[2]，已成功應用于生物醫藥、化工農業等領域[3]。脂質體用于包裹營養素、酶、食品添加劑、食品抗菌劑等食品運載體系顯示出誘人前景[4]， 然而脂質體作為一種微粒分散體系，在貯藏過程中存在著 顆粒絮凝、粒徑易變大、藥物滲漏等問題[2]。近年來，為了增加脂質體雙層膜結構和體內外釋放的穩定性，通過物理化學作用在脂質體表面包覆蛋白、多糖或者其他物質來修飾脂質體的研究成為熱點。自組 裝技術是分離或交聯的組分在適當條件下自發地形成有序結構的過程[5]，層層自組裝技術是基于溶液中帶有相反電荷的物質交替吸附形成自組裝多層膜，由于這種技術操作條件的溫和性（室溫、常壓和在水溶液中進行）和對物化性質的可控性，使得其發展迅速[6]。本實驗 在采 用動態高壓微射流技術制備納米脂質體（nano liposomes，NL）改善其結構穩定性的基礎上[7]，進一步采用聚電解質層層自組裝技術，以海藻酸鈉（algin，AL）中分子鏈上大量的羧基為負電荷，以殼聚糖（chitosan，CH）分子鏈上大量的伯氨基為正電荷，通過正、負電荷靜電作用層層交替形成聚電解質膜，組裝在納米脂質體模板表面。殼聚糖和海藻酸鈉是存在于自然界中天然線性多糖[8]，一些學者對殼聚糖-海藻酸鈉復合物修飾運載體系進行了研究，如Ai yuefei等[9]制備了殼聚糖-海藻酸鈉微膠囊；Tarane等[10]制備了海藻酸鈉-殼聚糖納米顆粒，但是基于殼聚糖與海藻酸鈉雙重修飾脂質體的研究依舊甚少。

消化穩定性是評價脂質體性質以及應用的重要指標，其又分為體內消化穩定性和體外消化穩定性，其中體外消化穩定性主要是通過模擬人體胃腸液環境來展開研究。Parmentier等[11]利用模擬人體腸液以脂質體粒徑和磷脂的消化變化來研究了脂質體的穩定性；Carafa等[12]利用一種多糖對脂質體進行修飾，研究了其在模擬胃腸道環境中的釋放性；Filipovic-Grcic等[13]制備了殼聚糖-脂質體，證實了其在模擬胃液中的穩定性高于未修飾脂質體。前期實驗通過考察不同來源磷脂制備的脂質體在體外消化過程中粒徑、電位、微觀結構和膜滲透性等的變化，研究了脂質體的結構完整性[14-15]。在前期實驗的基礎上，雙重修飾脂質體的體外消化穩定性有待于進一步展開。

本實驗采用動態高壓微射流技術制備NL，以粒徑、電位、分散系數、包覆率和沉淀量為指標，根據單因素實驗得到最優質量濃度的CH-L后再優化制備海藻酸鈉-殼聚糖-脂質體（AL-CH-L），并對AL-CH-L的物化性質（粒徑、電位、分散系數、微觀形貌等）進行表征；同時采用熒光標記技術，通過考察包覆于脂質體內部的熒光物質鈣黃綠素的釋放[16]和脂質體粒徑、電位的變化比較了AL-CH-L和NL的體外消化穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆磷脂（P3644）、膽固醇（C75209）、殼聚糖（448869）、海藻酸鈉（A0682）、胃蛋白酶（P7125）、胰液素（P1750）、鈣黃綠素（C0875）美國Sigma公司；乙醇、VE、吐溫-80等均為分析純；磷酸緩沖液（pH 7.4）。

1.2 儀器與設備

動態超高壓均質機（微射流） 廊坊通用機械有限公司；RE-2000旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；NICOMP380/ZLS激光納米粒度分析儀 美國PSS公司；D37520高速冷凍離心機 美國Thermo Scientific公司；Delta320 pH計 瑞士梅特勒-托利多儀器(中國)有限公司；Tecnai G2 Spirit透射電鏡 日本Jeol公司；Agilent 5500原子力顯微鏡 美國Agilent公司；電子分析天平奧豪斯國際貿易有限公司；IKA RCT磁力攪拌器、漩渦混勻器 廣州儀科實驗室技術有限公司；超純水系統 美國Millipore公司；FP-6200熒光光度計 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 空白NL的制備

根據Bangham等[17]方法制備粗脂質體：將磷脂、膽固醇、吐溫-80和VE按照質量比6∶1∶1.8∶0.12混合加入無水乙醇中，在40 ℃條件下用磁力攪拌器混勻，待脂類物質完全溶解后于真空條件下旋轉蒸發除去乙醇形成薄膜，加入pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液洗膜，得到粗脂質體懸濁液。在120 MPa壓力下經動態高壓微射流處理二次即得到納米脂質體[7]。

1.3.2 CH-L的制備

CH-L的制備參考Mady[18]、Gonzaléz-Rodríguez[19]等的方法，分別取不同質量濃度的pH 5.5的殼聚糖溶液（0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、1、2 g/100 mL）按照體積比1∶1進行修飾脂質體，將脂質體緩慢滴入殼聚糖溶液中，邊攪拌邊加入，滴加完畢后使用NaOH、HCl稀溶液調節CH-L的pH 5.5，靜置1 h讓其充分反應。以粒徑、電位和包覆率為指標，考察并分析確定最優質量濃度的殼聚糖，得到最優配方的CH-L。其中，利用試劑盒方法進行包覆率的測定[20]：取適量的殼聚糖包覆的脂質體溶液在15 000 r/min轉速下離心1 h，使包覆的CH-L充分沉淀。用等體積的磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，得到CH-L溶液。通過測定離心前后的磷脂含量來確定CH-L的制備的優化工藝。按照式（1）計算包覆率。

式中：m為沉淀物中磷脂含量/g；m0為總磷脂含量/g。

1.3.3 AL-CH-L的制備

在優化條件下制備CH-L樣品基礎上，分別取不同質量濃度的pH 5.5的海藻酸鈉溶液（0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、1、2 g/100 mL）進行第2層修飾脂質體，按照體積比1∶1，將最優配方的CH-L，逐滴加入至海藻酸鈉溶液中，邊攪拌邊加入，滴加完畢后使用NaOH、HCl稀溶液調節AL-CH-L溶液的pH值至5.5，靜置1 h讓其充分反應。得到的雙重修飾脂質體在3 000×g離心15 min，過濾后稱量沉淀物質量。以粒徑、電位和沉淀量為指標，確定最優質量濃度的海藻酸鈉。利用稱量法按式（2）計算得到沉淀的質量。

式中：m1為離心管與沉淀的總質量/g；m0為離心管質量/g；m為沉淀的質量/g。

1.3.4 AL-CH-L的性質表征

1.3.4.1 平均粒徑、分散系數和表面電荷的測定

取適量AL-CH-L用磷酸緩沖液稀釋3倍，未修飾的脂質體稀釋10倍，利用NICOMP380/ZLS激光納米粒度分析儀測定平均粒徑、分散系數及Zeta電位。

1.3.4.2 微觀形貌的表征

利用原子力顯微鏡和透射電鏡觀察AL-CH-L和未修飾脂質體的微觀形態特征。將稀釋適當倍數后的樣品滴加到云母片上，室溫過夜干燥后置于原子力顯微鏡下觀察。將適量稀釋后的樣品，滴于銅網上，使用2%醋酸鈾負染4 min，過量的液體用濾紙吸干，室溫干燥后置于透射電鏡下觀察脂質體形態。

1.3.5 AL-CH-L的體外消化穩定性研究

模擬胃液的制備：2 g氯化物溶解于蒸餾水中，加入濃鹽酸，稀釋至1 L，調節pH 1.2；模擬腸液的制備：6.8 g K2HPO4溶190 mL 0.1 mol/L NaOH中，膽汁質量濃度為0.2 mg/mL，稀釋至1 L，調節pH 7.4。在消化實驗之前，模擬胃液與模擬腸液放置在37 ℃恒溫水浴中95 r/min持續攪拌[21]。

鈣黃綠素的釋放率[14]：制備熒光標記物鈣黃綠素的納米脂質體，方法參照1.3.1節，同時采用殼聚糖、海藻酸鈉對其進行雙重修飾得到AL-CH-L。AL-CH-L與模擬胃液或模擬腸液按體積比4∶3混合，未修飾的脂質體則按照體積比1∶3加入模擬胃液、模擬腸液，37 ℃恒溫水浴振蕩，分別從加入胃蛋白酶、胰蛋白酶液時開始計時，每隔0、1、5、15、30、60、120 min取出適當樣品，使用熒光光度計在激發波長480 nm、發射波長525 nm處測定熒光強度，按式（3）計算鈣黃綠素的釋放率。

式中：It為時間t測定的熒光強度；I0為0 min時的熒光強度；Imax加入2%曲通破乳后測定的總熒光強度。

2 結果與分析

2.1 AL-CH-L的制備條件優化

圖1 CH-L的粒徑、電位、包覆率隨CH質量濃度的變化Fig.1 Changes in particle size, zeta potential and coating efficiency of CH-L with chitosan concentration

CH修飾后改變了納米脂質體的粒徑分布、帶電性和包覆率。由圖1可知，未修飾的NL粒徑為（79.8±3.8）nm，表面帶有負電荷為（-6.7±1.2） mV，隨著CH質量濃度的增大，C H-L的平均粒徑逐漸增大至（255.8±34.8） nm；Zeta電位由負電反轉為正電，當CH質量濃度為0.6 g/100 mL時，電位增大至（2.3±0.7）mV。隨后變化不大；同時，當CH質量濃度為在0.1 g/100 mL時，CH-L的包覆率曲線達到拐點隨后趨于平穩。然而，由于0.1 g/100 mL CH修飾得到的CH-L帶電量僅為（-0.075±1.1）mV，接近中性，與AL的靜電作用則很弱。綜合分析粒徑分布、帶電性和包覆率等指標，確定使用0.6 g/100 mL的CH為制備單層修飾脂質體CH-L的最佳質量濃度。

CH是由甲殼素經脫乙酰作用得到的α-（1,4）-2-氨基-β-D-葡萄糖，結構中含有大量的伯氨基—NH2，由于CH-NH3+的pKa值為6.5[22]，在本實驗中，制備的NL其疏水尾部聚集在一起，親水頭部暴露在水相，磷脂雙分子層的表面極性頭帶有負電而使用pH 5.5的CH進行第一層修飾時，按Motwani等[23]報道，在此pH值條件下，CH氨基質子化得到-NH3+，形成陽離子聚合物，通過靜電作用或疏水作用與脂質體的磷脂極性頭結合[24]，從而在NL表面形成穩定的離子-聚合物層獲得CH-L。

由于CH在胃液的強酸性環境中溶解性很強，單純的采用CH修飾脂質體并不能滿足提高其穩定性的需要，因此本實驗采用AL再次修飾pH 5.5的CH-L。AL是β-D-甘露糖醛酸和α-L-古羅糖醛酸通過β-1,4糖苷鍵連接形成的一類線性鏈狀陰離子聚合物[10]，呈堿性，當加入高pH值的AL時，CH的質子化程度減弱并且會沉淀析出，所以調節AL使其pH值為5.5，在此條件下AL的羧基離子化形成—COO-[23]。并且調節雙重修飾后的溶液使其pH值依舊為5.5，在pH 5.5的條件下，CH的氨基質子化形成-NH3+和AL羧基離子化形成—COO-，二者通過靜電作用在修飾脂質體（CH-L）的外層上層層組裝形成聚合物層（AL-CH）而獲得雙重修飾脂質體AL-CH-L。在實驗中，AL修飾后，AL-CH-L的粒徑分布和帶電量發生再次改變，并且AL與游離的CH之間形成大量的聚合物導致了沉淀的產生。

圖2 AL-CH-L的粒徑、電位、沉淀量隨AL質量濃度的變化Fig.2 Changes in particle size, zeta potential and sedimentation amount of AL-CH-L with sodium alginate concentration

由圖2可知，當AL質量濃度低于0.5 g/100 mL時，得到的AL-CH-L的帶電量較低；當AL質量濃度為0.5 g/100 mL時，AL-CH-L的粒徑為（330.6±37.3）nm，帶電量達到最大（-15.8±0.7）mV；當AL質量濃度繼續增大至2.5 g/100 mL，粒徑突變達到（3 229.7±203.4）nm，且分散很不均勻，系數達到0.8。另外，從制備過程中沉淀量的變化曲線可知，當AL附著在CH-L外層時，沉淀量隨著AL的質量濃度增加發生變化。在低質量濃度的AL加入時，AL修飾CH-L的程度較低，隨著質量濃度增大到0.5 g/100 mL時，AL與CH-L的結合增強，同時AL與游離的CH作用同步增強，導致形成的沉淀量增加。隨著體系中AL質量濃度的繼續增大至1 g/100 mL，制備得到的AL-CH-L粒徑達到（1 170.3±404.5） nm，并且其帶電量低于0.5 g/100 mL AL-CH-L。此時AL與游離的CH作用愈加明顯，其相互纏結的更為緊密，導致暴露的帶電基團減少，體系中的帶電量的減少引起聚合物之間相互排斥力的減弱，故而1 g/100 mL AL修飾時形成的相對沉淀量增加到最大。此后相對沉淀量一直減小，這可能是由于AL的質量濃度繼續增大，纏結的沉淀更為緊致導致其吸收的水分更少，故而引起相對沉淀物的質量逐漸減小。由此綜合分析確定0.5 g/100 mL AL制備AL-CH-L效果最佳。

2.2 AL-CH-L的微觀形貌

利用激光納米粒度儀，原子力顯微鏡和透射電鏡，以未修飾的NL作為對照組，對制備的層層自組裝脂質體AL-CH-L的微觀形貌進行了表征。

圖3 未修飾的NL（a）和AL-CH-L（b）的原子力顯微鏡3D圖Fig.3 Atomic force microscopic images of NL (a) and AL-CH-L (b)

由圖3可知，NL顆粒清晰，粒徑為（79.8±3.8）nm，大小及分布皆比較均勻（圖3a）；而制備的AL-CH-L粒徑較大，粒徑為（330.6±37.3）nm（圖3b）。溶液中除了突起的大顆粒AL-CH-L外，還有分散著許多附著物。實驗中發現AL-CH-L制備過程中產生了些許沉淀物，原子力顯微鏡3D形貌同時也驗證了制備過程中沉淀量的變化。

圖4 未修飾的NL（a）和AL-CH-L（b）的透射電鏡圖Fig.4 Transmission electron micrographs of NL (a) and AL-CH-L (b)

由圖4可知，未修飾脂質體NL呈球形，并且分布較均勻，可知其成型較好（圖4a）；而雙重修飾脂質體AL-CH-L呈球形，結構完整，粒徑明顯大于未修飾的脂質體，并且呈現出典型的核-殼結構，內層為飽和度較高的亮白色，外層覆蓋上較為透明的聚合物層（圖4b）。據Mady等[18]報道，采用殼聚糖修飾薄膜分散法制備的脂質體也會出現這樣的核-殼結構。

為進一步驗證本實驗中AL-CH-L的形成，選擇實驗中的AL-CH-L、CH-L和NL樣品進行粒徑分布的對比，結果如圖5所示。

圖5 NL、CH-L和AL-CH-L的粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of nanoliposome, CH-L and AL-CH-L

根據納米粒度儀測得的NL、CH-L和最優配方下的AL-CH-L粒度分布圖（圖5）可知，修飾后的脂質體粒徑明顯高于未修飾的脂質體。NL的平均粒徑為（79.8±3.8）nm，CH-L的平均粒徑為（158.2±4.4）nm，這與Mady等[18]報道的殼聚糖修飾后的脂質體粒徑較修飾前增大（92±27.1）nm一致，而本實驗在此基礎上再次修飾上AL后，制備的AL-CH-L粒徑增加到（330.6±37.3）nm，明顯大于殼聚糖-脂質體與納米脂質體。可見，AL-CH聚合物層的存在，明顯改變了脂質體微粒的大小及分布。

2.3 體外消化穩定性

在模擬人體胃腸液環境中，通過測定分析NL和AL-CH-L隨消化時間的性質變化（平均粒徑、分散系數和Zeta電位）和包裹的熒光物質鈣黃綠素的釋放曲線，從而比較脂質體修飾前后的消化穩定性。結果如表1和圖6所示。

表1 NL和AL-CH-L在模擬胃腸液中消化120 min后的粒徑、分散系數和電位值Table 1 Particle size, PDI and zeta potential of NL and AL-CH-L after 120 min of digestion in SGF and SIF

由表1結合2.2節的結果可知，在模擬人體胃液環境中消化120 min后，NL和AL-CH-L的粒徑和電位變化均較小，NL的粒徑由（79.8±3.8）nm變化為（8 0.2±6.3）n m，A L-C H-L的粒徑由（330.6±37.3）nm變化為（299.5±15.2）nm；NL的電位由（-6.7±1.2）mV變化為（-4.4±0.6）mV，AL-CH-L的電位由（-15.8±0.7）mV變化至（-17.9±0.2）mV，可見其均呈現較好的穩定性，這與Rowland等[25]的報道一致，即大多數的脂質體在通過胃液低pH值的環境時受到的影響較小。在模擬人體腸液環境中消化120 min后，兩種脂質體則呈現不同的變化：NL粒徑由（79.8±3.8）nm增大為（124.1±12.1）nm，A L-C H-L的粒徑則由（3 3 0.6±3 7.3）n m變化至（5 1 3.6±1 5.0）n m；N L的電位由（-6.7±1.2）mV變化至（-32.2±6.0）mV，AL-CH-L的電位由（-15.8±0.7）mV變為（-22.2±0.2）mV，可見NL電位明顯增大，其變化較AL-CH-L更為明顯。AL-CH-L在腸液中粒徑增大，可能是在pH 7.4的環境下，CH質子化的程度降低，帶電量減少，CH與AL的靜電結合作用則減弱，導致了結構的松散和溶液介質滲透進粒子內部，故而粒徑增大；AL-CH-L消化120 min后帶電量沒有明顯變化，NL的帶電量則表現為明顯增大，原因可能是NL在胰蛋白酶和膽酸鹽的協同作用下，NL中磷脂的有序結構容易被破壞，引起脂質體的聚集融合，導致了粒徑的增大，同時磷脂的水解產物覆蓋在脂質體表面或者破壞后的脂質體與膽酸鹽結合形成囊泡，導致了其帶電量的增加[12]，而AL-CH-L在腸液中，因為受到AL-CH聚合物層的保護，其電位變化較小。

圖6 NL和AL-CH-L中鈣黃綠素在模擬胃腸液中的釋放Fig.6 Calcein release from nanoliposome and AL-CH-L in SGF and SIF

由圖6可知，在SGF中，兩種脂質體的結構未受到太多破壞，鈣黃綠素的釋放量少且區別不是很明顯，均表現出很好的穩定性。然而，在腸液中，消化15 min后，NL中鈣黃綠素的釋放為（35±9）%，而AL-CH-L中其釋放率僅為（15±1）%，消化120 min后，NL中鈣黃綠素釋放率為（58±2）%，而AL-CH-L釋放率僅為（38±2）%，并且從整個釋放曲線可以看出，AL-CH-L中鈣黃綠素的釋放率始終明顯低于NL。在NL中，脂質體中磷脂經過水解，形成了不穩定的微束結構[12]，導致了脂質體膜的通透性增強，故而鈣黃綠素的釋放增加。ALCH-L中鈣黃綠素釋放率的逐漸增加，可能是因為AL屬于腸溶性壁材，在胃液中，制備的AL-CH-L因AL的不溶性保護了脂質體，表現出結構較穩定；而在腸液中，AL逐漸溶解，包埋物也逐漸釋放。綜合分析可以看出，AL與CH在脂質體外層形成的保護層，可以在一定程度上提高脂質體在胃腸液中的穩定性。

3 結 論

殼聚糖和海藻酸鈉作為天然多糖，具有良好的生物相容性、生物降解性、無毒性，可作為脂質體安全的修飾劑材料。本實驗采用層層自組裝技術成功制備了海藻酸鈉-殼聚糖雙重修飾脂質體，通過原子力顯微鏡、透射電鏡和激光納米粒度儀對AL-CH-L的形貌和性質進行表征，并比較了修飾前后脂質體的體外消化穩定性，結果表明AL-CH-L較NL顯示出更好的體外消化穩定性。后期可以研究包埋多種模型藥物來進一步考察層層自組裝脂質體的穩定性。

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Preparation and in vitro Digestive Stability of Double Modified Liposomes through Layer-by-Layer Self-Assembly

LIU Zhen, ZOU Li-qiang, LIU Wei*, LIU Wei-lin, NIU Jing
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Sodium alginate (AL) and chitosan (CH) were coated onto liposome through layer by layer self-assembly technique. The physicochemical and morphological characteristics and in vitro digestive stability of AL-CH-L were observed. The results showed that 0.6% CH and 0.5% AL were the best choice to prepare AL-CH-L. Thus, the AL-CH-L revealed a size of (330.6 ± 37.3) nm with a centralized distribution and a zeta potential of (-15.8 ± 0.7) mV, and a polymer fi lm was successfully coated on the surface of liposome as observed under a transmittance electron microscope (TEM). Meanwhile, an obvious core-shell structure was observed. The in vitro digestion experiment carried out using the fl uorescence marker calcein showed better digestive stability of AL-CH-L when compared with common nanoliposomes.

double modif i ed liposome; chitosan; alginate; layer by layer self-assembly; digestive stability

TS201.2

A

1002-6630（2014）15-0005-06

10.7506/spkx10 02-6630-201415002

2013-07-31

國家自然科學基金地區科學基金項目（21266021）；食品科學與技術國家重點實驗室自由探索項目（SKLF-ZZB-201311）

劉珍（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食物（含生物質）資源的開發與利用。E-mail：ncuskliuzhen@163.com

*通信作者：劉偉（1972—），男，教授，博士，研究方向為食品高新技術與資源綜合利用。E-mail：liuwei@ncu.edu.cn