馬鈴薯抗性淀粉消化前后的益生作用與結(jié)構(gòu)變化

謝 濤，張淑遠(yuǎn)，王美桂

（湖南工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，湖南 湘潭 411104）

馬鈴薯抗性淀粉消化前后的益生作用與結(jié)構(gòu)變化

謝 濤，張淑遠(yuǎn)，王美桂

（湖南工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，湖南 湘潭 411104）

制備與純化得到馬鈴薯抗性淀粉及消化抗性淀粉，研究其益生作用與結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明：馬鈴薯抗性淀粉及消化抗性淀粉對雙歧桿菌和乳酸桿菌都有顯著的增殖作用，對大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌有強(qiáng)抑制作用，對糞腸球菌、梭狀桿菌、兼性細(xì)菌沒有影響；它們的發(fā)酵液總酸度增大，說明它們能被腸道益生菌發(fā)酵利用；馬鈴薯抗性淀粉經(jīng)消化處理后比表面積增加，經(jīng)發(fā)酵后比表面積更大；馬鈴薯抗性淀粉的平均聚合度較之原淀粉顯著變小，馬鈴薯抗性淀粉或消化抗性淀粉發(fā)酵后的平均聚合度降低；馬鈴薯抗性淀粉經(jīng)消化前后的晶型均為B型，其抗性淀粉及消化抗性淀粉發(fā)酵后的晶型都轉(zhuǎn)變?yōu)锳型，微晶度、亞微晶度及總結(jié)晶度較之發(fā)酵前都明顯降低。

馬鈴薯；抗性淀粉；益生作用；結(jié)構(gòu)變化

抗性淀粉作為一種新型的益生元制劑，具有來源廣泛、制備工藝簡單、口感好等優(yōu)點(diǎn)，在國外已被廣泛研究[1-4]。近些年來許多學(xué)者將研究的視角轉(zhuǎn)向了非糧淀粉資源[5-6]。國內(nèi)外已有許多關(guān)于馬鈴薯抗性淀粉的研究，但大多數(shù)研究主要集中在對其制備工藝的優(yōu)化方面[7-9]，而針對馬鈴薯抗性淀粉特別是其消化抗性淀粉的生物活性的研究，尚未引起國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注[10-12]。

本實(shí)驗(yàn)采用二次循環(huán)壓熱法制備并純化得到了馬鈴薯抗性淀粉，再經(jīng)人工胃液和人工胃腸液處理制得2 個(gè)消化抗性淀粉樣品，然后研究了這3 個(gè)樣品的益生作用及其結(jié)構(gòu)變化，以期探討消化前后的抗性淀粉在益生作用過程中可能的結(jié)構(gòu)變化及更多的功能。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑

選擇性培養(yǎng)基：麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（大腸桿菌）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（雙歧桿菌）、LAMVAB瓊脂培養(yǎng)基（乳酸桿菌）、麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基（糞腸球菌）、亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂培養(yǎng)基（梭狀桿菌）、甘露醇瓊脂培養(yǎng)基（產(chǎn)氣莢膜梭菌）、需氧-厭氧菌瓊脂培養(yǎng)基 美國Life Tech公司。

耐熱α-淀粉酶、糖化酶、胃蛋白酶、胰酶-5.0 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 抗性淀粉的制備與純化

制備：用蒸餾水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的淀粉乳液，調(diào)節(jié)pH 6.0，沸水浴30 min后，121 ℃高溫高壓處理4 0 min。冷卻，4 ℃放置24 h。重復(fù)高溫高壓和冷卻步驟，80 ℃烘干，粉碎過100 目篩得粗抗性淀粉。

純化：取粗抗性淀粉用耐熱α-淀粉酶在70 ℃水解1 h，加入過量糖化酶，55 ℃水解2 h，離心（3000 r/min、30 min），水洗離心多次，最后用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇的清洗、干 燥、粉碎，過200 目篩，得純抗性淀粉（resistant starch，RS）。

1.3 胃液、胃腸液消化抗性淀粉的制備

[13]的方法制備人工胃液和人工胃腸液消化抗性淀粉，分別簡稱為DRSAGJ、DRSAGIJ。

1.4 體外厭氧發(fā)酵

1.4.1 培養(yǎng)基

改良MRS培養(yǎng)基：以質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的抗性淀粉或消化抗性淀粉取代MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖作為碳源，以2%馬鈴薯原淀粉作為對照。選擇性培養(yǎng)基：同1.1節(jié)。

1.4.2 厭氧發(fā)酵

取23～31 歲健康男子（此前至少3 個(gè)月未注射抗生素，沒有預(yù)先服用已知的益生元或益生菌，沒有胃腸病史）的糞便，將糞便用磷酸鹽緩沖溶液制成均勻的懸濁液。取12 個(gè)50 mL的錐形瓶，設(shè)3 個(gè)平行，每個(gè)裝入20 mL改良MRS培養(yǎng)基，于121 ℃、105Pa滅菌20 min后，每個(gè)錐形瓶接入等量已多次用MRS培養(yǎng)基活化的糞便培養(yǎng)物，密封，37℃厭氧培養(yǎng)至10、20、30 h分別取樣，用于腸道微生物菌群組成和總酸度的測定分析。

1.4.3 腸道菌群分析

取樣品液1 mL，用生理鹽水稀釋一定倍數(shù)后涂布于選擇性平板上，于37 ℃需/厭氧培養(yǎng)48～72 h后，使用全自動(dòng)菌落分析儀計(jì)數(shù)。

1.4.4 發(fā)酵液總酸度測定

參照GB/T 12456—2008 《食品中總酸的測定》法測定每份發(fā)酵液的總酸度，并以乳酸含量表示。

1.4.5 發(fā)酵殘余物制備

取10 mL發(fā)酵液，離心（15 min、3 000×g），沉淀用10 mL蒸餾水清洗3次后烘干，粉碎過100目篩，這些發(fā)酵殘余物分別稱為發(fā)酵抗性淀粉（fermented resistant starch，F(xiàn)RS）、發(fā)酵胃液消化抗性淀粉（FDRSAGJ）和發(fā)酵胃腸液消化抗性淀粉（FDRSAGIJ）。

1.5 結(jié)構(gòu)測定

平均聚合度（DP值）測定采用碘吸收法[14]；掃描電子顯微分析參照文獻(xiàn)[15]的方法測定；X射線衍射分析參照文獻(xiàn)[16]的方法。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)為3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值，且采用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯抗性淀粉及消化抗性淀粉對腸道菌群生長的影響

馬鈴薯抗性淀粉及胃腸液消化抗性淀粉對腸道菌群生長的影響見表1。發(fā)酵至第30小時(shí)各種腸道微生物生長已處于衰老期，導(dǎo)致活細(xì)胞數(shù)目減少。當(dāng)發(fā)酵到20 h后，馬鈴薯抗性淀粉及其胃腸液消化抗性淀粉對雙歧桿菌和乳酸桿菌都有顯著的增殖作用，對大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用極顯著，對糞腸球菌、梭狀桿菌無影響。馬鈴薯胃腸液消化抗性淀粉比其抗性淀粉對雙歧桿菌、乳酸桿菌增殖效果更明顯，對產(chǎn)氣莢膜菌的抑制作用也更強(qiáng)些，說明抗性淀粉經(jīng)消化道環(huán)境的作用是其發(fā)揮益生作用所必需的，即消化抗性淀粉具有更好的益生作用，這與文獻(xiàn)[10,12]報(bào)道的結(jié)果非常一致。

表1 馬鈴薯抗性淀粉及消化抗性淀粉對腸道菌群生長的影響Table 1 Effects of potato resistant starches before and after digestion on intestinal bacteria lg（CFU/mL）

2.2 發(fā)酵液的酸度分析

表2 馬鈴薯抗性淀粉及消化抗性淀粉發(fā)酵液的總酸度（以乳酸表示）Table 2 Total acidities of fermentation liquids from resistant starches before and after digestion (expressed as lactic acid) g/L

發(fā)酵液的總酸度在一定程度上代表了益生菌，尤其是雙歧桿菌和乳酸桿菌的增殖情況，雙歧桿菌和乳酸桿菌的增殖會促進(jìn)丙酸、丁酸、乳酸等合成[17]。表2為添加不同馬鈴薯抗性淀粉和胃腸液消化抗性淀粉發(fā)酵后的總酸度（以乳酸質(zhì)量濃度表示）。從表2可知，馬鈴薯抗性淀粉及消化抗性淀粉的發(fā)酵液總酸度均比對照值要高（P＜0.01），說明抗性淀粉及消化抗性淀粉有利于產(chǎn)生更多的短鏈脂肪酸，而且后者 產(chǎn)生的要多些，這在文獻(xiàn)[18]中也有報(bào)道。

2.3 發(fā)酵前后馬鈴薯抗性淀粉及消化抗性淀粉的超微結(jié)構(gòu)變化

圖1 發(fā)酵前后馬鈴薯抗性淀粉及消化抗性淀粉的超微結(jié)構(gòu)（3 000×）Fig.1 Ultrastructures of resistant starch and digested resistant starch before and after fermentation (3 000 ×)

由圖1可知，經(jīng)壓熱制備的馬鈴薯抗性淀粉顆粒是層與層堆積而成的疊層結(jié)構(gòu)，表面粗糙；這是因?yàn)槭軌簾崽幚砗蟮牡矸鄯肿釉诶鋮s過程中，直鏈淀粉分子相互靠近形成新的雙螺旋并沉降，而且純化作用加速了無定形部分的酶解，剩下高度結(jié)晶的直鏈淀粉。馬鈴薯抗性淀粉經(jīng)人工胃液消化后，由于強(qiáng)酸侵蝕作用，疊層結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)大小、長短不一的裂縫，開始崩裂解體（圖1B）。而后經(jīng)人工胃腸液聯(lián)合作用，疊層結(jié)構(gòu)崩解成大小不一、散亂堆積的片層（圖1C）。馬鈴薯抗性淀粉經(jīng)發(fā)酵后，單一的疊層結(jié)構(gòu)崩解，每層裂解成大小不一的片層（圖1D）。人工胃液消化的馬鈴薯抗性淀粉經(jīng)發(fā)酵后，疊層結(jié)構(gòu)最終崩解成大小不一、散亂堆積的片層（圖1E）。而人工胃腸液消化的抗性淀粉發(fā)酵后，散亂堆積的片層繼續(xù)裂解，更小的片層堆積方式更加有序（圖1F）。

2.4 發(fā)酵前后抗性淀粉、消化抗性淀粉的平均聚合度變化

由表3可知，馬鈴薯抗性淀粉的λmax和DP值都比其原淀粉的小，特別是DP值發(fā)生了顯著變化。這是由于壓熱處理使部分直鏈淀粉分子斷裂，支鏈淀粉的部分支鏈斷裂轉(zhuǎn)化為直鏈淀粉，故而抗性淀粉的DP值要比其原淀粉的小；同時(shí)直鏈淀粉分子越大，越容易斷裂。消化前后的馬鈴薯抗性淀粉的DP值幾無變化，說明消化作用主要影響抗性淀粉分子的微觀結(jié)構(gòu)。發(fā)酵后馬鈴薯抗性淀粉或消 化抗性淀粉較之發(fā)酵前的DP值出現(xiàn)了較顯著的下降。再有，經(jīng)胃腸液消化過的馬鈴薯抗性淀粉經(jīng)發(fā)酵后的DP值比其發(fā)酵抗性淀粉經(jīng)的DP值減小，由此進(jìn)一步說明胃腸液的消化作用對抗性淀粉在腸道內(nèi)的益生作用是必要的，表2和圖2也證明了這一點(diǎn)。

表3 馬鈴薯抗性淀粉及消化抗性淀粉發(fā)酵前后的平均聚合度Table 3 Average degree of polymerization of resistant starch and digested resistant starch before and after fermentation

2.5 發(fā)酵前后抗性淀粉、消化抗性淀粉的結(jié)晶度變化

圖2 馬鈴薯抗性淀粉及消化抗性淀粉發(fā)酵前后的X射線衍射圖譜Fig.2 X-ray diffraction pat terns of resistant starch and digested resistant starches before and after fermentation

淀粉是主要由A型和B型晶體及少量V型晶體組成的混合物。由圖2、表4可知，馬鈴薯抗性淀粉的晶型為B型，說明在制備抗性淀粉的過程中，其分子鏈通過斷裂、重組，形成了更為穩(wěn)定的晶體結(jié)構(gòu)。馬鈴薯抗性淀粉經(jīng)胃液或胃腸液消化后的晶型仍為B型，與抗性淀粉相比，胃液消化抗性淀粉的微晶度、亞微晶度及總結(jié)晶度基本沒有變化，但胃腸液消化抗性淀粉亞微晶度與總結(jié)晶度有較大降低，說明經(jīng)過人工胃液的強(qiáng)酸侵蝕與分散作用，增強(qiáng)了人工腸液的消化作用。馬鈴薯抗性淀粉及其消化抗性淀粉經(jīng)發(fā)酵后，晶型都轉(zhuǎn)變?yōu)锳型，微晶度、亞微晶度及總結(jié)晶度較之發(fā)酵前都顯著降低，說明發(fā)酵作用對馬鈴薯抗性淀粉及消化抗性淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)有較大影響。

表4 馬鈴薯抗性淀粉及消化抗性淀粉發(fā)酵前后的結(jié)晶參數(shù)Table 4 Crystallization parameters of resistant starch and digested resistant starches before and after fermentation

3 結(jié) 論

馬鈴薯抗性淀粉及消化抗性淀粉對雙歧桿菌和乳酸桿菌都有顯著的增殖作用，對大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌有強(qiáng)抑制作用，對糞腸球菌、梭狀桿菌、兼性細(xì)菌無明顯影響。它們的發(fā)酵液總酸度增大，說明它們被腸道益生菌發(fā)酵利用產(chǎn)生了更多的短鏈脂肪酸。

馬鈴薯抗性淀粉經(jīng)人工胃液、胃腸液消化處理后結(jié)構(gòu)越來越疏松，且比表面積增加；馬鈴薯抗性淀粉及其消化抗性淀粉經(jīng)發(fā)酵后，它們進(jìn)一步裂解為以細(xì)小片層為主體的可能具有更大比表面積和堆積密度的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)變化可能與抗性淀粉在腸道中發(fā)揮的其他生理功能有關(guān)。

馬鈴薯抗性淀粉的DP值較之原淀粉顯著變小。消化前后馬鈴薯抗性淀粉的DP值基本沒有變化，說明胃腸液主要作用于抗性淀粉的微觀結(jié)構(gòu)。胃腸液消化過的馬鈴薯抗性淀粉經(jīng)發(fā)酵后的DP值比馬鈴薯抗性淀粉經(jīng)發(fā)酵后的DP值要小。

馬鈴薯抗性淀粉經(jīng)胃液或胃腸液消化前的晶型均為B型，胃腸液消化抗性淀粉亞微晶度與總結(jié)晶度有所降低。馬鈴薯抗性淀粉及消化抗性淀粉經(jīng)發(fā)酵后，晶型都轉(zhuǎn)變?yōu)锳型，微晶度、亞微晶度及總結(jié)晶度較之發(fā)酵前都明顯降低。

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Probiotic Functions and Structural Changes of Potato Resistant Starch before and after Digestion

XIE Tao, ZHANG Shu-yuan, WANG Mei-gui
(College of Chemical Engineering, Hunan Institute of Engineering, Xiangtan 411104, China)

Potato resistant starches before and after in vitro digestion were made and purif i ed. Their probiotic functions and structural changes were intensively studied. The results demonstrated that the undigested and digested resistant starches had good proliferative effects on bif i dobacterium and lactobacillus, but inhibitory effects on Escherichia coli and Clostridium perfringens, and no inf l uence on Enterococcus faecalis, Corynebacterium fusifome or facultative bacteria. The increase in total acidity after fermentation demonstrated that both these resistant starches could be utilized by intestinal probiotics. After digestion, the resistant starch had increased specif i c surface area, which was further increased after in vitro anaerobic fermentation. In comparison with the native starch, average degree of polymerization of the resistant starch was decreased signif i cantly and along with the digested resistant starch, was further reduced after fermentation. Both the resistant starch and its digestion product in vitro were type-B crystals. After fermentation, the crystal type became type A, and the degrees of microcrystallization and submicrocrystallization as well as total crystallinity were obviously decreased compared with those measured before fermentation.

potato; resistant starch; probotic function; structural change

TS235.2

A

1002-6630（2014）15-0105-04

10.7506/spkx1002-6630-201415021

2013-10-21

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011JJ6009）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201211342014）

謝濤（1970—），男，教授，博士，主要從事再生資源與食品、生物化工研究。E-mail：xt1105@aliyun.com