高產α-葡萄糖苷酶黑曲霉的微波選育及發酵條件優化

易菊陽，梁鈺婷，陸 兵，吳 昊，黃桂華，陳桂光，梁智群*

（廣西大學生命科學與技術學院，亞熱帶農業資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 53000 4）

高產α-葡萄糖苷酶黑曲霉的微波選育及發酵條件優化

易菊陽，梁鈺婷，陸 兵，吳 昊，黃桂華，陳桂光，梁智群*

（廣西大學生命科學與技術學院，亞熱帶農業資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 53000 4）

采用微波誘變技術對黑曲霉J2進行選育，得到1株α-葡萄糖苷酶活力較高的突變菌株ANY-4，酶活力達到305 U/mL，比 出發菌株提高了38.6%，且穩定性良好。通過單因素和正交試驗得到最適培養條件為：玉米淀 粉80 g/L、玉米漿干粉40 g/L、初始pH 4.5、裝液量50 mL/500 mL、接種量3%、培養溫度36 ℃、搖床轉速240 r/min、培養時間40 h。在最優培養條 件下進行發 酵，α-葡萄糖苷酶活力達到427 U/mL，比優化前提高了40%。

α-葡萄糖苷酶；微波誘變；黑曲霉；發酵條件優化

α-葡萄糖苷酶（α-D-glucoside glucohydrolase）又稱α-葡萄糖苷轉移酶，不僅能切割多糖非還原端的α-葡萄糖苷鍵產生α-D-葡萄糖[1]，還能將低聚糖中的α-1,4-糖 苷鍵切開并在分子內轉化成α-1,6-糖苷鍵[2]，從而生成異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖等功能性糖。α-葡萄糖苷酶種類多樣，廣泛存在于動物、植物和微生物中，其中黑曲霉和米曲霉產酶較高[3-4]。

α-葡萄糖苷酶是生產低聚異麥芽糖的關鍵酶[5]，而低聚異麥芽糖具有優越的理化特性和生理功能，如調節腸道有益菌群和增殖雙岐桿菌[6-7]、抑制大腸桿菌[8]、提高免疫力[9]，因而被廣泛用于食品、醫藥、保健及飼料等行業。但目前國內缺少大量廉價的酶源供應，生產低聚異麥芽糖所用的α-葡萄糖苷酶不得不依賴進口，多為日本天野酶制劑公司提供[10]，且價格昂貴約40萬元/噸[11]。國外學者在α-葡萄糖苷酶高產菌種的選育、酶的分離純化、酶學性質及固定化等[12-13]方面做了大量的研究工作，但國內鮮有α-葡萄糖苷酶商品化的相關報道。

從以往的文獻報道來看，α-葡萄糖苷酶高產菌種的選育方式主要集中在傳統的紫外誘變、氯化鋰誘變、Co60誘變、離子注入誘變、化學誘變及以上多種方法的聯合誘變方面[14-17]，采用微波誘變技術選育α-葡萄糖苷酶高產菌株的相關報道較少。微波誘變所需設備簡單、方法易行、操作安全、誘變效果較好[18-20]。本實驗采用微波誘變技術，對α-葡萄糖苷酶產生菌黑曲霉J2進行誘變選育，通過優化發酵條件，以期獲得酶活力大幅提高的突變菌株。

1 材料與方法

1.1 菌種、試劑與培養基

黑曲霉（Aspergillus niger）J2由本實驗室成員野外篩選所得。

高溫α-淀粉酶、高溫β-淀粉酶 廣西南寧東恒華道生物；玉米淀粉 山東西王集體淀粉廠；玉米漿干粉山東康源生物科技有限公司；葡萄糖、麥芽糖、臺盼藍美國Sigma公司；其他試劑為國產分析純。

平板培養基：可溶性淀粉20 g/L、葡萄糖5 g/L、氯化鈉35 g/L、瓊脂20 g/L、臺盼藍0.2 g/L、麩皮浸汁3%（體積分數），自然pH值，121 ℃滅菌20 min。

麩皮孢子培養基：麩皮4 g、蒸餾水2 mL，250 mL三角瓶，121 ℃滅菌20 min。

初篩培養基：麩皮30 g/L（沸水熬煮30 min，4 層紗布過濾去渣）、麥芽糖200 g/L，pH 4.5，115 ℃滅菌30 min。

復篩培養基：麩皮30 g/L（沸水熬煮30 min，4層紗布過濾去渣）、玉米淀粉45 g/L，pH 4.5，115 ℃滅菌30 min。

發酵培養基：玉米淀粉45 g/L、玉米漿干粉30 g/L，pH值自然，115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

G80F23CN1P-G5（SO）微波爐 格蘭仕微波爐電器有限公司；UV-1601紫外分光光度計 日本Shimadzu公司；HH-4 數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；SPX-250生化培養箱 上海躍進醫療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 孢子懸液的制備

接2環孢子于麩皮培養基中，37 ℃培養2 d，翻曲后再培養1 d，獲得孢子。再往長滿孢子的三角瓶里加入適量無菌生理鹽水，用無菌玻璃棒攪拌均勻。將攪拌后的混合物轉移到過濾裝置中，用2層紗布過濾，收集粗濾液。然后將粗濾液轉移到搖床中，用玻璃珠振蕩打散孢子。再用4層紗布細濾孢子液，調 整孢子濃 度至106個/mL，得孢子懸液。

1.3.2 微波誘變實驗

分別將5 mL（濃度106個/mL）孢子懸液置于潔凈的無菌試管中，套上試管帽。將試管斜置于裝滿冰水混合物的1 L燒杯內，移置微波爐中，分別在功率為160、320、480、640、800 W下進行誘變實驗，每隔1 min（間隔時間由預實驗確定）換冰1 次，以消除熱效應對孢子的致死作用，按此方法確定輻射功率對致死率和突變率的影響。確定誘變功率后，設置輻照時間梯度1、2、3、4、5、6、7、8、9 min，考察誘變時間對致死率和突變率的影響。每次實驗需將輻照后的孢子懸液置于4 ℃的冰箱避光冷藏2 h，然后再涂布平板恒溫培養。

1.3.3 菌株篩選

初篩：將微波輻照后的孢子懸液分別進行10-1、10-2、10-3、10-4梯度稀釋，用稀釋后的懸液涂布平板，于37 ℃培養2 d，計算致死率。按高通量篩 選模型[21]對突變情況作出評價，并計算突變率。

式中：對照組不經微波輻照，實驗組經微波輻照，突變菌株包括正突變菌株和負突變菌株；正突變菌株指實驗組中相對于對照組酶活力提高的菌株；負突變菌株是實驗組中相對于對照組酶活力降低的菌株。

搖瓶復篩：分別將初篩得到的正突變菌進行活化和孢子培養，并制備106個/mL的孢子懸液，再分別吸取2 mL接種于裝液量為80 mL/500 mL復篩培養基中，于37 ℃、200 r/min培養36 h后，抽濾收集菌絲，用菌絲進行轉苷反應，檢測并計算酶活力。

1.3.4 突變菌株遺傳穩定性評價

將復篩得到的突變菌株連續傳代8 次，檢測并計算酶活力，考察其遺傳穩定性。

1.3.5 α-葡萄糖苷酶發酵條件優化單因素試驗

1.3.5.1 碳源對酶活力的影響

以體積分數3%的麩皮浸汁為氮源，分別考察添加量為60 g/L的葡萄糖、乳糖、D-果糖、麥芽糖、木糖、蔗糖、小麥淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉等10 種碳源對酶活力的影響。其 中，小麥淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉在使用前需用高溫α-淀粉酶和高溫β-淀粉酶進行水解，裝液量為80 mL/500 mL。確定最佳碳源后，按添加量20、30、40、50、60、70、80、90、100 g/L進行優化，接種量2%，每一梯度做3組平行，考察其對酶活力的影響。

1.3.5.2 氮源對酶活力的影響

以45 g/L的玉米淀粉為碳源，分別考察了添加量為30 g/L的氯化銨、硫酸銨、磷酸二氫銨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米漿干粉等8 種氮源對酶活力的影響。并對最佳氮源按添加量10、20、30、40、50、60、70、80 g/L進行優化。其裝液量為80 mL/500 mL接種量為2%，每一梯度做3 組平行，考察其對酶活力的影響。

1.3.5.3 初始pH值對酶活力的影響

取500 mL三角瓶分別裝入80 mL發酵培養基，用5 mol/L的NaOH溶液或鹽酸溶液調節培養基初始pH值，建立pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的梯度，每個梯度3 組平行，滅菌后加入1.6 mL種子液，考察其對酶活力的影響。

1.3.5.4 裝液量對酶活力的影響

取500 mL三角瓶分別裝入15、30、50、80、100、120、140、160、180 mL發酵培養基，每組3 個平行樣，滅菌后分別接入2%的種子液，考察其對酶活力的影響。1.3.5.5 接種量對酶活力的影響

取500 mL三角瓶分別裝入80 mL發酵培養基。滅菌后按1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%接入種子液，每組3 個平行樣，考察其對酶活力的影響。

1.3.5.6 培養溫度對酶活力的影響

取500 mL三角瓶分別裝入80 mL發酵培養基，滅菌后加入1.6 mL種子液，分別考察溫度28、30、32、34、37、40、42 ℃對酶活力的影響，每組3 組平行樣。

1.3.5.7 搖床轉速對酶活力的影響

取500 mL三角瓶若干，分別裝入80 mL發酵培養基，滅菌后加入1.6 mL種子液，分別考察轉速140、160、180、200、220、240 r/min對酶活力的影響，每組3組平行樣。

1.3.5.8 培養時 間對酶活力的影響

取500 mL三角瓶分別裝入80 mL發酵培養基，滅菌后加入1.6 mL種子液，每8 h取樣檢測1 次，考察培養時間對酶活力的影響。

1.3.6 α-葡萄糖苷酶發酵條件優化正交試驗

通過單因素試驗可發現，在較大范圍內，接種量、玉米淀粉與玉米漿干粉添加量對酶活力影響較小；當搖床達到一定轉速后，酶活力上升平緩。而初始pH值、裝液量、培養溫度和培養時間對酶活力的影響都呈現出波峰狀，這表明酶活力對這些因素敏感，需嚴格控制。選擇初始pH值、裝液量、培養溫度和培養時間進行正交優化，能為后續的上罐放大實驗提供一定參考。基于此，進行四因素三水平正交試驗設計。

2 結果與分析

2.1 微波輻照功率對黑曲霉J2的誘變效果

將黑曲霉J2孢子懸液按微波輻照方法，分別置于不同功率下進行誘變實驗，其致死率和正突變率見圖1。孢子輻照致死率隨微波功率的遞增呈現上升的趨勢。隨著輻照功率的不斷增大，正突變率先增大后減小，當處理功率為640 W時，正突變率達到最大值80%，隨后正突變率降低。因此，后續輻照實驗選擇640 W進行處理。

圖1 微波輻照功率對致死率和突變率的影響Fig.1 Effect of microwave power on the death rate and mutation rate of spores

2.2 微波輻照時間對黑曲霉J2的誘變效果

將黑曲霉J2孢子懸浮液置于功率為640 W的微波爐中進行輻照，不同處理時間下致死率和突變率的情況見圖2。

圖2 微波輻照時間對致死率和突變率的影響Fig.2 Effect of microwave irradiation time on the death rate and mutation rate of spores

由圖2可知，在640 W輻照條件下，孢子致死率隨著輻照時間的延長呈上升趨勢，在0～2 min致死幅度較小，2～6 min致死幅度明顯加大，6～9 min致死幅度降低但總體致死率很高。輻照6 min時致死率達到了87%，輻照9 min時致死率高達98%。孢子正突變率隨輻照時間的增加，呈現先增長后降低的趨勢。輻照5 min時正突變率達到了84%，輻照6 min時正突變率達到了最大值89%。因此，選擇6 min為最佳微波輻照時間。

2.3 突變菌株遺傳穩定性比較

通過對5 872 株菌進行初篩，并對56 株菌進行復篩得到4 株酶活力相對較高的突變菌株，編號命名為ANY-1、ANY-2、ANY-3和ANY-4。將該4株突變菌株與原菌J2對照進行遺傳穩定性實驗。其結果見圖3。

圖3 突變菌株遺傳穩定性Fig.3 Genetic stabili ty of the mutant strains

由圖3可知，4 株突變菌株的總體酶活力高于出發菌株J2，但ANY-1和ANY-2在傳代的過程中酶活力波動較大且呈下降趨勢，ANY-3和ANY-4傳代過程中酶活力相對穩定。相比較而言ANY-4總體酶活力集中在300 U/mL，顯然高于ANY-3的酶活力，且表現出良好的穩定性。因此，ANY-4即為最終篩選所得的目的菌株。

2.4 發酵條件優化結果

2.4.1 碳源對酶活力的影響

圖4 碳源種類（A）及玉米淀粉添加量（B）對酶活力的影響Fig.4 Effects of carbon sources (A) and corn starch concentration ( B) on α-glucosidase activity

由圖4A可知，不同碳源對ANY-4產α-葡萄糖苷酶酶活力影響明顯。以麥芽糖、木薯淀粉、玉米淀粉和可溶性淀粉為碳源時，ANY-4酶活力較高，其中以玉米淀粉作為碳源時酶活力達到最高值305 U/mL。由圖4B可知，ANY-4酶活力隨著玉米淀粉添加量的增加先上升再趨于平穩最后呈現下降趨勢，其中添加量在40～90 g/L時酶活力相對較高，當添加量大于90 g/L時酶活力出現降低趨勢。因此，應選玉米淀粉作為最佳碳源，其最佳添加量為80 g/L。

2.4.2 氮源對酶活力的影響

圖5 氮源種類（A）及玉米漿干粉添加量（B）對酶活力的影響Fig.5 Effects of nitrogen sources (A) and corn steep liquor concentration (B) on α-glucosidase activity

由圖5A可知，不同氮源對ANY-4產α-葡萄糖苷酶酶活力影響較大。在所考察的多種氮源中，玉米漿干粉對ANY-4產酶有明顯的促進作用，其酶活力可達到308 U/mL。以氯化銨、硫酸銨、磷酸二氫銨、酵母膏等為氮源，ANY-4酶活力很低。由圖5B可知，酶活力隨玉米漿干粉添加量的增加先升高后降低，添加量在40～60 g/L時酶活力相對較高且趨于平穩，最高酶活力達到了348 U/mL。因此，選用添加量為40 g/L的玉米漿干粉作為最佳氮源。

2.4.3 初始pH值對酶活力的影響

圖6 初始pH值對酶活力的影響Fig.6 Effect of initial pH on α-glucosidase activity

由圖6可知，不同初始pH值對ANY-4產α-葡萄糖苷酶酶活力影響明顯。隨著初始pH值不斷加大，酶活力先增加后降低，當pH值在4～5范圍內表現出較高酶活，其中最高酶活力達到了363 U/mL。當pH＞5時，酶活力大幅度降低。因此，pH 4.5為ANY-4菌株最適pH值。

2.4.4 裝液量對酶活力的影響

圖7 裝液量對酶活力的影響Fig.7 Effect of fermentation medium volume on α-glucosidase activity

由圖7可知，裝液量過小或過大都不利于產酶，最佳裝液量為50 mL/500 mL。裝液量過小，培養基養料相對不足，難以滿足菌生長所需；裝液量過大，阻礙了發酵過程中的通氣和溶氧，致使菌體生長緩慢、產酶過低。

2.4.5 接種量對酶活力的影響

圖8 接種量對酶活力的影響Fig.8 Effect of inoculum volume on α-glucosidase activity

由圖8可知，接種量從1%到9%對酶活力的影響總體不大，當接種量為3%時有最大酶活力398 U/mL。因此，確定3%為搖瓶發酵最佳接種量。

2.4.6 發酵溫度對酶活力的影響

圖9 發酵溫度對酶活力的影響Fig.9 Effect of fermentation temperature on α-glucosidase activity

由圖9可知，隨著發酵溫度不斷升高，酶活力先升高后降低，在36 ℃時酶活力達到最大值387 U/mL。發酵溫度從28 ℃提高到36 ℃的過程中，酶活力上升幅度明顯。當發酵溫度高于38 ℃后，酶活力迅速降低，42 ℃酶活力低至123 U/mL。因此，最佳發酵溫度為36 ℃。

2.4.7 搖床轉速對酶活力的影響

由圖10可知，隨著搖床轉速的提高，酶活力呈現上升的趨勢，當轉速提高到240 r/min時酶活力達到392 U/mL。由于實驗室搖床轉速的限制，無法獲知更高轉速條件下酶活力的變化趨勢，基于黑曲霉為好氧菌的特性，因此做出以下推斷：當搖床轉速繼續增大時，酶活力還會相應提高，但任何一個發酵體系其溶氧量是有限的，因此當搖床轉速提高到其飽和溶氧量后酶活力不再上升，達到最大值。

2.4.8 培養時間對酶活力的影響

圖11 培養時間對酶活力的影響Fig.11 Effect of cultivation time on α-glucosidase activity

由圖11可知，隨著培養時間的增加，酶活力先上升后下降，在培養40 h左右出現最大酶活力。

2.5 正交優化試驗結果

表1 正交試驗設計與結果Table 1 Results and range analysis of orthogonal array design experiments for optimizing fermentation conditions of ANY-4

表2 正交試驗結果方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal array design experiments for optimizing fermentation conditions of ANY-4

由表1極差分析結果可知，影響發酵產α-葡萄糖苷酶的因素依次為：裝液量＞初始pH值＞培養時間＞發酵溫度。優選組合為A2B2C2D2，在此條件下進行發酵，酶活力可達到427 U/mL。由表2方差分析結果可知，初始pH值和裝液量對酶活力的影響顯著，培養時間和溫度影響不顯著。菌株ANY-4產α-葡萄糖苷酶最適條件為：玉米淀粉80 g/L、玉米漿干粉40 g/L、初始pH 4.5、接種量3%、裝液量50 mL/500 mL、36 ℃、240 r/min、培養40 h。

3 討論與結論

微波是一種穿透力極強的電磁波，能使水分子、核苷酸等極性分子高速旋轉。在2 450 MHz頻率下，微波能使水分子在1 s內180°來回轉動24.5×108次，由于分之間的強烈摩擦，使得細胞內DNA分子的氫鍵和堿基受損，從而導致遺傳變異。微波誘變育種在很多領域已經取得一定成效。潘麗霞等[22]利用微波誘變成功選育出1株利用木糖產油酵母，其產油能力是原始菌株的2.56 倍。王勇等[23]采用微波誘變技術對啤酒酵母出發菌株SY-9進行處理，得到1 株適量低產SO2的新菌株。朱莉娜等[24]采用微波誘變技術對啤酒酵母進行誘變，得到1株適量低產高級醇啤酒酵母新菌株。梅林等[25]對枯草芽孢桿菌菌株進行微波誘變處理，得到1 株穩定性良好菌株，凝乳酶活力達到516.12 U/g，比出發菌株提高了29%。馬勇等[26]通過微波誘變成功選育出1 株產油酵母菌。徐偉等[27]利用微波輻照誘變成功選育了1 株高產橙色素且性狀穩定的紅曲霉菌。因此，利用微波誘變對α-葡萄糖苷酶高產菌株進行選育具有可行性。

本實驗采用微波誘變技術對黑曲霉J2進行誘變。通過初篩、復篩及穩定性實驗，從而獲得了一株名為ANY-4，酶活力較高且遺傳穩定的優良菌株。其 酶活力達到了305 U/mL，相對出發菌株220 U/mL的酶活力提高了38.6%。后經單因素試驗和正交優化試驗，酶活力進一步提高到427 U/mL，相對優化前提高了40%，優化效果明顯。因此，微波誘變能有效選育出高產α-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株。

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Microwave Breeding of Aspergillus niger with High α-Glu cosidase Activity and Optimization of Its Fermentation Conditions

YI Ju-yang, LIANG Yu-ting, LU Bing, WU Hao, HUANG Gui-hua, CHEN Gui-guang, LIANG Zhi-qun*
(State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, China)

α-Glucosidase is the key enzyme involved in the production of isomaltoligosaccharides which are widely applied in the food, medicine, health care and feed industries. A mutant Aspergillus strain named ANY-4, with high α-glucosidase activity and good genetic stability, was obtained from Aspergillus niger J2 via micro wave-induced mutation. Its enzymatic activity was 305 U/mL, which was 38.6 % higher than that of Aspergillus niger J2. To produce α-glucosidase with a high yield, single factor experiments and orthogonal array design methods were performed to determine the optimal fermentation conditions as follows: corn starch 80 g/L, corn steep liquor powde r 40 g/L, initial pH 4.5, fermentation medium volume 50 mL in 500 mL flasks, i noculum quantity 3% (V/V), 36 ℃, 240 r/min and fermentation for 40 h. Under these conditions, the α-glucosidase activity was 427 U/mL, which was increased by 40% as compared to that obtained before optimization.

α-glucosidase; microwave mutagenesis; Aspergillus niger; optimization

Q815

A

1002-6630（2014）15-0145-06

10.7506/spkx1002-6630-201415030

2013-10-10

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2006AA10Z339）；國家自然科學基金地區科學基金項目（20362001）

易菊陽（1987—），男，碩士研究生，研究方向為微生物工程。E-mail：jyyi2011@163.com

*通信作者：梁智群（1959—），男，教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：zqliang@gxu.edu.cn