響應面法優化郫縣豆瓣制曲工藝

孟 甜，黃韜睿，李玉鋒

（1.四川旅游學院烹飪系，四川 成都 610100；2.西華大學生物工程學院，四川 成都 610039）

響應面法優化郫縣豆瓣制曲工藝

孟 甜1，黃韜睿1，李玉鋒2

（1.四川旅游學院烹飪系，四川 成都 610100；2.西華大學生物工程學院，四川 成都 610039）

本實驗采用Box-Behnken法分析優化郫縣豆瓣制曲工藝。在單因素試驗的基礎上，選取曲精量、制曲溫度、制曲時間為響應因素，以成曲質量指標（蛋白酶活力和α-淀粉酶活力）綜合評分為響應值，建立回歸模型，并結合實際操作情況，得出郫縣豆瓣最佳制曲工藝條件為：曲精量0.28%、制曲溫度33.50 ℃、制曲時間32.50 h，此時成曲質量指標綜合評分為98.23。

Box-Behnken法；優化；郫縣豆瓣；制曲工藝

郫縣豆瓣是最為出名的四川調味品之一，被譽為川菜之魂[1-2]，以色澤油潤紅亮、醬香濃郁、味鮮辣醇和、外觀黏稠絨實等特點著稱[3-4]。在許多經典川菜如麻婆豆腐、回鍋肉等的烹調中都必不可少，而且還是四川火鍋底料中的主料，不僅增色提味，還別具風味。

傳統郫縣豆瓣以豆瓣為原料，霉菌為主要微生物菌種，經自然制曲、天然發酵而成[5]。制曲的目的是通過米曲霉等菌種在原料上生長繁殖，以便于在發酵時利用它們所分泌的多種酶類。這種方法通常需要7～8 d，受到季節限制不能常年生產，且成曲質量也不穩定[6]。而豆瓣質量的好壞關鍵在于制曲質量，因此在整個生產過程中制曲環節顯得尤為重要，是豆瓣生產中最重要的質量控制點[7]。目前對豆瓣發酵工藝研究較多[8-12]，而制曲工藝的報道卻較少。為了對傳統的制曲工藝進行優化，在單因素試驗的基礎上，通過Box-Behnken法，以成曲中蛋白酶活力和α-淀粉酶活力為指標，對影響成曲質量的主要因素進行研究，并對結果加以驗證。

1 材料與方法

1.1 菌種

滬釀3.042號米曲霉 中國科學院成都分院。

1.2 試劑

鉬酸鈉、鎢酸鈉、硫酸鋰、磷酸、濃鹽酸、碳酸鈉、三氯乙酸、硼酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、碘液 成都科龍化工試劑廠。

1.3 儀器與設備

UV-2600紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；ISO9001電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；HH-S數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫療儀器廠；DHP-9082電熱恒溫培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司；HWS-250型恒溫恒濕培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；PHS-25型pH計 上海雷磁儀器廠；TMQ-R-3250自動臺式滅菌鍋 山東新華醫療器械股份有限公司。

1.4 方法[13]

1.4.1 蛋白酶活力測定

稱取充分研細的成曲5 g，加水至100 mL，在40 ℃水浴內間斷攪拌1 h，過濾，濾液用pH 7.2磷酸緩沖液稀釋至一定倍數；取樣品稀釋液1 mL，置于40 ℃水浴中預熱2 min，再加入同樣預熱的酪蛋白溶液1 mL，精確保溫10 min，時間到后立即再加入0.4 mol/L三氯乙酸2 mL終止反應；繼續置于水浴保溫20 min，使殘余蛋白質沉淀后過濾，取濾液1 mL，再加0.4 mol/L碳酸鈉5 mL、已稀釋的福林試劑1 mL搖勻，40 ℃保溫發色20 min后，680 nm波長處測定吸光度。空白對照在加酪蛋白之前先加0.4 mol/L三氯乙酸2 mL，使酶失活，再加入酪蛋白[14]。

在40 ℃下，每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位，以U/g干基表示。

1.4.2 α-淀粉酶活力測定

取2%可溶性淀粉20 mL和pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液5 mL于25 mm×200 mm試管中，在60 ℃恒溫水浴中預熱4～5 min。加入預先稀釋的酶液0.5 mL，立即記錄時間，充分搖勻，定時用吸管取出反應液0.5 mL，滴于預先充滿比色稀碘液（約1.5 mL）的白瓷板空穴內。當穴內顏色反應由紫色逐漸變為紅棕色，與標準終點色相同時，即為反應終點，并記錄時間/min。1 mL酶液于60 ℃、pH 6.0條件下，1 h液化1 g可溶性淀粉，即為1個酶活力單位，以U/g干基表示。

1.5 制曲工藝

取蒸熟冷卻后的蠶豆和小麥（質量比4：1）500 g，加入已與面粉拌和后的曲精（曲精、面粉質量比1：10），充分拌勻，攤平，置于恒溫恒濕培養箱中按照試驗設計工藝條件進行培養，中間翻曲一次。其中，曲精呈黃綠色、無夾心、無灰黑絨毛及其他異色，孢子數經測定[15]約為17×109個/g（干基計），細菌數低于104個/g。

1.6 試驗設計

1.6.1 單因素試驗

以蛋白酶活力和α-淀粉酶活力為指標，采用單因素試驗依次對曲精量、制曲溫度、制曲時間進行考察，試驗水平分別選取曲精量質量分數0.05%、0.15%、0.25%、0.35%、0.45%、0.55%；制曲溫度25、28、31、34、37、40 ℃；制曲時間12、18、24、30、36、42、48 h。

1.6.2 Box-Behnken試驗設計

根據單因素試驗結果及Box-Behnken的中心組合設計原理，采用響應面法設計三因素三水平試驗方案。響應變量Y為根據蛋白酶活力和α-淀粉酶活力在成曲質量中的重要性求加權和得到的綜合評分。自變量A為曲精量、B為制曲溫度、C為制曲時間。本試驗的設計、模型建立及數據分析，利用Design Expert 8.0.5軟件輔助完成。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 曲精量考察

接種曲精量直接影響豆瓣制曲的周期。接種量大可縮短制曲周期，減少雜菌污染機會；但接種量過大，營養物質主要被用于菌體細胞增長，并產生大量代謝廢物，導致微生物所處環境惡化，菌體細胞會較早衰老，且有限的營養物質也不足以維持米曲霉的生長所需，會形成大量休眠孢子，降低酶活力；接種量過小，微生物生長繁殖不足，使得營養過剩，造成浪費，增加生產成本[16]。選定制曲時間30 h、制曲溫度30 ℃，考察曲精量對成曲質量的影響，結果如圖1所示。

圖1 曲精量對蛋白酶活力和α-淀粉酶活力的影響Fig.1 Effect of inoculum amount on protease activity and α-amylase activity

由圖1可知，蛋白酶活力和α-淀粉酶活力隨接種曲精量的增加而增大，達到最大值時的曲精量分別為0.25%、0.35%，相應的酶活力分別為2 135.81、133.45 U/g；隨著接種量的持續增加，酶活力呈逐漸減小趨勢。因此，控制接種曲精量在0.25%～0.35%。

2.1.2 制曲溫度考察

溫度是影響微生物生長繁殖的重要因素之一。一般來講，溫度低于25 ℃霉菌發芽緩慢；溫度高于38 ℃，也不利于霉菌發芽，反而適合細菌的發育繁殖，易染雜菌，影響制曲[17-18]。在溫度控制適當時，米曲霉占絕對優勢，可以抑制雜菌生長，空氣中的雜菌只能少量繁殖，對成曲的質量影響不大。選定接種曲精量為0.25 %，制曲時間30 h，考察制曲溫度對成曲質量的影響，結果如圖2所示。蛋白酶活力和α-淀粉酶活力隨著制曲溫度的升高而增大，達到最大值時的溫度分別為34、31 ℃；隨著制曲溫度的繼續升高，酶活力呈逐漸減小趨勢。因此，控制制曲溫度在31～34 ℃。

圖2 制曲溫度對蛋白酶活力和α-淀粉酶活力的影響Fig.2 Effect of koji-making temperature on protease activity and α-amylase activity

2.1.3 制曲時間考察

制曲時間對微生物生長繁殖有著重要影響。制曲時間過短，微生物生長沒有達到最佳，原料利用率低，酶活力不高；制曲時間過長，酶活力反而逐漸下降，同時由于微生物的生長繁殖，又需要多消耗原料，增加了浪費，而且影響制曲設備的周轉、增加通風機電力消耗[19]。因此以酶活力達到最高點為依據制定制曲時間。選定接種曲精量為0.25 %、制曲溫度31 ℃，考察制曲時間對成曲質量的影響，結果如圖3所示。

圖3 制曲時間對蛋白酶活力和α-淀粉酶活力的影響Fig.3 Effect of koji-making time on protease activity and α-amylase activity

由圖3可知，隨著制曲時間的延長，蛋白酶活力和α-淀粉酶活力逐漸增大，二者達到峰值的時間分別為30、36 h；繼續延長制曲時間，蛋白酶活力和α-淀粉酶活力逐漸減小。因此選擇制曲時間在30～36 h之間。

2.2 Box-Behnken試驗設計結果

Box-Behnken試驗設計與結果見表1。對表1試驗數據進行二次多項回歸擬合，獲得成曲質量指標（蛋白酶活力和α-淀粉酶活力）的綜合評分Y對自變量曲精量（A）、制曲溫度（B）、制曲時間（C）的多元回歸方程：

該模型方差分析結果見表2。對成曲質量綜合評分所建立的回歸模型極顯著（P＜0.000 1），且各因子系數均有意義，試驗的3 個因素對蛋白酶活力的曲面效應皆顯著，對綜合評分的交互影響中，AB、AC交互作用顯著。此外，回歸模型的診斷分析表明，相關系數R2= 0.994 2，模型的信噪比為25.293，一般認為模型的可接受信噪比大于4，說明模型的擬合度和可信度非常高；變異系數越小說明試驗可靠性越高，本試驗的變異系數為1.73，說明試驗可靠性良好。

表1 Box-Behnken設計矩陣響應數據結果Table 1 Box-Behnken design matrix with experimental results and response valluueess

表2 回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance for the regression model

為更直觀地反映響應因素對響應值的影響，對獲得的回歸模型進行響應面圖及等高線圖分析，結果如圖4所示。可以看出，3 個響應因素在選定的范圍內都存在響應極值，AB、AC交互作用顯著，BC交互作用不顯著，結果與方差分析的結果一致。由等高線和響應面圖分析，結合回歸模型可以預測出當曲精量（A）為0.28%、制曲溫度（B）33.67 ℃、制曲時間（C）32.73 h時，成曲質量指標綜合評分為98.69。

圖4 各因素及其相互作用影響綜合評分的響應面及等高線Fig.4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of independent variables on comprehensive quality score

2.3 回歸模型的實驗驗證

為驗證預測值與真實值之間的擬合程度及方程的合適性、有效性，采用綜合評分最大響應值對應的響應因素值進行實驗驗證，考慮到實際操作的方便及工藝的實際情況，對響應因素值進行修正，曲精量（A）為0.28 %、制曲溫度（B）33.50 ℃、制曲時間（C）32.50 h，經過3 組平行實驗，綜合評分平均值為98.23，預測結果（98.69）與實驗值相對偏差僅為0.47%，此時蛋白酶活力和α-淀粉酶活力平均值分別為2 071.06 U/g、138.72 U/g。證明模型是合適有效的，具有一定的實踐指導意義。在后期發酵實驗中[20]，測得豆瓣的氨基酸態氮含量為1.95 g/100 g，全氮利用率可達90%以上，與制曲工藝優化前相比提高了10%左右。

3 結 論

在本實驗范圍內，曲精量、制曲溫度、制曲時間對郫縣豆瓣制曲過程中米曲霉產蛋白酶活力、α-淀粉酶活力均有顯著影響，顯著順序為曲精量＞制曲時間＞制曲溫度，而且各因素存在一定的交互作用。

通過單因素試驗和Box-Behnken試驗得出郫縣豆瓣最優的制曲工藝條件為：接種曲精量0.28%、制曲溫度33.50 ℃、制曲時間32.50 h，在此條件下成曲質量指標綜合評分可達98以上。同時，在本試驗范圍內建立的回歸模型可靠有效，可用來預測設定條件范圍內郫縣豆瓣制曲工藝參數的響應值，且擬合度較好，在此條件下，豆瓣的氨基酸態氮含量為1.95 g/100 g豆瓣，全氮利用率達90%以上，與制曲工藝優化前相比提高了10%左右。研究結果可為郫縣豆瓣傳統制曲工藝的改進提供參數借鑒。

[1] 韓永奇. 關于提升郫縣豆瓣品牌力的市場觀察與思考[J]. 中國調味品, 2009, 34 (6): 115-117.

[2] 石磊, 李誠. HACCP在郫縣豆瓣生產中的應用[J]. 中國調味品, 2007, 32(6): 25-27.

[3] 高嶺. 郫縣豆瓣的生產工藝改進[J]. 中國調味品, 2006, 31(5): 34-39.

[4] 李幼筠. “郫縣豆瓣”剖析[J]. 中國釀造, 2008, 27(11): 83-86.

[5] 李從虎, 鄭佳, 謝菲, 等. 郫縣豆瓣曲曲霉的篩選、分子鑒定及其酶學性質的研究[J]. 中國釀造, 2010, 29(5): 30-34.

[6] 余浪, 闞建全. 傳統豆瓣的研究進展[J]. 中國調味品, 2008, 33(5): 26-31.

[7] 高嶺. 郫縣豆瓣生產中質量控制點剖析[J]. 中國調味品, 1998, 23(9): 20-23.

[8] 杜木英, 余浪, 趙曉娟, 等. 傳統豆瓣快速發酵工藝條件優化[J]. 食品科學, 2013, 34(11): 203-207.

[9] 張玉玉, 孫寶國, 馮軍, 等. 不同發酵時間的郫縣豆瓣醬揮發性成分分析[J]. 食品科學, 2010, 31(4): 166-170.

[10] 趙建新, 王淼, 毛丙永, 等. 含鹽量和溫度對豆醬發酵過程的影響[J].食品科學, 2011, 32(23): 220-224.

[11] 邵偉, 唐明, 藏占鋒, 等. 傳統豆瓣醬釀造工藝改進與優化研究[J].中國釀造, 2010, 29(3): 130-132.

[12] 李紅玫, 劉忠華. 豆瓣醬發酵工藝的優化[J]. 中國調味品, 2012, 37(6): 65-70.

[13] 上海釀造科學研究所. 發酵調味品生產技術修訂版[M]. 北京: 中國輕工業出版社, 2002.

[14] 張青, 許學書, 謝靜莉, 等. 米曲霉蛋白酶動力學特性的研究[J]. 食品科學, 2007, 28(6): 213-217.

[15] 傅力, 章運, 艾乃吐拉, 等. 醬油生產中高產蛋白酶菌株米曲霉UF366發酵條件的研究[J]. 食品科學, 2008, 29(9): 427-430.

[16] 鄧靖, 林親錄, 趙謀明, 等. 米曲霉M3產蛋白酶特性研究[J]. 中國調味品, 2005, 30(1): 16-18.

[17] 陳紅梅, 潘力. 米曲霉3.042種曲蛋白酶特性研究[J]. 中國調味品, 2009, 34(3): 63-64.

[18] QU Zhi, JIANG Aimin, CHEN Mingtao, et al. Potential starter culture isolated from traditional fermented Yangjiang lobster sauce and protease characteristics research[J]. Food Science and Technology Research, 2012, 18(4): 585-591.

[19] 李存富. 醬曲蛋白酶活力測定-氨基氮法[J]. 中國調味品, 2006, 31(3): 48-49.

[20] 顧立眾. 醬醅低鹽發酵工藝條件的優化研究[J]. 食品科學, 2009, 30(9): 180-183.

Optimization of the Preparation of Pi’xian Bean Sauce Koji by Response Surface Methodology

MENG Tian1, HUANG Tao-rui1, LI Yu-feng2
(1. Department of Cuisine, Sichuan Tourism University, Chengdu 610100, China; 2. College of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China)

Response surface methodology using Box-Behnken design was employed to optimize the preparation of Pi’xian bean sauce koji. Based on single-factor experiments, inoculum amount, koji-making temperature and time were chosen as independent variables, and the comprehensive evaluation score of koji quality indicators (protease activity and α-amylase activity) was the response variable. As a result, a mathematical model was established by Box-Behnken design. The optimal preparation conditions for Pi’xian bean sauce koji under actual operation circumstances were determined as 0.28%, 33.50 ℃ and 32.50 h for inoculum amount, koji-making temperature and time, respectively. The resulting product exhibited a comprehensive quality score of 98.23.

Box-Behnken design; optimization; Pi’xian bean sauce; koji preparation

TS264.2

A

1002-6630（2014）15-0193-05

10.7506/spkx1002-6630-201415039

2013-09-05

四川省教育廳科研基金項目（10ZC063）

孟甜（1985—），女，講師，碩士，研究方向為食品科學。E-mail：mengtian85@sohu.com