基于電子舌對富含ACE抑制肽大米蛋白水解物的脫苦評價

胡勤玲，鄭良清，王 申，易 青，吳永寧，宮智勇*

（武漢輕工大學食品科學與工程學院，農產品加工湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430023）

基于電子舌對富含ACE抑制肽大米蛋白水解物的脫苦評價

胡勤玲，鄭良清，王 申，易 青，吳永寧，宮智勇*

（武漢輕工大學食品科學與工程學院，農產品加工湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430023）

利用風味酶、活性炭、β-環狀糊精對大米蛋白水解液進行脫苦，采用電子舌技術評價脫苦效果，并用高效液相色譜法評價脫苦前后的水解物對血管緊張 素轉化酶活性抑制效果變化，探討大米蛋白水解物的最佳脫苦工藝。結果表明，風味酶法脫苦的最佳處理條件為加酶量2.5%、水解時間20 min、水解pH 5.8；活性炭脫苦的最佳處理條件為活性炭用量2.0%、料液溫度60℃、處理時間20 min、料液pH 7.0；β-環狀糊精脫苦的最佳處理條件為10% β-環狀糊精包埋30 min。

血管緊張素轉化酶抑制肽；脫苦；電子舌；風味酶；活性炭；β-環狀糊精

大米蛋白是一種優質的植物蛋白，經過水解的大米蛋白，可釋放出一定的氨基酸和生物活性肽，增大蛋白分子極性，在增大其溶解性的同時，其發泡、乳化等性質也表現出來。隨著溶解度增加，其泡沫穩定性和乳化穩定性卻并未呈現規律性變化。基于大米蛋白溶解性差的特點，對大 米蛋白進行水解獲得 活性多肽就具有很高的研究價值[1-3]。生物活性肽是指有益于生物機體的生命活動或者具有生理作 用的肽類化合物，又稱功能肽，它們具有多種生理功能，如激素作用、免疫調節、抗血栓、抗高血壓、降膽固醇、抑菌、抗病毒、抗癌作用等[4-5]。

酶法水解蛋白質可得到多種具有高血管緊張素轉化酶（angiotensin Ⅰ-converting enzyme，ACE）活性抑制作用的降壓肽，但在水解的同時也會有相應的苦味肽形成，嚴重影響其可食性[6]。苦味肽的分子鏈中都含有疏水性的環狀氨基酸結構，產生的苦味均與舌部味蕾細胞表面蛋白質的三維結構密切相關。苦味化合物與舌部味蕾膜蛋白相互結合后，其疏水基更大程度增加了分子間的結合力，并使結合產物之間的氫鍵共價鍵及離子鍵等之間的結合更加穩定。因此，通常的水溶液很難使已與味蕾蛋白結合的苦味肽游離出來。有學者已對這些苦味物質作過不同程度的研究，這些物質是一些疏水性的肽類，國外有報道用酶法類蛋白反應覆蓋法來解決苦味，仍處于理論研究狀態，對苦味去除的系統研究和脫苦的大米蛋白功能產品國內報道較少[7-8]。

為得到口感和風味俱佳的多肽產品，人們在科學研究和生產實踐中針對性找到許多消除和降低蛋白酶解產物的脫苦技術。現代主要脫苦方法有物理脫苦、酶法脫苦和微生物脫苦3種。對苦味的評價長期以來主要采用感官評定法，但其結果不夠客觀，易受環境、評價者情緒、健康狀況等的影響[9-10]。電子舌作為一種快速檢測味覺品質的新技術，能夠以類似人的味覺感受方式檢測出味覺物質，可以對樣品進行量化，同時可以對一些成分含量進行測量，具有高靈敏度、可靠性、重復性[11]。感官評定法依賴經過長期訓練、擁有特殊味覺判別能力的品評專家來判斷，很多時候難以找到適合的人選，且人的感覺器官在分辨力、敏感度、穩定性等方面存在個體差異并極易受外界因素的干擾[12-14]，儀器評價方法則避免了感官評價的不足。電子舌是以人類味覺感受機理為基礎研究開發的一種新型現代化分析檢測儀器，通 過傳感器陣列代替生物味覺味蕾細胞感測檢測對象，經系統的模式識別方法得到結果[15]。本研究利用風味酶、活性炭、β-環狀糊精對大米蛋白水解液進行脫苦，采用電子舌技術評價脫苦效果，并用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法評價脫苦前后ACE抑制肽的效果，探討大米蛋白水解物的最佳脫苦工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米蛋白（蛋白含量81%） 江西恒天實業有限公司；堿性蛋白酶（2.4 AU/g）、胰蛋白酶（1 250 USP）、風味酶（3.0 AU/g） 丹麥Novozymes公司；ACE、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-his-leu hydrate，HHL）、馬尿酸（hippuric acid，Hip） 美國Sigma化學公司；活性炭、β-環狀糊精 碧云天生物技術研究所。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TS-5000Z型電子舌 日本Insent公司；1525-2998高效液相色譜儀 美國Waters公司；FA 1104N電子天平上海精密科學儀器有限公司；EMS-8A加熱磁力攪拌器天津市歐諾儀器儀表有限公司；PB-10普及型pH計 德國Sartorius 公司；TGL-205離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司；HD-3紫外檢測器 上海滬西分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 大米蛋白的雙酶水解[16]

具體工藝流程：大米蛋白→酶解（底物質量分數7.5%，堿性蛋白酶加酶量2%（占底物蛋白質量分數，下同）、溫度55 ℃、pH 9.0、酶解時間120 min；胰蛋白酶加酶量2%、溫度37℃、pH 8.0、酶解時間30 min）→滅酶（調節pH 5.0）→離心（4 000 r/min，10 min）→上清液→大米蛋白水解液。

1.3.2 大米蛋白水解物的脫苦

1.3.2.1 風味酶脫苦單因素試驗

風味酶控制肽的苦味脫除，有氨肽酶法和羧肽酶法。氨肽酶作用于N端疏水氨基酸，使其水解變成游離的氨基酸；而羧肽酶作用于肽鏈碳端的疏水氨基酸，使其釋放出來，從而達到脫苦、去苦的目的[17]。風味酶的反應最佳溫度為50 ℃，最佳pH值范圍5.0～7.0，故從加酶量、水解時間和水解pH值3 個方面進行單因素試驗，由于水解后的pH值對苦味有影響，因此將各處理條件下的大米蛋白水解液pH值統一調整到7后再通過電子舌評價分別考察3 個因素對水解液苦味脫除的影響。

1.3.2.2 風味酶脫苦正交試驗

通過電子舌評價所確定的單因素試驗結果，確定3 個因素的取值水平范圍，進行正交試驗確定最佳水解條件組合，正交試驗設計因素水平見表1。

表1 風味酶脫苦正交試驗因素水平表Table 1 Hydrolysis parameters and levels for orthogonal array design

1.3.2.3 活性炭脫苦單因素試驗

活性炭具有豐富的內部孔隙結構和較高的比表面積，是一種優良的吸附材料。其物理、化學性質穩定，耐酸堿，能經受水濕、高溫及高壓，不溶于水和有機溶劑，活性炭對疏水性氨基酸等的吸附，可使苦味消失，活性炭脫苦法是脫除蛋白水解物苦味最早使用的方法[18]。從活性炭用量、料液pH值、料液溫度及處理時間4 個方面進行單因素試驗，由于水解后的pH值對苦味有影響，因此將各處理條件下的大米蛋白水解液的pH值統一調整到7后再通過電子舌評價分別考察4 個因素對水解液苦味脫除的影響。

1.3.2.4 活性炭脫苦正交試驗

考察活性炭用量、料液pH值、料液溫度及處理時間對脫苦效果的影響，選用L9（34）正交試驗來確定最佳脫苦條件，正交試驗設計因素水平見表2。

表2 活性炭脫苦正交試驗因素水平表Table 2 Active carbon treatment parameters and levels for orthogonal array design

1.3.2.5 β-環狀糊精脫苦

分別將質量分數1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的β-環狀糊精添加到一定蛋白質量分數（肽含量50%）的大米蛋白水解液中，置于50℃水浴鍋，每隔10 min取出50 mL，取8 次，取出后通過電子舌評價分別考察β-環狀糊精質量分數和包埋時間對水解液苦味脫除的影響。

1.3.3 苦味的評價方法

將1.3.1節中得到的大米蛋白雙酶水解液作為基準液，其苦味值定義為0，取70 mL脫苦后的大米蛋白水解液倒入電子舌配備的小塑料杯中，每個約35 mL作為平行，放入儀器中進行測試，利用苦味傳感器獲得味覺數據結果，得到其苦味值。電子舌評價得到4 組苦味值，由于第1組值穩定性較差，故選擇后3組苦味值，取其平均值，得到最終的苦味值。

1.3.4 ACE活性抑制的評價[19-20]

采用高效液相色譜法，將HHL溶解在0.05 mol/L pH 8.3的硼酸鹽緩沖液中（含0.3 mol/L氯化鈉），配制成濃度為2.5 mmol/L的HHL溶液。依次加入30 μL的HHL、10 μL不同脫苦條件下的大米蛋白水解液，37 ℃恒溫水浴5 min，然后加入20μL ACE液，恒溫反應1 h后加入70 μL 1 mol/L HCl溶液終止反應，得到供試液。取20 μL供試液進樣，通過HPLC圖譜定量馬尿酸的生成量，以馬尿酸的生成量來計算樣品的ACE活性抑制率，見下式。

式中：S1為馬尿酸標準品峰面積；S2為樣品馬尿酸峰面積。

色譜條件：色譜柱Phenomenex C18（4.6 mm×250 mm），流動相A：水（含0.05%三氟乙酸），流動相B：乙腈（含0.05% TFA）；梯度洗脫條件：0～15 min：B為10%～60%，15～18 min：B為60%～10%；二極管陣列檢測器，檢測波長：228 nm；流速：0.8 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：25 ℃。

1.4 數據處理

數據采用SPSS 17.0統計分析軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 風味酶脫苦苦味評分

2.1.1 單因素試驗結果

由表3可以看出，當加酶量為2.5%時水解液的苦味值最低，故選擇加酶量為2.5%；隨著水解時間的延長，水解液的脫苦效果反而不理想，在水解時間為0.5 h時苦味值較低，故選擇水解時間為0.5 h；水解pH值為6.0時，苦味值最低，故選擇水解pH值為6.0，正交試驗在此基礎上確定因素水平范圍。

表3 風味酶脫苦電子舌評定結果Table 3 Evaluation of the debittering efficiency of flavourzyme by one-factor-at-a-time dessiiggnn

2.1.2 風味酶脫苦電子舌法正交試驗結果

表4 風味酶脫苦電子舌法正交試驗設計與結果Table 4 Orthogonal array design and results for debittering with flavourzyme yme

由表4極差分析可知，采用電子舌評價方法，酶解條件對風味酶法脫苦的影響依次為水解pH值＞水解時間＞加酶量，得到最優方案為加酶量2.5%、水解時間20 min、水解pH 5.8，將此最優方案與正交表中苦味值最低的第1號試驗作對比試驗，在該條件下大米肽的苦味值為－5.1，優于第1號試驗，故風味酶法脫苦的最佳處理條件為加酶量2.5%、水解時間20 min、水解pH 5.8。

2.2 活性炭脫苦的苦味評分

2.2.1 單因素試驗結果

表5 活性炭脫苦電子舌評定結果Table 5 Evaluation of the debittering efficiency of active carbon by one-factor-at-a-time dessiiggnn

由表5可以看出，在活性炭用量2%、處理時間20 min、料液pH 7時苦味值最低；隨著料液溫度的升高，苦味值降低，在65 ℃時，苦味值最低，但如再升高料液溫度，可能會影響大米肽的活性，故選擇料液溫度為65℃，正交試驗在此基礎上確定因素水平范圍。

2.2.2 活性炭脫苦電子舌法正交試驗結果

表6 活性炭脫苦電子舌法正交試驗設計與結果Table 6 Orthogonal array design and results for debittering with activated carrbboonn

由表6極差分析可知，采用電子舌評價方法，反應條件對活性炭脫苦的影響依次為活性炭用量＞料液溫度＞處理時間＞料液pH值，得到最優方案活性炭用量2.0%、料液溫度60℃、處理時間20 min、料液pH 7.0，將此最優方案與正交表中最好的第5號試驗作對比實驗，在該條件下大米肽的苦味值為－5.2，優于第5號試驗，故活性炭脫苦的最佳處理條件為活性炭用量2.0%、料液溫度60℃、處理時間20 min、料液pH 7.0。

2.3 β-環狀糊精脫苦試驗苦味評分

通過電子舌評價分別考察β-環狀糊精質量分數和包埋時間對水解液苦味脫除的影響，其結果見圖1。

圖1 1 β-環狀糊精脫苦實驗電子舌評價Fig.1 Evaluation of the debittering efficiency of β-cyclodextrin by one-factor-at-a-time design

由圖1可以看出，隨著β-環狀糊精添加量的增加，大米肽的苦味值降低，由于電子舌不能辨別出糊口感，其檢測出的各質量分數β-環狀糊精的脫苦效果均有差異，故選擇β-環狀糊精添加量為10%；包埋30 min后，不同質量分數β-環狀糊精的苦味值已基本沒有變化，苦味基本脫除，故選擇包埋時間為30 min。

2.4 不同脫苦方法對大米肽ACE抑制活性的影響

2.4.1 風味酶法脫苦對大米肽ACE抑制率的影響

通過測定大米蛋白雙酶水解液及經風味酶法脫苦處理的典型試樣1、4、8號ACE抑制率，考察該脫苦工藝對大米蛋白水解物ACE抑制活性的影響，其結果見圖2。

圖2 電子舌評價典型試樣ACE抑制率Fig.2 ACE inhibitory activity of rice protein hydrolyzates debittered with flavourzyme

由圖2可知，經風味酶脫苦后的3 個典型試樣相對于未脫苦的大米蛋白水解液其ACE抑制率僅試樣1有顯著降低，試樣4和試樣8沒有顯著變化，且電子舌評價典型試樣4的ACE抑制率相對最高。

2.4.2 活性炭脫苦對大米肽ACE抑制活性的影響

通過測定大米蛋白雙酶水解液及經活性炭脫苦處理典型試樣2、5、6號的ACE抑制率，考察該脫苦工藝對大米蛋白水解物ACE抑制活性的影響，其結果見圖3。

圖3 電子舌評價典型試樣ACE抑制率Fig.3 ACE inhibitory activity of rice protein hydrolyzates debittered with active carbon

由圖3可知，經活性炭脫苦后的大米蛋白水解液的ACE抑制率與未經脫苦的大米蛋白雙酶水解物相比都有很大程度的下降，經統計學分析其ACE抑制率相對原液均有顯著下降。活性炭對疏水性氨基酸等的吸附，使苦味的消失常伴隨著營養價值的下降[21]。

3 討 論

本研究利用風味酶、活性炭、β-環狀糊精對大米蛋白水解液進行脫苦，采用電子舌技術評價脫苦效果，并用HPLC法評價脫苦前后的水解物對ACE的抑制活性，探討大米蛋白水解物的最佳脫苦工藝。結果表明，風味酶法脫苦的最佳處理條件為加酶量2.5%、水解時間20 min、水解pH 5.8；活性炭脫苦的最佳處理條件為活性炭用量2.0%、料液溫度60 ℃、處理時間20 min、料液pH 7.0；β-環狀糊精脫苦的最佳處理條件為β-環狀糊精添加量10%、包埋時間30 min。

ACE能夠調節血壓，在預防高血壓中，ACE活性的抑制率是一個重要的指標[22]。風味酶法脫苦的幾個典型試樣的ACE抑制率相比未脫苦的大米蛋白水解液略有降低；而活性炭脫苦法雖有很好的脫苦效果，但其幾個典型試樣的ACE抑制率相比未脫苦的大米蛋白水解液有顯著降低；這主要是由于活性炭是表面吸附劑，對苦味肽吸附的同時也吸附了其他的肽氨基酸等[23]；由于β-環狀糊精將肽包合，無法測定其對ACE抑制活性的影響，理論上說該法不會造成氮損失，在消化過程中被包合的肽可釋放出來[24-25]。這3 種方法都有較好的脫苦效果，但β-環狀糊精脫苦法無法測定其對ACE抑制活性的影響，若從考慮原料的利用率來說，可選擇活性炭脫苦法，因為活性炭可以回收再利用，且活性炭脫苦操作比較簡單；若從營養與安全的角度考慮，可選擇風味酶法脫苦，因為其脫苦效果好且ACE抑制率基本沒有顯著變化[26-27]。

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Using Electronic Tongue to Evaluate the Effect of ACE Inhibitory Peptide Enrichment on Debittering Rice Protein Hydrolyzate

HU Qin-ling, ZHENG Liang-qing, WANG Shen, YI Qing, WU Yong-ning, GONG Zhi-yong*
(Hubei Collaborative Innovation Center for Processing of Agricultural Products, College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

This work was executed to explore the best debittering process for rice protein hydrolysate by separately using fl avourzyme, active carbon and β-cyclodextrin. The debittering effi ciency was measured by means of electronic tongue (ET) and the angiotensin Ⅰ-converting enzyme (ACE) inhibitory activity of rice protein hydrolysate before and after debittering was evaluated by high performance liquid chromatography (HPLC). Results showed that the optimal debittering conditions were hydrolysis at an initial pH of 5.8 for 20 min with 2.5% of fl avourzyme, treatment at 60 ℃ for 20 min with 2.0% of active carbon or embedding for 30 min with 10% of β-cyclodextrin.

ACE inhibitory peptides; debittering; electronic tongue; fl avourzyme; active carbon; β-cyclodextrin

TS252.4

A

1002-6630（2014）24-0024-05

10.7506/spkx1002-6630-201424005

2014-06-22

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2010AA023003）；武漢輕工大學校研究生創新基金資助項目（2013cx018）

胡勤玲（1987—），女，碩士研究生，研究方向為食品營養與安全。E-mail：huqinling1029@163.com

*通信作者：宮智勇（1966—），男，教授，博士，研究方向為食品營養與安全。E-mail：gongzycn@163.com