苜蓿冰結構蛋白的提取及對冷凍面團的影響

曲 敏，董正婷，陳鳳蓮，劉羽佳，李凌俐，孫兆國，鮑 歡

（哈爾濱商業大學 食品科學與工程省級重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

苜蓿冰結構蛋白的提取及對冷凍面團的影響

曲 敏，董正婷，陳鳳蓮，劉羽佳，李凌俐，孫兆國，鮑 歡

（哈爾濱商業大學 食品科學與工程省級重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076）

以“肇東”紫花苜蓿干草為原料。利用磷酸鹽緩沖溶液法提取苜蓿蛋白，通過單因素和響應曲面試驗，得到提取苜蓿蛋白的最佳工藝條件為料液比1∶20、磷酸鹽緩沖溶液濃度63 mmol/L、p H 7.7、草粉粉碎粒度80 目、攪拌時間2 h。在此條件下苜蓿蛋白的提取率為37.77%。經硫酸銨沉淀，透析脫鹽，冷凍干燥后復溶，對其溶液進行冰晶形態觀察，可以看出苜蓿蛋白的冰晶體積小、數量多、形態多樣，說明其抑制冰晶生長及對冰晶的形態修飾效果顯著，具有很好的抗凍活性，為冰結構蛋白。將其應用于冷凍面團后，冷凍面團的硬度明顯降低，彈 性、回復性和內聚性稍增強，咀嚼性有所降低，質地細膩柔軟。

苜蓿；冰結構蛋白；冰晶；冷凍面團

冰結構蛋白（ice structuring proteins，ISPs），又稱為抗凍蛋白、不凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs），或熱滯蛋白（thermal hysteresis proteins，THPs）[1-2]。近年來，國內外趨向統稱為冰結構蛋白，是一類保護生物體抵御外界寒冷環境而產生的多肽，具有一定的熱滯活性，能夠控制冰晶生長、修飾冰晶形態，并抑制冰晶重結晶[3-4]。ISPs先后在冷水魚類、昆蟲、植物、細菌和真菌[5-7]中發現，植物ISPs發現的最晚[8]。嚴寒環境中的生物體體內產生的冰晶會損傷細胞，導致細胞破裂、直至生物體死亡。ISPs是生物體應激性抵御凍害的重要生存策略之一。植物ISPs熱滯值較低（0.2～0.6 ℃）[9-11]，但其修飾冰晶形態、抑制冰晶重結晶的作用顯著，與魚類、昆蟲的ISPs明顯不同。ISPs對冰晶形態的修飾作用,已經成為檢驗蛋白質是否具有抗凍活性的一項重要指標[12-13]。ISPs的作用不同于常見的鹽、蔗糖等離子抗凍劑。作為一類新型食品添加劑，ISPs及其在食品行業中的應用受到研究者的廣泛關注，但有關ISPs的來源、制備及其在冷凍食品中應用等方面的相關研究較少。由于ISPs價格昂貴，因此，開發食品源的、價格低廉、安全的冰結構蛋白日益成為研究的熱點與方向。夏露等[14]將2.5%的冬小麥麩皮ISPs添加到速凍湯圓中，湯圓的品質得到明顯改善。李玲玲等[15]研究了冬小麥ISPs對濕面筋蛋白凍藏穩定性的影響，通過觀察濕面筋中可凍結水含量、流變學特性及超微結構發生變化，得到冬小麥ISPs通過抑制冰晶的形成和重結晶，減小凍藏過程中濕面筋蛋白的網絡遭受破壞。潘振興等[16]研究了ISPs對長期凍藏冷凍面團抗凍發酵特性與超微結構的影響，發現添加0.5% ISPs的冷凍面團，經過凍藏105d后，仍存在明顯的面筋網絡結構。

綠色植物是最大的廉價蛋白資源，富含植物蛋白、資源豐富、成本低廉的植物品種主要集中在豆科牧草和禾本科牧草[17]。苜蓿（Medicago sativa L.），俗稱金花菜，屬豆科多年生牧草，經極端低溫后的返青率達到90%以上。是世界上分布最廣、栽培歷史最古老的優良牧草，被稱為“牧草之王”[18]。我國的種植面積約133萬hm2，居世界第五位。苜蓿富含蛋白質、脂肪、多種礦物質元素、多種維生素以及適合生長發育的必需氨基酸，營養價值高，是對人體健康營養最全面的草本植物之一[19]。用于食品可以改進人們的膳食營養成分，應用前景非常廣闊[20]。本研究通過提取苜蓿ISPs，觀察其冰晶形態，并添加到冷凍面團中，檢測其物性指標變化，旨在研究苜蓿ISPs的抗凍活性及對冷凍面團的質地及物性的影響，為拓寬植物ISPs資源及其應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“肇東”紫花苜蓿由黑龍江省農業科學院草業研究所苜蓿實驗基地提供。

考馬斯亮藍G250 美國Sigma公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸銨、氯化鈉（均為分析純） 天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

多功能粉碎機 永康市帥通工具有限公司；UV-5100B紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；FDU-1200型冷凍干燥機 日本東京理化；Z366高速大容量臺式離心機 德國哈默公司；DM750生物顯微鏡瑞士萊卡顯微系統有限公司；TA-XT2i型質構儀 英國SMS公司。

1.3 方法

1.3.1 預處理及苜蓿干草蛋白含量的測定

選用“肇東”紫花苜蓿干草，取嫩莖葉，經粉碎、過篩后，草粉備用。采用KDY-9820半自動凱氏定氮儀進行測定，測定苜蓿干草的粗蛋白含量。

1.3.2 蛋白含量及提取率的測定

采用考馬斯亮藍比色法。分別精密吸取標準蛋白質溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于具塞試管中，各管加水至1 mL，加入考馬斯亮藍G250溶液5 mL，充分混勻，靜置5 min，于595 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。

蛋白含量測定：準確量取提取液1 mL，按上述標準曲線的測定方法，分別測定其吸光度，計算樣品中蛋白質的含量，并按下式計算苜蓿蛋白提取率。

苜蓿蛋白提取率/%=m1/m2×100

式中：m1為提取蛋白量，即上清液中的蛋白含量；m2為總蛋白量，即原料蛋白含量。

1.3.3 苜蓿蛋白提取的單因素試驗

稱取一定量的苜蓿草粉按設定的料液比與磷酸緩沖液混合，覆蓋保鮮膜防止氧化。在磁力攪拌器上攪拌，以320 目濾布過濾，棄去草渣。

1.3.3.1 草粉粉碎粒度對苜蓿蛋白提取率的影響

分別將過篩目數為40、60、80、100、120 目的草粉，以料液比1∶20浸泡于10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液，pH8.0，攪拌4 h，8 000 r/min離心15 min，測定上清液蛋白含量，計算苜蓿蛋白提取率。

1.3.3.2 攪拌時間對苜蓿蛋白提取率的影響

草粉過篩目數80 目、磷酸鹽緩沖溶液濃度10 mmol/L、料液比1∶20、溶液pH 8.0，分別攪拌1、2、3、4、5 h，8 000 r/min離心15 min，測定上清液蛋白含量，計算苜蓿蛋白提取率。

1.3.3.3 磷酸鹽緩沖液pH值對苜蓿蛋白提取率的影響

草粉過篩目數80 目、磷酸鹽緩沖溶液濃度10 mmol/L、料液比1∶20，溶液pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，攪拌2 h，8 000 r/min離心15 min，測定上清液蛋白含量，計算苜蓿蛋白提取率。

1.3.3.4 料液比對苜蓿蛋白提取率的影響

草粉過篩目數80 目、磷酸鹽緩沖溶液濃度10 mmol/L、溶液pH 8.0，料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，攪拌2 h，8 000 r/min離心15 min，測定上清液蛋白含量，計算苜蓿蛋白提取率。

1.3.3.5 磷酸鹽緩沖溶液濃度對苜蓿蛋白提取率的影響

草粉過篩目數80 目、溶液pH 8.0、料液比1∶20，磷酸鹽緩沖溶液濃度分別為10、20、30、40、50、60、70、80 mmol/L，攪拌2 h，8 000 r/min離心15 min，測定上清液蛋白含量，計算苜蓿蛋白提取率。

1.3.4 響應面法確定最優工藝條件

根據Box-Behnken設計原理，以蛋白質提取率為響應值，在單因素試驗結果的基礎上，綜合考慮選擇磷酸鹽緩沖溶液濃度、料液比、pH值3 個因素進行響應面試驗設計，見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Process variables and levels in the three-variable and threelevel response surface design for protein extraction

1.3.5 苜蓿蛋白溶液的冰晶觀察

將苜蓿蛋白上清液濃縮后，以硫酸銨飽和度為80%沉淀。透析脫鹽，將苜蓿蛋白提取物冷凍干燥。

分別取30 μL的蒸餾水、2%的苜蓿蛋白溶液、2%的氯化鈉溶液冷凍30 min，置于顯微鏡觀察，觀察各溶液的冰晶大小及形態。

1.3.6 苜蓿ISPs在冷凍面團中的應用

用高筋粉制作面團，等比例水和面，分別制作3 個空白面團，3 個添加1%苜蓿ISPs粗品面團。冷凍48 h以上，進行物性檢測，3 次平行實驗。采用質構儀對冷凍面團進行質構分析，測定方式：T.P.A；探頭：P/50；測試前速率：2.00 mm/s；測試中速率：1.00 mm/s；測試后速率：1.00 mm/s；壓縮程度：50%；力度：100 g；停留間隔：5 s；數據采集速率：200 pps。從質構特性參數當中選取硬度、內聚性、回復性、彈性和咀嚼性指標進行評價。

2 結果與分析

2.1 苜蓿干草的水分及粗蛋白含量

經檢測，苜蓿干草的粗蛋白含量為20.85%，水分含量為1.3%。

2.2 牛血清蛋白標準曲線的繪制

得到標準曲線的回歸方程為y=0.006 3x+0.005 1，R2=0.998 1，標準曲線的相關性良好。根據提取的上清液的吸光度，對應牛血清標準曲線，可以計算出提取液中的蛋白含量，進一步可計算出蛋白的提取率。

2.3 苜蓿蛋白的提取單因素試驗結果

2.3.1 草粉粉碎粒度對苜蓿蛋白提取率的影響

圖1 草粉粉碎粒度對苜蓿蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of raw material particle size on protein extraction

由圖1可以看出，苜蓿蛋白提取率在原料粉碎粒度40～80 目之間上升迅速，在80 目時提取率達到16.91%，而100 目后增加幅度較小。因此，選取80 目過篩。

2.3.2 攪拌時間對苜蓿蛋白提取率的影響

圖2 攪拌時間對苜蓿蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of stirring time on protein extraction

由圖2可知，在攪拌時間2 h內，苜蓿中蛋白提取量隨時間延長呈遞增的趨勢，2 h時提取量最大，提取率達到17.01%，2 h后趨于平衡。這個過程可能是浸提時間延長，蛋白的溶出增加，一定時間后，蛋白的溶出達到飽和，則溶出率趨于平衡。因此，攪拌時間選擇2 h。

2.3.3 磷酸鹽緩沖液的pH值對苜蓿蛋白提取率的影響

圖3 pH值對苜蓿蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of pH on protein extraction

由圖3可知，在pH 6.0～8.0的條件下苜蓿蛋白提取率上升趨勢明顯，提取率由11.48%增至17.10%。當溶液pH值高于8.0提取率呈下降趨勢，因此，可確定磷酸鹽緩沖溶液的pH值為8.0。

圖4 料液比對苜蓿蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of solid/solvent ratio on protein extraction

2.3.4 料液比對苜蓿蛋白提取率的影響由圖4可知，苜蓿蛋白提取率在料液比1∶5～1∶20之間上升迅速，由12.07%增加至19.86%，之后緩慢增加，可當料液比小于1∶20提取率變化不大。從提取成本考慮，料液比為1∶20時為最宜。

圖5 磷酸鹽緩沖溶液濃度對苜蓿蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of buffer concentration on protein extraction

2.3.5 磷酸鹽緩沖溶液濃度對苜蓿蛋白提取率的影響由圖5可知，苜蓿蛋白提取率隨著磷酸鹽緩沖溶液濃度的增高而逐漸增多，在濃度為30～60 mmol/L時，提取率增長明顯，由20.28%增至37.43%。之后，提取率明顯下降。故最佳磷酸鹽緩沖液適宜濃度為60 mmol/L。

2.4 最佳提取工藝條件的確定

表2 響應面試驗分析方案及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

通過單因素方差分析，得到因素對苜蓿蛋白提取率的影響程度大小順序為：磷酸鹽緩沖溶液濃度＞料液比＞pH值＞草粉粉碎粒度＞提取時間，故最佳提取工藝條件優化時，選擇影響程度最大的3 個因素。根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，選擇磷酸鹽緩沖溶液濃度、料液比、pH值3 個因素，采用三因素三水平的響應分析方法求取優化的工藝參數，試驗設計和結果見表2、3。試驗次數為17 次，其中析因部分試驗次數為12，中心點重復試驗次數為5。利用 Design Expert 軟件對表2的試驗結果進行二次多元回歸擬合，并進行方差分析，結果見表3。對響應值與各因素進行回歸擬合后，得到的苜蓿蛋白質提取率（Y）對編碼自變量的回歸模型（去掉不顯著項）表達式。

Y=36.31+2.44A－2.05B+3.07C+1.27AC－5.99A2－1.24B2－0.95C2

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the established regression model

從表3可知，此模型顯著（P＜0.05），A、B、C、AC、A2、B2對苜蓿蛋白提取率有顯著影響。模型失擬項（P = 0.064 6，不顯著），說明該回歸模型對試驗結果擬合較好，回歸方程整體模型比較顯著，并且失擬項不顯著，表明該回歸模型與實測值能較好地擬合。因此可利用該回歸模型對試驗結果進行分析，并確定苜蓿蛋白質的最優提取工藝。

各因素的F值可以反映出各因素對試驗指標的重要性，F值越大，表明對試驗指標的影響越大。從方差分析結果可知：F（A）=55.03，F（B）=38.99，F（C）= 87.33，即各因素對苜蓿蛋白提取率的影響程度大小順序為：料液比＞磷酸鹽緩沖溶液濃度＞pH值。

圖6 pH值與磷酸鹽緩沖溶液濃度的交互效應對蛋白提取率的影響Fig.6 Response surface plot showing the effect of pH and buffer concentration on the yield of protein

為了考察交互項對苜蓿蛋白提取率的影響，在其他因素條件固定不變的情況下，考察交互項對蛋白提取率的影響，對模型進行降維分析。經Design Expert 7.0軟件分析，所得的響應面見圖6。隨著每個因素的增大，響應值增大；當響應值增大到極值后，隨著因素的增大，響應值逐漸減小或不再增大。在交互項對蛋白提取率的影響中，磷酸鹽緩沖溶液濃度和pH值交互作用對提取率的影響最小，其次是pH值和料液比交互作用，影響最大的是磷酸鹽緩沖溶液濃度和料液比交互作用。

圖7 料液比與磷酸鹽緩沖溶液濃度的交互效應對蛋白提取率的影響Fig.7 Response surface plot showing the effect of solid to solvent ratio and buffer concentration on the yield of protein

圖8 pH值與料液比的交互效應對蛋白提取率的影響Fig.8 Response surface plot showing the effect of pH and solid to solvent ratio on the yield of protein

通過軟件分析，得到最優提取條件為料液比1∶25、磷酸鹽緩沖溶液濃度63.44 mmol/L、pH 7.69，得到蛋白提取率為39.48%。根據實際操作要求，考慮到實驗后續的濃縮，選取最佳工藝條件為料液比1∶20、磷酸鹽緩沖溶液濃度63 mmol/L、pH 7.7，經過3 組平行實驗，得到苜蓿蛋白的提取率為37.77%，稍低于試驗設計值，但接近于最優提取條件的預測值，所以試驗值與預測值相符合。

2.5 苜蓿蛋白凍干粉的蛋白含量

苜蓿蛋白提取物冷凍干燥后，測得凍干粉的蛋白含量為71.2%。

2.6 苜蓿蛋白溶液冰晶觀察

從圖9可看出，水的冰晶形態是較大的圓泡；2% NaCl溶液的冰晶體積較小，數量較多，但形態較為單一。而2%苜蓿蛋白溶液的冰晶體積大小與NaCl溶液相仿，形態小、數量多。但冰晶形態豐富，且均勻，有小圓形與梭形、四邊形、五邊形、六邊形、短棒形和異形。可見，苜蓿蛋白對冰晶生長的抑制及對冰晶的形態修飾作用顯著，說明苜蓿蛋白具有很好的抗凍活性，為ISPs。

圖9 冰晶修飾形態（×4400）Fig.9 Modified ice crystal morphology (×40)

2.7 添加苜蓿ISPs的冷凍面團質構特性的變化

Wang等[21]觀察加有ISPs的冰淇淋樣品冰晶細小且均勻，而未加ISPs的冰淇淋樣品冰晶大且不均勻。因此，冷凍食品中晶體的大小、分布、位置以及形態均與與其最終質量密切相關[22]。從質構特性參數當中選取硬度、內聚性、回復性、彈性和咀嚼性等指標，是衡量ISPs對面團冷凍效果有影響的重要指標[23]。從圖10及表4可知，添加了苜蓿ISPs的冷凍面團物性有明顯的變化。首先冷凍面團的硬度明顯降低，從這點可以看出抗凍蛋白可以修飾冰晶，使冰晶形態更小，分布得更均勻，從而形成了質地細膩且柔軟的冷凍面團。其次，回復性、內聚性和彈性略增強，咀嚼性有所降低。其中未添加苜蓿ISPs的冷凍面團和添加苜蓿ISPs的冷凍面團的硬度、內聚性、彈性和咀嚼性均存在顯著差異。

圖10 對照（A）和添加苜蓿IISSPPss（B）的冷凍面團質構圖Fig.10 Texture analysis of control and frozen dough with added alfalfa ice structural protein

表4 冷面團質構特性的測定Table 4 Texture properties of frozen dough

3 結 論

本研究利用磷酸緩沖溶液法提取苜蓿蛋白，通過單因素和響應面試驗，得到提取苜蓿蛋白的最佳工藝條件為料液比1∶20、磷酸鹽緩沖溶液濃度63 mmol/L、pH 7.7、草粉粉碎粒度80 目、攪拌時間2 h。在此條件下苜蓿蛋白的提取率為37.77%。

苜蓿蛋白溶液進行冰晶形態觀察，并以水和NaCl溶液為對照，可以看出苜蓿蛋白溶液的體積小、冰晶數量多、形態多樣，說明苜蓿蛋白抑制冰晶生長及對冰晶的形態修飾效果顯著，具有很好的抗凍活性，為ISPs。

將苜蓿ISPs應用于冷凍面團后，檢測其質構特性可以看出，冷凍面團的硬度明顯降低，回復性、內聚性和彈性略增強，咀嚼性有所降低。說明添加ISPs的冷凍面團質地發生變化，細膩柔軟。

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Extraction of Alfalfa Ice Structuring Proteins and Their Effect on Frozen Dough

QU Min, DONG Zheng-ting, CHEN Feng-lian, LIU Yu-jia, LI Ling-li, SUN Zhao-guo, BAO Huan
(Key Laboratory of Food Science and Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

In the present study, proteins were extracted from the young stems with leaves of Zhaodong alfalfa with phosphate buffer solution. Furthermore, the optimal extraction conditions for alfalfa proteins were determined by singlefactor experiment and response surface methodology. The results revealed that when the extraction was carried out by 2 h stirring of the 80-mesh raw material powder suspended in 63 mmol/L phosphate buffer solution at pH 7.7 with a solid/liquid ratio of 1:20, the yield of alfalfa proteins was 37.77%. The observed ice crystal morphology suggested that the ice crystals of the purified alfalfa proteins were small in size, increased in number and varied morphologically, indicating that the alfalfa proteins are able to significantly inhibit the growth and modify the conformations of ice crystals. These results demonstrate that the alfalfa proteins, which possess excellent antifreeze activity, are ice structuring proteins. In addition, we characterized the functional role of these alfalfa proteins in practical application by application in frozen dough. The results of texture properties demonstrated that the frozen dough mix had a soft and delicate texture, and increased elasticity, resilience and cohesion, but reduced chewiness.

alfalfa; ice structuring protein; ice crystal; frozen dough

TS201.1

A

1002-6630（2014）24-0057-06

10.7506/spkx1002-6630-201424011

2014-06-30

黑龍江省自然科學基金項目（C2011-24）；黑龍江省教育廳科學技術研究項目（12511128）；黑龍江省博士后科研啟動基金項目（LBH-Q13098）

曲敏（1966—），女，教授，博士，主要從事新型植物蛋白及食品添加劑研究。E-mail：qumin777@126.com