反相高效液相色譜-大氣壓化學電離質譜分析豬脂甘油酯及調控氧化豬脂中極性非（難）揮發性物質

張 玲，都榮強，謝建春*，曹長春，王 蒙，鄭福平，孫寶國

（北京工商大學 北京市食品風味化學重點實驗室，食品添加劑與配料北京市高校工程研究中心，北京 100048）

反相高效液相色譜-大氣壓化學電離質譜分析豬脂甘油酯及調控氧化豬脂中極性非（難）揮發性物質

張 玲，都榮強，謝建春*，曹長春，王 蒙，鄭福平，孫寶國

（北京工商大學 北京市食品風味化學重點實驗室，食品添加劑與配料北京市高校工程研究中心，北京 100048）

采用固相萃取-反相高效液相色譜-大氣壓化學電離質譜分析豬脂的甘油酯組成以及調控 氧化工藝制備的氧化豬脂的極性非（難）揮 發性物質組成。從豬脂中鑒定出33 種甘油酯，包括7 種甘二酯和26 種甘三酯，按總離子流色譜圖中的相對峰面積，含量高的為1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘三酯（16.13%）、1,3-二油酸-2-亞油酸甘三酯（15.25%）、1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘三酯（12.96%）、1-油酸-2,3-二亞油酸甘三酯（8.05%）。從調控氧化豬脂中鑒定出5 種甘二酯和由10 種甘三酯氧化形成的22 種單氫過氧化物，按總離子流色譜圖中的相對峰面積，含量高的為1-硬脂酸-2-亞油酸-3-油酸甘三酯單氫過氧化物（18.44%）、1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘三酯單氫過氧化物（16.03%）、1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘三酯單氫過氧化物（9.42%）、1,3-二油酸-2-亞油酸甘三酯單氫過氧化物（8.71%）、三油酸甘三酯單氫過氧化物（7.63%）、1-棕櫚酸-2,3-二亞油酸甘三酯單氫過氧化物（7.53%）。結果表明，豬脂調控氧化主要對豬脂中含不飽和脂肪酸的甘三酯進行氧化，因形成的極性非（難）揮發性氧化產物僅檢測到甘三酯單氫過氧化物。

豬脂；反相高效液相色譜；大氣壓化學電離質譜；脂肪調控氧化；甘油酯；單氫過氧化物

脂肪在肉香味形成中具有重要作用，動物肉的特征香味主要由其所含脂肪氧化降解產生。脂肪降解產生的短鏈脂肪醛、酮等羰基化合物尤為重要，它們本身既有肉香氣味，還可在熱反應中參與美拉德反應，與蛋白質、氨基酸、糖作用，生成新的含氮、含硫雜環化合物，從而使熱反應產物趨近理想的肉香味[1-5]。熱反應肉味香精以肉香味形成理論為基礎制備，廣泛用于方便面料包、火腿腸、膨化食品等的調味。脂肪調控氧化為在一定溫度和通空氣流速下的脂肪熱氧化工藝過程，其目的是獲得富含肉香前體物的脂肪氧化產物，作為原料制備熱反應肉味香精。采用“脂肪調控氧化-熱反應”兩步法制備的肉味香精具有肉香濃郁、和諧、不同種類動物肉的特征香味突出的優點[6-8]。

脂肪調控氧化除產生一定量小分子揮發性成分外，主要產生大量的極性非（難）揮發性肉香前體物質。這些肉香前體物質在熱反應中，一方面釋放短鏈脂肪醛、酮等羰基化合物，另一方面與氨基酸、多肽、蛋白質作用，對熱反應產物的顏色、抗氧化性和滋味產生影響[9-10]。動物脂肪是多種甘油酯組成的混合物，脂肪氧化產生的非（難）揮發性物質組成極其復雜。油脂的甘油酯組成可采用高溫氣相色譜[11]、高效液相色譜[12]、薄層色譜[13]、超臨界流體色譜[14]等進行，反相高效液相色譜（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）-大氣壓化學電離質譜（atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry，APCI-MS）[15-17]因可實現常溫和低溫條件下各種甘油酯的有效分離并聯機完成結構鑒定，受到人們的青睞。但有關對脂肪氧化產生的非（難）揮發性物質的研究迄今報道很少，僅有文獻[18-20]利用RP-HPLC-APCI-MS分析三油酸甘油酯、三亞油酸甘油酯、三亞麻酸甘油酯的自動氧化產物及加熱條件下的氧化產物，但這些報道均限于對一種甘油酯的氧化產物的分析研究。

調控氧化所用動物脂肪一般為豬脂、雞脂或牛脂，分別用于制備豬肉味、雞肉味、牛肉味等中餐常用的肉味香精。本課題組先前采用RP-HPLC-APCI-MS對雞脂甘油酯[17]及調控氧化雞脂中的極性非（難）揮發性化學物質[21-22]進行了研究，表明雞脂甘三酯調控氧化，主要生成單氫過氧化物[22]，而雙氫過氧化物和環氧化物很少。不同種動物脂肪的甘油酯組成不同，按照含量高低順序構成豬脂甘油酯的脂肪酸主要為油酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸，構成雞脂甘油酯的脂肪酸主要為油酸、棕櫚酸、亞油酸、硬脂酸[23-24]。本實驗在先前對雞脂及調控氧化雞脂的認知基礎上，采用RP-HPLC-APCI-MS分析豬脂甘油酯組成及豬脂調控氧化產物中的極性非（難）揮發性物質。研究結果對于進一步研究脂肪調控氧化機理及其對熱反應肉味香精制備產生影響的機理具有一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

精煉豬脂 安徽牧羊油脂有限公司；甲醇、乙腈、二氯甲烷（均為色譜純） 北京迪馬科技公司；冰醋酸、95%乙醇、乙醚、三氯甲烷、碘化鉀、硫代硫酸鈉、可溶性淀粉、酚酞、氫氧化鉀（均為化學純） 國藥集團化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

LCQ Deca XP Max液相色譜-離子阱質譜聯用儀（大氣壓化學電離源） 美國Thermo Fisher科技有限公司；ProElut C18固相萃取柱（規格500 mg 3 mL） 北京迪馬科技有限公司；RE-52A旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；DF2101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省予華儀器有限公司；D-8403電動攪拌器 天津市華興科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 豬脂氧化

在裝有電動攪拌器、水銀溫度計和回流冷凝管的2 000 mL五口燒瓶中加入500 g豬脂，加熱使其熔化，當溫度上升到130 ℃時，開始通空氣（流量1.5 L/min）并攪拌（450 r/min）計時，反應4 h，得到氧化豬脂（過氧化值210 mmol O2/kg、酸值2.45 mg KOH/kg，以脂肪計）。

1.3.2 固相萃取

取一定量的氧化豬脂先抽真空除去揮發性成分，再進行手動固相萃取處理。5 mL甲醇活化，5 mL乙腈平衡，35 mg樣品用1 mL乙腈-二氯甲烷（50∶50，V/V）溶解后上樣，收集流出液，再用1 mL乙腈淋洗兩次，收集淋洗液，按上述方法平行處理5 份樣品，合并5 份平行樣的流出液和淋洗液，旋轉蒸發濃縮，得38 mg。

1.3.3 RP-HPLC-APCI-MS分析條件

色譜柱Dikma C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫25 ℃，流動相：二氯甲烷（A）-乙腈（B），流速1 mL/min。

豬脂分析：40 mg豬脂溶解于1 mL乙腈-二氯甲烷（40∶60，V/V）中，0.45 μm膜過濾，進樣10 ?L，洗脫程序：0～40 min，65%～50% A；40～45 min，50% A；45～50 min，50%～30% A。

氧化豬脂分析：將固相萃取處理后得到的38 mg樣品，加入0.4 mL乙腈-二氯甲烷（50∶50，V/V）溶解，進樣1 ?L，洗脫程序：0～5 min，15% A；5～10 min，15%～25% A；10～35 min，25%～30% A；35～50 min，30%～50% A；50～60 min，50% A。

質譜條件：正離子模式，毛細管溫度250 ℃，APCI蒸發溫度400 ℃，電暈針電流5 μA。質量掃描范圍300～1 200 u，鞘氣（氮氣）壓力75 arb，輔助氣（氦氣）壓力20 arb。掃描時間1 s，全掃描模式，掃描峰寬0.17 u，二級碰撞能量為30%。

2 結果與分析

2.1 RP-HPLC-APCI-MS分析總離子流色譜圖及其解析方法

豬脂及氧化豬脂固相萃取物的RP-HPLC-APCI-MS分析總離子流色譜圖見圖1。RP-HPLC-APCI-MS分析屬于二維定性，脂肪及氧化脂肪樣品的化學組成及結構，可依據APCIMS信息及化合物出峰順序進行鑒定。表1為正離子模式APCI質譜中，用于推斷脂肪酸甘油酯及其一些氧化產物結構的常見離子峰[15-20]：包括準分子離子[M+H]+和一定量的碎片離子。由于甘油三酯不同位置脂肪酸在質譜中斷裂所需能量不同，從甘油骨架Sn-2位上斷裂一個脂肪酸后形成的1,3-二酰基甘油離子的豐度要比從Sn-1/3位上斷裂一個脂肪酸后形成的1,2-二酰基甘油離子或2,3-二酰基甘油離子的豐度低，根據甘油三酯在APCI-MS中形成二酰基甘油離子豐度的高低，可判斷脂肪酸在甘油骨架上的位置分布[25]。

在RP-HPLC圖中，脂肪酸甘油酯及其氧化產物出峰順序符合等價碳原子數（equivalent number of carbon atoms，ECN）原則，即：按照ECN從小到大的順序洗脫出來[20]。ECN相同時，以雙鍵數較高的化合物先流出，雙鍵數較少的后流出。對于甘油酯，ECN=甘油酯脂肪酰基碳數之和－2×雙鍵數；對于甘油酯氫過氧化物，ECN=甘油酯中脂肪酰基碳數之和－2×雙鍵數-結合的氫過氧化物數。

此外，離子阱檢測器是靈敏度很高的質量分析器，具有阱內離子碰撞誘導解離功能。在一次數據采集中，可同時獲得一級質譜及多級質譜信息[21]。當一級質譜中某離子峰沒有出現或豐度很低時，可選擇某個豐度較高離子為母離子，通過碰撞誘導解離使形成二級碎片離子，獲得離子關聯性信息進行推斷。在初步推斷基礎上，還可通過 選擇化合物的特征離子峰簇，構建提取離子色譜流圖，對推斷結果進行確認。

2.2 豬脂的RP-HPLC-APCI-MS分析鑒定結果

動物脂肪主要由甘油三酯及少量的甘油二酯組成。按照2.1節方法，對總離子流色譜圖中的色譜峰進行化合物結構鑒定，所得結果見表2。

圖2列舉了表2中部分化合物的質譜圖，其中圖2a、b為二油酸甘二酯的一級質譜和二級質譜（色譜峰保留時間9.51min），推斷過程：由一級質譜m/z 621.23（[M+H]+）知相對分子質量為620，以m/z 603.50（[M+ H－H2O]+）為母離子，進行二級碰撞得m/z 321.15（[M+ H－H2O－油酸]+）（圖2b），再結合相對分子質量為620進行計算，得出此化合物為二油酸甘二酯。圖2c（色譜峰保留時間21.74min）為1-棕櫚酸-2,3-二亞油酸甘三酯的一級質譜，推斷過程：由m/z 855.70為[M+H]+知相對分子質量為854，再根據碎片離子m/z 599.56（[M+ H－棕櫚酸]+）和m/z 575.56（[M+H－亞油酸]+），推斷為棕櫚酸二亞油酸甘三酯；根據m/z 575.56（[M+H－亞油酸]+）豐度低于m/z 599.56（[M+H－棕櫚酸]+），判斷出1個亞油酸位于Sn-2位，故此化合物為1-棕櫚酸-2,3-二亞油酸甘三酯。圖2d（色譜峰保留時間26.01min）為1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘三酯的一級質譜，推斷過程：由m/z 857.62（[M+H]+）知相對分子質量為856，再根據碎片離子m/z 601.52（[M+H－棕櫚酸]+）、m/z 575.67（[M+H－油酸]+）和m/z 577.60（[M+H－亞油酸]+），推斷為棕櫚酸亞油酸油酸甘三酯；根據m/z 577.60（[M+ H－亞油酸]+）豐度最低，判斷出亞油酸位于Sn-2位，此化合物為1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘三酯。

表2 豬脂的RP-HPLC-APCI-MS分析結果Table 2 Analytical results obtained for lard by reverse phase high performance liquid chromatography and atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry

圖2 豬脂RP-HPLC-APCI-MS檢測到的部分化合物的質譜圖Fig.2 Mass spectra of some glycerides in lard analyzed by reverse phase high performance liquid chromatography and atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry

由表2可見，從豬脂中共鑒定出33種甘油酯，包括7種甘二酯和26種甘三酯。按總離子流色譜圖中的相對峰面積，含量高的有1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘三酯（16.13%）、1,3-二油酸-2-亞油酸甘三酯（15.25%）、1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘三酯（12.96%）、1-油酸-2,3-二亞油酸甘三酯（8.05%）、三油酸甘三酯（7.18%）。

表3 氧化豬脂固相萃取-RP-HPLC-APCI-MS分析鑒定結果Table 3 Analysis and identification of fatty acid composition oxidized lard by solid phase extraction and RP-HPLC/APCI-MS

按照一般規則，許多動物脂肪不飽和脂肪酸主要分布于Sn-2位，而飽和脂肪酸主要分布于Sn-1/3位上[26]；而豬脂脂肪酸的位置分布比較特殊，不飽和脂肪酸主要分布于Sn-1/3位，飽和脂肪酸主要是分布Sn-2位。楊春芳[27]、趙海珍[28]等報道豬脂甘油酯位于Sn-2位的脂肪酸主要是棕櫚酸，位于Sn-1/3位的脂肪酸主要是油酸。本實驗豬脂甘油酯的分析結果中，檢測出的主要是2-位為棕櫚酸和亞油酸的甘三酯，且比 較總離子流色譜圖相對峰面積，2-位為亞油酸的甘三酯的含量大于2-位為棕櫚酸的甘三酯，但由此不能肯定分布于Sn-2位上的主要脂肪酸是亞油酸而不是棕櫚酸。因為APCI-MS檢測時不同種甘油酯的靈敏度差別較大，往往不飽和雙鍵較多的甘油酯因易于離子化形成[M+H]+具有較高的響應因子，APCI-MS分析的量化數據必須考慮每種甘油酯的定量校正因子，也可采用較為通用的蒸發光散射檢測器在某種程度上克服APCI-MS檢測的這一缺陷[29]。本實驗豬脂甘油酯組成分析是為便于隨后的豬脂非（難）氧化產物的解譜鑒定，故豬脂甘油酯組成的進一步定量分析未進行。

2.3 氧化豬脂的RP-HPLC-APCI-MS分析鑒定結果

極性非（難）揮發性脂肪氧化產物一般包括初級氧化產物——甘三酯單氫過氧化物，及甘三酯雙氫過氧化物、甘三酯單環氧化物、甘三酯雙環氧化物等。按照2.1節所述，對總離子流色譜圖（圖3）中的色譜峰進行鑒定，鑒定結果見表3。因40.64 min后色譜峰主要為未氧化甘油三酯，在面積歸一化時扣除，表3未列出。

甘三酯在空氣中的氧化可發生在與Sn-1(3)/Sn-2結合的不同位脂肪酸、或同一位脂肪酸上不同的雙鍵位置、甚至是同一雙鍵的左右兩側從而出現結構異構體，表現為在總離子流圖中的一段保留時間內，包含具有相同質譜特征的多個（或成簇）大小不等的色譜峰。例如，總離子流色譜圖中保留時間38～40 min主要包含了4 個具有相同質譜特征的色譜峰（圖放大后看到），故判斷為結構異構體，圖3a～d為此4 個結構異構體的質譜圖，推斷過程為：由m/z 891（[M+H]+）知相對分子質量為890，再根據m/z 873（[M+H－H2O]+）、m/z 857（[M+H－H2O2]+）、m/z 617（[M+H－棕櫚酸－H2O]+）、m/z 603（[M+H－棕櫚酸－2×O]+）、m/z 591（[M+H－油酸－H2O]+）、m/z 577（[M+H－油酸－2×O]+），得出此4個化合物為棕櫚酸二油酸甘三酯的單氫過氧化物，再結合表2中豬脂甘油酯組成及結構的分析，得出此4個化合物應為1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘三酯的單氫過氧化物。以m/z 891、873、857為提取離子，得總離子流圖中4個異構體的保留時間分別為38.15、38.58、39.07、39.38min。

圖3 RP-HPLC-APCI-MS檢測1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘三酯單氫過氧化物4個（a～d）結構異構體質譜圖Fig.3 APCI-MS spectra of four mono-hydroperoxide isomers (a-d) from 1,3-di-oleoyl-2-palmitoyl-glycerol analyzed by reverse phase high performance liquid chromatography and atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry

由表3可知，從調控氧化豬脂中鑒定出5種甘二酯和來自于10種甘三酯的22個單氫過氧化物，其中相對峰面積較高的為1-硬脂酸-2-亞油酸-3-油酸甘三酯單氫過氧化物（18.44%）、1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘三酯單氫過氧化物（16.03%）、1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘三酯單氫過氧化物（9.42%）、1,3-二油酸-2-亞油酸甘三酯單氫過氧化物（8.71%）、三油酸甘三酯單氫過氧化物（7.63%）、1-棕櫚酸-2,3-二亞油酸甘三酯單氫過氧化物（7.53%）。

脂肪氧化易于發生在不飽和脂肪酸位置，脂肪酸的不飽和雙鍵越多，被氧化的幾率越大。與表2中豬脂的甘油酯分析結果比較可知，含量高且不飽和程度高的甘三酯氧化形成的甘三酯單氫過氧化物含量也相對較高。例如，豬脂中1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘三酯（16.13%）含有3個雙鍵，它的氧化產物即1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘三酯單氫過氧化物（16.03%）在氧化豬脂中檢測到的含量也較高。

與先前氧化雞脂的分析結果相比[21]，氧化豬脂中沒有檢測到甘三酯雙氫過氧化物以及甘三酯環氧化物。魏永生等[24]采用氫氧化鉀-甲醇法甲酯化衍生然后氣相色譜-質譜聯機分析，報道豬脂不飽和脂肪酸含量為48.56%，雞脂不飽和脂肪酸含量為59.49%。本實驗采用氫氧化鉀-甲醇法甲酯化衍生然后GC-MS聯用分析，所用豬脂中不飽和脂肪酸含量為52.38%，所用雞脂中不飽和脂肪酸含量為64.03%。由此認為，很可能由于雞脂的不飽和脂肪酸含量高于豬脂，使得形成相同量的甘三酯單氫過氧化物，氧化豬脂要比氧化雞脂困難；而甘三酯雙氫過氧化物以及甘三酯環氧化物需由甘三酯單氫過氧化物進一步氧化得到，故從豬脂氧化的非（難）揮發性產物中僅檢測到甘三酯單氫過氧化物。

3 結 論

采用RP-HPLC-APCI-MS從豬脂中鑒定出33種甘油酯，包括7種甘二酯和26種甘三酯，含量高的為1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘三酯、1,3-二油酸-2-亞油酸甘三酯、1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘三酯、1-油酸-2,3-二亞油酸甘三酯。

采用固相萃取和RP-HPLC-APCI-MS從調控氧化豬脂中鑒定出5種甘二酯和10種甘三酯形成的22種單氫過氧化物，含量高的為1-硬脂酸-2-亞油酸-3-油酸甘三酯單氫過氧化物、1-棕櫚酸-2-亞油酸-3-油酸甘三酯單氫過氧化物、1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘三酯單氫過氧化物、1,3-二油酸-2-亞油酸甘三酯單氫過氧化物。所鑒定出的甘三酯單氫過氧化物主要由豬脂中含不飽和脂肪酸的甘三酯氧化形成，甘三酯單氫過氧化物含量高低順序與豬脂中相應甘三酯在豬脂中的含量高低順序一致。

檢測到的極性非（難）揮發性豬脂調控氧化產物僅為甘三酯單氫過氧化物，表明與雞脂調控氧化類似，豬脂調控氧化同樣為一種溫和的氧化工藝。本實驗研究結果 對于深入認識“脂肪調控氧化-熱反應”兩步法制備肉味香精的機理，優化熱反應肉香味香精制備工藝具有指導性。

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Analysis of Glycerides in Lard and Non-volatile Polar Components from Oxidized Lard by Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography and Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry

ZHANG Ling, DU Rong-qiang, XIE Jian-chun*, CAO Chang-chun, WANG Meng, ZHENG Fu-ping, SUN Bao-guo
(Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

The glycerides in lard, and the polar non-volatiles in oxidized lard prepared by controlled oxidation were analyzed by reverse phase high performance liquid chromatography and atmosphere pressure chemical ionization mass spectrometry (RP-HPLC-APCI-MS) after solid phase extraction (SPE). Thirty-three glycerides including seven diglycerides and twentysix triglycerides were identified from the lard, which were dominated by 1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-oleoyl-glycerol (16.13%), 1,3-di-oleoyl-2-linoleoyl-glycerol (15.25%) 1,3-di-oleoyl-2-palmitoyl-glycerol (12.96%), and 1-oleoyl-2,3-di-linoleoylglycerol (8.05%), according to percentages of peak areas in the total ion chromatogram. Five diglycerides and twenty-two mono-hydroperoxides derived from ten triglycerides were identified from the oxidized lard, where the mono-hydroperoxides from 1-stearoyl-2-linoleoyl-3-oleoyl-glycerol (18.44%), 1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-oleoyl-glycerol (16.03%), 1,3-di-oleoyl-2-palmitoyl-glycerol (9.42%), 1,3-di-oleoyl-2-linoleoyl-glycerol (8.71%), trioleic (7.63%) and 1-palmitoyl-2,3-linoleoylglycerol (7.53%) were predominant. These results showed that fat control oxidation was a mild oxidation process, since only the oxidized products of mono-hydroperoxides of triglycerides were found from the oxidized lard.

lard; reverse phase high performance liquid chromatography; atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry; controlled oxidation; triglyceride; mono-hydroperoxide

TQ656.1

A

1002-6630（2014）24-0123-07

10.7506/ spkx1002-6630-201424024

2014-07-19

國家自然科學基金面上項目（31171755；31371838）；北京市教委科技發展計劃重點及北京市自然科學基金項目（KZ20101001011）

張玲（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品風味化學。E-mail：949354559@qq.com

*通信作者：謝建春（1967—），女，教授，博士，研究方向為食品風味化學。E-mail：xjchun@th.btbu.edu.cn