海星皂苷測定條件優化及其組織分布測定

曹 榮，張 媛，趙 玲，殷邦忠，劉 淇,*

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東 青島 266071；2.獐子島集團股份有限公司，遼寧 大連 116001）

海星皂苷測定條件優化及其組織分布測定

曹 榮1，張 媛2，趙 玲1，殷邦忠1，劉 淇1,*

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，山東 青島 266071；2.獐子島集團股份有限公司，遼寧 大連 116001）

為了建立快速、簡便、準確的海星皂苷含量檢測方法，以多棘海盤車為研究對象，分析濃硫酸用量、反應溫度、反應時間等比色條件以及脫色、脫脂等樣品前處理條件對測定結果的影響，并采用優化后的檢測方法對多棘海盤車不同組織中的皂苷含量進行測定。結果表明：適宜采用濃硫酸用量10%、反應溫度60 ℃、反應時間30 min的比色條件，樣品前處理過程中進行脫色、脫脂以及丙酮沉淀可以顯著提高測定的準確性。精密度實驗和加標回收率實驗結果表明：皂苷含量低、中、高3 組樣品對應的相對標準偏差分別為4.71%、1.61%和1.52%，平均加標回收率為99.64%，該方法的精密度和準確性可以滿足檢測要求。多棘海盤車整體皂苷含量為3.65 mg/g（干基計），其中消化腺中皂苷含量最高，其次是體壁和生殖腺。

皂苷；多棘海盤車；比色法

海星屬于棘皮動物門（Echinodermata），海星綱（Asteroidea），是一類海洋底棲的無脊椎動物，在我國沿海海域分布廣泛[1]。海星大量掠食牡蠣、扇貝等，且具有很強的繁殖和再生能力，嚴重危害沿海的貝類養殖。目前貝類底播養殖區域的海星隨拖網起捕后多被直接丟棄或經曝曬粉碎后用作農作物肥料，這對環境是一種污染，也造成了資源的浪費。

海星具有較高的蛋白、脂質含量[2]，同時含有皂苷、甾醇、生物堿、多糖等多種結構獨特的化學物質[3]，在食品、飼料、醫藥等領域具有良好的開發前景。海星皂苷是海星的次生代謝產物，具有重要的生物功能和藥理活性，如調節生殖發育、降血壓、抗潰瘍、抗病毒、抑制腫瘤細胞生長等，但同時也具有很強的溶血作用與毒性[4]，人或動物過量服用后會產生頭暈、嘔吐等中毒癥狀，因此海星用作食品和飼料加工時具有一定的安全隱患[5]，針對海星中皂苷檢測方法和脫除技術的研究具有重要的現實意義。

目前皂苷的分析方法主要有比色法、薄層掃描法、色譜法、毛細管電泳法等[6]。不同類型的皂苷，其適用的檢測方法也不同。海星中的皂苷多以甾體化合物的形式存在[7]，利用其可被濃硫酸氧化脫水生成α,β-不飽和酮共軛體系的性質[8]，可以采取紫外分光光度法測定其含量[9]，但該方法的準確性和穩定性會受到樣本中脂質、色素、游離糖及部分水解苷元等的影響，因此有必要對該方法的測定條件進行優化。

本實驗以薯蕷皂苷元作為標準品，分析了濃硫酸用量、反應溫度、反應時間對比色的影響，并以黃海和渤海較為常見的海星——多棘海盤車（Asterias amurensis）為研究對象，考察皂苷提取過程中脂質脫除、色素脫除以及水解苷元分離對測定結果的影響，對基于紫外分光光度法的海星中皂苷定量檢測條件進行優化，并采用該方法對多棘海盤車中的皂苷分布進行了分析，以期為海星的開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多棘海盤車由大連獐子島集團股份有限公司提供，2013年5月采集自渤海獐子島海域，選取輻徑（12±2） cm的樣品，洗凈后烘干、粉粹，過200 目篩備用。

薯蕷皂苷元標準品 美國Sigma公司；濃硫酸、甲醇、丙酮、石油醚等均為分析純。

1.2 方法

專業核心課是財務管理專業的重要內容，教師通過核心課能夠將財務管理知識系統的傳授給學生，這樣學生就會具備實際操作的能力。核心課設置如下課程：財務管理案例、財務控制、稅法與籌劃等，我們可以將預算管理、高級財務管理、資本運營、非營利組織財務等課程作為選修課供學生選擇學習。這樣也就體現了財務管理專業具備的獨特性。其中，中級財務會計、財務管理、財務管理案例、財務風險管理、稅法與籌劃、財務控制、財務分析、成本管理會計、資產評估是專業核心課的重要內容。

1.2.1 溶液的配制

取50.0 mg于50 mL容量瓶中，甲醇定容，配制成1.0 mg/mL薯蕷皂苷元甲醇標準溶液。

以陜西辦事處、南陽辦事處、邯鄲辦事處、膠東辦事處、豫東辦事處、晉南辦事處、福建辦事處，廣西辦事處、四川辦事處、山西省社會化服務體系為根據地，打造的十大現代農業技術服務的探索基地和價值營銷的實踐基地，形成了天脊品牌提升的重要基點和“市場堡壘”。

當漿液擴散方位角θ≤90°時，即漿液運動方向與裂隙面傾斜方向總體一致，隨著裂隙傾角的增大，在相同時間內的注漿壓力較小，這是由于裂隙面傾斜時，漿液具有向下的自重分量，其與注漿壓力一起克服漿液阻力，促使漿液向下運動，在恒速率注漿情況下，裂隙傾角越大，注漿壓力越小，且當注漿時間t=60 s時，漿液擴散方位角θ=0°、傾角α=90°時的傾斜裂隙注漿壓力為水平裂隙的0.62倍。

1.2.2 比色條件優化

1.2.2.1 吸收波長的確定

標準品薯蕷皂苷元與濃硫酸反應后，在200～1 000 nm范圍內進行光譜掃描，發現在紫外光區有強吸收，其中271 nm波長處有最大吸收峰。這與文震等[9]發現標準皂苷與濃硫酸反應產物在277 nm有最大吸收峰以及王榮鎮等[10]發現紫蛇尾皂苷檢測波長為276 nm的結論基本一致。

國防科技工業主要是指從事武器科研裝備生產、研發工作的相關工業產業，具體包括航空、航天、核能、電子、船舶等多個部門，其對于我國國防事業的建設與發展有著直接的影響。在計劃經濟時期，軍工企業本身所存在的競爭壓力非常之小，同時國家的資金支持力度也比較大，因而對于自身的競爭優勢以及經濟收益問題并不重視［1］。然而隨著市場經濟的不斷發展，軍工企業要想生存并長期發展下去，就必須要尊重市場規律，參與到市場競爭中來，不斷提升自身的核心競爭力，而市場導向下的軍民融合發展策略則恰恰能夠幫助軍工企業實現這一目標。因此，軍工企業的軍民融合發展，在很大程度上也是為了滿足市場經濟環境下國防科技工業的進一步發展需求。

1.2.2.2 硫酸用量

準確量取0.1 mL標準皂苷溶液，于冰水浴中分別加入濃硫酸0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，混勻，60℃水浴中反應30 min，冰浴冷卻后用甲醇定容至10 mL，測定吸光度。

2.2 反應條件對吸光度的影響

標準皂苷溶液0.1 mL中分別加入濃硫酸0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，在同樣溫度條件下反應相同時間，反應后吸光度見圖1a。0.2、0.5 mL和1.0 mL濃硫酸用量對應的吸光度有顯著性差異（P＜0.01），1.0、2.0、3.0 mL濃硫酸用量對應的吸光度無顯著性差異（P＞0.05）。從經濟和實驗安全的角度，采用濃硫酸用量1.0 mL（即濃硫酸用量為反應總體系的10%）。

1.2.2.4 反應時間

準確量取0.1 mL標準皂苷溶液，于冰水浴中加入濃硫酸1.0 mL，混勻，60 ℃水浴中分別反應10、20、30、40、50、60 min，冰浴條件下冷卻后用甲醇定容至10 mL，測定吸光度。

1.2.3 樣品處理

廣汽本田首款純電動SUV VE-1全球首發，市場指導價22.58萬元，補貼后價格為17.08萬元起。同時，廣汽本田首款插電式混動SUV世銳也于車展亮相并揭曉市場指導價：豪華版20.68萬元、補貼后價格18.08萬元起；精英版19.68萬元，補貼后價格17.08萬元起。

1.2.4.2 精密度實驗

1.2.4 方法精密度、準確性驗證

1.2.4.1 標準曲線繪制

上海誠達物流作為第三方運輸公司，提供專業的第三方運輸服務。但與運輸相關的其他第三方物流服務并有涉及，導致了上海誠達物流公司服務產品的單一性。

分別取薯蕷皂苷元-甲醇標準溶液（1.0 mg/mL）0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，冰浴條件下分別加入濃硫酸1.0 mL，60 ℃條件下反應30 min，冰浴冷卻，甲醇定容至10 mL。于271 nm波長處測定吸光度。

取6 份海星干粉，每份5.0 g，分別加入甲醇100 mL，超聲提取60 min，過濾。濾液分別進行如下處理：Ⅰ濾液用甲醇定容至100 mL，直接取0.5 mL，按1.2.2節優化后的條件進行比色；Ⅱ濾液中按照0.01 g/mL的比例加入活性炭脫色，充分混勻后濾紙過濾，濾液用甲醇定容后比色；Ⅲ濾液中按照1∶2（V/V）的比例加入石油醚，采用分液漏斗脫除脂質，收集下層液體用甲醇定容后比色；Ⅳ濾液中加入5 倍體積丙酮，8 000 r/min離心20 min后，棄上清液，黃色沉淀物用甲醇溶解、定容后比色；Ⅴ濾液依次脫色、脫脂處理后，甲醇定容比色；Ⅵ濾液依次脫色、脫脂、丙酮沉淀處理后，甲醇定容比色。

設置皂苷含量低、中、高3 組樣品（分別取海星干粉1.00 、4.00 g和7.00 g），按照1.2.2節優化的條件進行樣品處理，提取粗皂苷并測定含量。每組均重復3次，每次設2個平行。結果以平均值±標準偏差表示，以相對標準偏差表征精密度。

1.2.4.3 加標回收率實驗

取已知皂苷含量的海星干粉樣品6份，每份1.00 g，按照1.2.2節優化的條件進行樣品處理，然后分別加入5.0 mg/mL薯蕷皂苷元標準溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，定容后比色。計算各組加標回收率，以平均加標回收率表征準確性。

1.2.5 多棘海盤車不同組織中皂苷含 量測定

答：85歲的老人，吃點東西就要上廁所，肚里存不住東西，到醫院檢查沒有病，說明腸道功能老化，屬于功能問題，可服用水蘇糖、活菌制劑和植物活性硒，調節腸道功能。

鮮活多棘海盤車洗凈泥沙，分離出體壁、消化腺（包括胃、幽門盲囊）和生殖腺，烘干，研成粉末備用。分別取體壁、消化腺和生殖腺干粉5.0 g，按照1.2.2節和1.2.3節確立的條件進行皂苷提取和含量測定。

1.3 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 吸收光譜

1998年，地處松嫩平原的巨浪牧場連降暴雨，本已四處漏風的泥草房再也經不起暴風雨的洗禮，一整面墻突然倒塌。無奈之下，全家只好緊急疏散，被牧場安置到場部西側一個叫“西牛舍”的地方。

準確量取0.1 mL標準皂苷溶液，于冰水浴中加入濃硫酸1.0 mL，混勻，60 ℃水浴中反應30 min，冰浴冷卻后用甲醇定容至10 mL。用紫外-可見分光光度計在200～1 000 nm波長范圍內進行光譜掃描。

1.2.2.3 反應溫度

準確量取0.1 mL標準皂苷溶液，于冰水浴中加入濃硫酸1.0 mL，混勻，分別在20、40、60、80℃、水浴中反應30 min，冰浴冷卻后用甲醇定容至10 mL，測定吸光度。

標準皂苷溶液0.1 mL中加入濃硫酸1 mL，分別在20、40、60、80 ℃水浴中反應30 min，反應后的吸光度見圖1b。隨著反應溫度的升高，吸光度呈增大的趨勢。20 ℃對應的吸光度明顯低于其他組（P＜0.01），說明20 ℃條件下皂苷與濃硫酸反應不完全。60 ℃對應的吸光度略高于40 ℃（P＜0.05），60、80 ℃對應的吸光度之間差異不顯著（P＞0.05）。因此，60 ℃適宜作為反應溫度。

自主、合作、探究式學習是新課程改革所極力倡導的學習方式。在這種學習方式之下，學生的自主學習是基礎。通過學生的自主學習，我們才能很準確地收集學生在自主學習過程中所遇到的困難，才能為接下來的“以學定教”提供教學決策，使得課堂教與學沿著正確的方向前進。但是課堂教學是不能僅僅停留在學生的自主學習環節的，因為這樣的話學生只是發現了問題，卻沒能很好地解決問題。因此，從教學的實際效果上來說還是遠遠不夠的。所以說，合作、探究環節才是新課程改革之下一堂課的最主要環節。通過這個環節，教師的教學目標才能實現，課堂教學的重難點才能得到有效突破，學生的個性化學習成果也才能有所保障。

目前的小學英語課標沒有具體規定小學階段的音標學習要到何種程度，教學目標只在于帶領孩子們感受擁有同樣元音發音規律的單詞，并沒有進行系統的音標教學。可是近幾年小學英語測試中開始出現音標考察題，比如選出劃線部分讀音不同的單詞這種類似的題型，一般是10分的分值，而大部分孩子都會丟掉4-8分。丟分太多，孩子們紛紛對音標題“發怵”。

標準皂苷溶液0.1 mL中加入濃硫酸1 mL，在60 ℃水浴中分別反應10、20、30、40、50、60 min，反應后的吸光度見圖1c。隨著反應時間的延長，吸光度呈增大的趨勢，30 min以后吸光度趨于平穩。因此，反應時間控制為30 min。

圖1 不同濃硫酸用量（a）、反應溫度（b）、反應時間（c）條件下的吸光度Fig.1 Absorbance as a function of sulfuric acid dosage (a), reaction temperature (b) and reaction time (c)

2.3 樣品處理條件對比色結果的影響

1.2.2 平衡指數測定方法 儀器采用以色列Sunlight醫療器械公司Tetrax平衡測試系統。平衡指數是由Tetrax測得的平衡參數計算出的一個用以表示患者跌倒風險的數值，這個值基于各種影響患者平衡的因素。測定方法簡單無傷害，患者站在平衡測定儀上，通過8種姿勢對患者進行測量，包括在自然站立情況下睜眼、閉眼、頭左右和前后專向，左右腳步同步性和腳下墊有泡沫橡膠腳墊等，5～10 min測定完畢，由專職治療師完成所有的檢測。檢查前向受檢者充分解釋檢查目的和注意事項，檢查時盡量保持檢測環境的安靜。測定結果以姿勢的總結表(BSS)和平衡指數的形式表示。

圖2 樣品前處理方式對吸光度的影響Fig.2 Effects of sample pretreatment methods on absorbance

由圖2可知，海星樣品脫色、脫脂及丙酮沉淀處理對吸光度均有一定的影響，其中活性炭脫色處理影響顯著（P＜0.05），脫脂、丙酮沉淀處理影響均極顯著（P＜0.01）。海星樣品用甲醇提取粗皂苷過程中，部分脂質、色素、游離糖及部分水解苷元等會一并溶出，且都可能與濃硫酸發生反應，造成吸光度增大，進而影響檢測的準確性。Ⅵ組樣品經脫色、脫脂、丙酮沉淀處理后，吸光度為0.202，與對照Ⅰ組的吸光度0.376相比，明顯降低。

貴州中部長順蘋果產區雨水多光照差，建議套袋栽培，有利于果實著色，隔離藥劑，提高品質。而威寧地區，紫外線強，果面光潔度較差，外觀品質差，但能保證果實品質，可根據市場需求選擇性套袋。建議有技術條件的區域進行無袋栽培。

2.4 標準曲線

以薯蕷皂苷元作為標準品，繪制標準曲線。溶液中皂苷質量分數在2～40 μg/mL范圍內與吸光度呈線性相關，其回歸方程式為：Y=0.022X+0.001 8，相關系數R2=0.999 8。以吸光度0.01對應的皂苷質量分數為檢測限，計算出最低檢測限為0.37 μg/mL。

2.5 精密度與加標回收率精密度實驗和加標回收率實驗結果見表1、2。皂苷含量低、中、高3組樣品對應的相對標準偏差分別為

表1 精密度實驗結果Table 1 Results of precision experiments

表2 樣品加標回收率實驗結果Table 2 Results of spiked recovery experiments

4.71 %、1.61%和1.52%，說明方法精密度高、重復性好。平均加標回收率為99.64%（相對標準偏差為1.72%），說明方法準確性高。

2.6 多棘海盤車中皂苷的組織分布

表3 多棘海盤車各組織中海星皂苷含量（以干基計）Table 3 Saponin contents in different tissues of Asterias amurensis

采用建立的檢測方法測定多棘海盤車中皂苷的組織分布。由表3可知，體壁、消化腺和生殖腺中皂苷含量有極顯著差異（P＜0.01）。其中，消化腺中皂苷含量最高，其次是體壁和生殖腺。

3 討 論

多棘海盤車中皂苷組織分布的檢測結果與Kicha等[11]研究結果類似，Kicha等[11]采用高效液相色譜法測得海燕（Asterina pectinifera）中甾體物質含量的分布規律為：幽門盲囊＞胃＞體壁＞性腺。郭承華等[12]測得羅氏海盤車幽門盲囊、胃、體壁、生殖腺的皂苷含量分別為4.16、3.04、1.54、0.24 mg/g，同樣是幽門盲囊中含量最高。Garneau等[13]測得北極海星（Leptasterias polaris）中皂苷含量分布規律為：胃＞幽門盲囊＞體壁＞性腺。這些研究均表明海星消化腺（胃、幽門盲囊）中具有較高的皂苷含量，這種現象可能與海星獨特的生理有關，相關機理有待進一步研究。

不同的海星種類，其皂苷含量有較大差異。如郭承華等[12]測得羅氏海盤車和海燕中的皂苷含量分別為0.70 mg/g和5.17 mg/g。即使同一種類的海星，其皂苷含量也可能因為地理分布、生長季節等因素存在差別。實驗發現，渤海產多棘海盤車整體皂苷含量為3.65 mg/g，這一結果與王長云等[5]測得多棘海盤車粗總皂苷含量為0.077%的結論有很大差異。這種差異一方面與樣品的地域性、季節性有關，更重要的可能與測定過程采用的方法不同有關。如張立新等[14]采用香草醛-硫酸顯色方法，測得海燕中的皂苷含量為0.313 mg/g，這一結果與郭承華等[12]采用甲醇提取、干燥后稱重法測定的海燕皂苷含量5.17 mg/g相差十余倍。

海星中的皂苷在化學結構上多屬于甾體皂苷，香草醛-硫酸顯色法適用于典型的三萜皂苷，用該方法測定海星中的甾體皂苷時會因為草醛顯色后在可見光區沒有明顯的吸收峰而導致結果偏低。而稱重法過程繁瑣，測定周期長。相對而言，比色法更為快速、簡便，對比色條件進行優化后準確率也較高，完全可以滿足日常科研的需要。

選用高產抗病蟲良種，供試水稻品種為湘優109、威優431、協優57、宜香481和川江優527等，實行種子處理，采取旱育稀植，培育無病蟲壯秧。進行行規范化寬窄行栽插，合理施肥，科學管理，水稻生產全程實行健身控害栽培，嚴禁使用化學除草劑，創造有利于稻、鴨良好的生存條件。

4 結 論

采用分光光度法可以準確測定海星中的皂苷含量。優化后的提取和前處理條件為：海星干粉按照0.05 g/mL的比例加入甲醇，超聲提取60 min，過濾；濾液中按照0.01 g/mL的比例加入活性炭脫色，之后按照1∶2（V/V）的比例加入石油醚脫除脂質，收集下層液體加入5 倍體積丙酮，8 000 r/min離心20 min后，棄上清液，黃色沉淀物用甲醇溶解并定容至100 mL，比色。優化后的比色條件為取上述皂苷溶液0.5 mL，冰浴條件下加入濃硫酸1.0 mL，60 ℃條件下反應30 min，冰浴冷卻，甲醇定容至10 mL；在271 nm波長處測吸光度。精密度和加標回收率實驗表明，該方法可以快速、準確測定海星總皂苷含量。采用上述方法測得多棘海盤車皂苷含量為3.65 mg/g（以干基計），其中消化腺中皂苷含量最高，其次是體壁和生殖腺。

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Optimization of Experimental Conditions for the Analysis of Tissue Distribution of Saponin in Asterias amurensis

CAO Rong1, ZHANG Yuan2, ZHAO Ling1, YIN Bang-zhong1, LIU Qi1,*
(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Zhangzidao Group Co. Ltd., Dalian 116001, China)

The objective of this study was to establish a rapid, simple and accurate colorimetric method for the determination of saponin in starfi sh. Asterias amurensis was selected as the raw materials. The effects of colorimetric conditions such as sulfuric acid dosage, reaction temperature and reaction time as well as sample preparation procedures such as decoloration and degreasing on saponin determination were analyzed. It was shown that addition of sulfuric acid in a proportion of 10% (V/V) and reaction temperature at 60 ℃ for 30 min were suitable colorimetric conditions, and the pretreatment steps decoloration, degreasing and acetone precipitation could signifi cantly improve the accuracy of determination. The results of precision and spiked recovery experiments showed that RSDs (relative standard deviations) for three groups with low, medium and high saponin contents were 4.71%, 1.61% and 1.52%, respectively, and the average recovery was 99.64%. Asterias amuren sis was detected to contain 3.65 mg/g saponin (dry basis). The digestive gland of Asterias amurensis showed the highest saponin content, followed by the body wall and gonad.

saponin; Asterias amurensis; colorimetric method

TS254.7

A

1002-6630（2014）24-0174-04

10.7506/spkx1002-6630-201424033

2014-02-17

中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（20603022011005）

曹榮（1981—），男，副研究員，博士，主要從事水產品品質評定與控制技術研究。E-mail：caorong@ysfri.ac.cn

*通信作者：劉淇（1965—），男，研究員，本科，主要從事水產品加工研究。E-mail：liuqi@ysfri.ac.cn