茶葉籽中黃酮的分離及HPLC-MS聯用分析

楊安琪，呂麗爽，王華清，李建林，鄭鐵松*

（南京師范大學金陵女子學院食品科學與營養系，江蘇 南京 210097）

茶葉籽中黃酮的分離及HPLC-MS聯用分析

楊安琪，呂麗爽，王華清，李建林，鄭鐵松*

（南京師范大學金陵女子學院食品科學與營養系，江蘇 南京 210097）

用大孔吸附樹脂HPD826分離純化茶葉籽總黃酮的粗提物，對影響HPD826樹脂動態吸附、解吸的各因素進行系統研究。最終確定最佳條件為：上樣液質量濃度1.8 mg/mL、上樣速率2 mL/min、體積分數50%乙醇作為洗脫劑、洗脫劑流速1 mL/min。純化后的茶葉籽黃酮純度為40.81%，比純化前提高了7.63 倍。通過高效液相色譜-質譜聯用分析大孔吸附樹脂純化后樣品，初步確定茶葉籽中4 種黃酮的結構，均為柚皮素的多糖苷。

茶葉籽；總黃酮；純化；高效液相色譜-質譜聯用

茶葉籽是茶樹（Camellia sinensis (L.) O. Kuntze, Theaceae）的種子，為茶葉生產的副產品[1-3]。茶葉籽資源豐富，但長期以來，人們對于茶葉的種植、加工和研究較多，而對茶葉籽這一茶葉生產副產品的開發利用不太重視，造成了資源的極大浪費。茶葉籽中富含山奈酚和柚皮素類的黃酮類化合物[2-8]。Gao Dafeng等[4]利用SephadexLH-20、硅膠柱層析從油茶餅粕中分離出8 種黃酮類化合物均為山奈酚衍生物。Chen[5]采用異丙醇鹽析法從油茶籽餅粕中分離出7 種黃酮苷，其中3 種為山奈酚的糖苷，3 種為柚皮素的糖苷。Du[6]采用硅膠H柱從油茶籽中分離得到2 種山奈酚的衍生物，對肝癌細胞BEL-7402有較好的抑制作用。大孔樹脂具有物理化學穩定性高、選擇性好、可重復使用、能耗低、分離設備簡單方便、適合工業化生產等優點，是一類有效的分離純化黃酮類化合物的方法[9-11]。高效液相色譜-質譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯用技術是將HPLC對復雜樣品的高分離能力與MS的高選擇性、高靈敏度有效結合起來，可迅速地分析確定成分的結構，并且所需樣品量少，是在缺乏標準品的情況下，分析天然產物等復雜體系中的化合物的重要工具，廣泛應用于植物中黃酮類物質的分析[7,12-16]。

本研究將用大孔吸附樹脂分離純化茶葉籽總黃酮的粗提物，從AB-8、D101等12 種常用于分離純化植物黃酮類化合物的樹脂中，篩選出最適合分離純化茶葉籽黃酮的樹脂類型，對其純化工藝條件進行研究，并用HPLCMS聯用技術分析茶葉籽黃酮的結構，以期為茶葉籽黃酮的深入研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉籽（儲葉種）由溧水縣健茗茶廠提供；聚酞胺（60～90目） 浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠；D101型、AB-8型、NKA-9型、X-5型大孔樹脂 南開大學化工廠；DM130型、HPD450型、HPD600型、HPD722型、HPD750型、HPD826型大孔樹脂 滄州寶恩吸附材料科技有限公司；各種大孔樹脂型號、物理性能見表1；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、濃鹽酸、石油醚等均為國產分析純。

表1 大孔樹脂的主要物理性質Table 1 Physical properties of macroporous resins

1.2 儀器與設備

N-1001型旋轉蒸發儀 日本Eyela公司；Cary5000型紫外-可見-近紅外分光光度計 美國Varian公司；DBS-100自動部分收集器、DHL-A恒流泵、HD-3型紫外檢測儀 上海滬西分析儀器廠；1100 Series高效液相色譜儀、9460型四極桿串聯質譜 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮含量測定

采用硝酸鋁絡合分光光度法[17]。以蘆丁為標準品，茶葉籽中總黃酮的提取量以mg/g表示[3]。

1.3.2 茶葉籽黃酮除雜液的制備

茶葉籽粉在液料比為26∶1（mL/g）、乙醇體積分數58%、提取溫度82 ℃，提取時間2 h條件下提取2次，粗提液4 ℃冷藏靜置12 h后過濾，經旋轉蒸發濃縮。濃縮液用石油醚進行萃取以除去色素和油脂等雜質，連續萃取3 次至醚相無色后收集下層濃縮液。再加3 倍體積乙醇，攪拌均勻，4 ℃冷藏靜置12 h以除去多糖、蛋白質等水溶性雜質，旋轉蒸發濃縮，去除乙醇，用蒸餾水配制成所需的不同黃酮質量濃度的樣品液，即為純化用茶葉籽黃酮除雜液，4 ℃冷藏備用。

1.3.3 紫外光譜掃描

取2～3 mL適當質量濃度的茶葉籽黃酮除雜液于甲醇中，以甲醇作參比，在紫外-可見光分光光度計中掃描，掃描波長范圍為200～500 nm。

1.3.4 各種樹脂的靜態吸附解吸

取一定量預處理好的樹脂真空抽濾，準確稱量2.0 g樹脂于250 mL錐形瓶中，加入茶葉籽黃酮除雜液30 mL，密封后置于振蕩培養箱（25 ℃，120 r/min）中振蕩24 h。充分吸附后，過濾，測定濾液中總黃酮的質量濃度，計算各樹脂的靜態吸附率和吸附量。吸附后的樹脂過濾抽干，置于250 mL錐形瓶中，加入體積分數60%的乙醇30 mL，密封后置于振蕩培養箱（25 ℃，120 r/min）中振蕩24 h，使總黃酮解吸附，過濾，測定洗脫液中黃酮質量濃度，計算各樹脂的吸附率（%）、吸附量（mg/g）和解吸率（%）[8,11]。1.3.5 大孔樹脂HPD826動態吸附和解吸

取1.6 cm×30 cm玻璃層析柱，裝入預處理好的30 mL HPD826型樹脂，將濃縮的除雜液加水稀釋成一定質量濃度的上樣液上柱吸附，控制流速，用紫外檢測儀檢測流出液，當流出液的吸光度基本沒有變化時，認為大孔樹脂達到動態吸附平衡，停止進樣。收集流出液測定總黃酮含量，分別以吸附率、吸附量或解吸率為指標考察進樣質量濃度（0.85、1.30、1.78、2.21、2.66 mg/mL）、上樣流速（1、2、3、4、5 mL/min）、洗脫劑（乙醇）體積分數（20%、30%、40%、50%、60%、70%）及流速（0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL/min，體積分數60%乙醇溶液）對樹脂性能的影響，確定最佳條件。

將按最佳工藝得到的茶葉籽黃酮純化液和粗提液減壓濃縮，真空冷凍干燥至恒質量。分別精密稱取一定質量的2 種樣品溶于體積分數60%乙醇中，按黃酮含量計算方法測定其質量濃度，并按下式計算其純度。

式中：ρ為樣液中黃酮質量濃度/（mg/mL）；V為定容體積/mL；m為樣品質量/mg。

1.3.6 茶葉籽黃酮純化液HPLC-MS分析條件

色譜條件：Zorbax XDB-C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 ?m）；DAD檢測器；進樣量3 μL；流速0.6 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長280 nm；流動相A：體積分數0.05%甲酸水溶液；流動相B：乙腈；流動相梯度：0 min（30% B），12 min（30% B），20 min（60% B）。

質譜條件：電噴霧離子（electrospray ionization，ESI）源，正、負離子模式檢測；霧化壓力20 psi；干燥氣體的流速11 L/min；毛細管溫度350 ℃；毛細管電壓3.5 kV；掃描范圍m/z 100～1 500。

2 結果與分析

2.1 樣品紫外光譜掃描

對茶葉籽黃酮除雜液進行紫外光譜掃描，其最大吸收波長在280 nm左右，由于提取液經預處理已除去蛋白質，故可排除蛋白質在此波長條件下的干擾，因此在后期的分離純化過程中采用280 nm波長條件下紫外跟蹤檢測上樣和洗脫過程。

2.2 大孔吸附樹脂的靜態吸附和解吸

2.2.1 大孔吸附樹脂對茶葉籽黃酮靜態吸附率和吸附率測定

考察12 種樹脂對茶葉籽黃酮的選擇性，得到不同樹脂的靜態吸附率和解吸率，結果見表2。

表2 各種樹脂靜態吸附率和解吸率Table 2 Absorption and desorption rates of different resins

樹脂的吸附能力由樹脂的極性、孔徑、比表面積等多方面因素決定，對其性能的評價要從吸附量、解吸率以及動力學等方面綜合考慮。本實驗所選的樹脂有非極性、弱極性、中極性、極性和氫鍵等類型。通過表2可以看出，非極性和弱極性的樹脂吸附量很低，而氫鍵和極性的樹脂吸附量相對較高，這可能是由于茶葉籽黃酮的極性相對較大，更有利于氫鍵和極性樹脂吸附[18-19]。從表2可知，所選樹脂中吸附量超過10 mg/g的僅聚酰胺和HPD826樹脂2 種，且均為氫鍵吸附型樹脂，說明氫鍵吸附型樹脂更有利于茶葉籽黃酮的純化。而聚酰胺樹脂雖然吸附量最高，但解吸率僅32.56%，死吸附較大。而HPD826樹脂對茶葉籽黃酮不僅有較好的吸附性而且有良好的解吸性，可以作為純化茶葉籽黃酮的材料。進一步的實驗表明，HPD826樹脂吸附3 h基本已達到吸附飽和，屬于快速平衡型。該結果與劉江波等[18]的報道一致。綜合上述實驗結果，選擇吸附、解吸效果較好的、且吸附速率較大的HPD826大孔吸附樹脂進行茶葉籽黃酮純化實驗。

2.2.2 大孔吸附樹脂HPD826的動態吸附和解吸

2.2.2.1 進樣質量濃度的確定

從圖1可以看出，隨著進樣質量濃度的增加，黃酮吸附量也隨之增加。但當進樣質量濃度增加到1.78 mg/mL以后，進樣質量濃度再增加，黃酮吸附量反而逐漸下降。這是因為進樣質量濃度較低時，提高進樣質量濃度可增加黃酮分子與大孔樹脂的接觸，加速黃酮分子進入樹脂內部并迅速擴散[11,20]。但隨著進樣質量濃度的增大，與黃酮競爭吸附的雜質量也隨之加大[11,20]。綜合考慮應選擇進樣質量濃度為1.8 mg/mL左右進行上柱為宜。

圖1 進樣質量濃度對樹脂性能的影響Fig.1 Effects of sample concentration on the absorption efficiency of HPD826

圖2 進樣流速對樹脂性能的影響Fig.2 Effect of sample loading flow rate on the absorption efficiency of HPD826

2.2.2.2 進樣流速的確定不同進樣流速的吸附量如圖2所示，隨著流速的增大，樹脂對茶葉籽總黃酮的吸附量逐漸降低。樹脂對黃酮的吸附需要一個擴散和接觸的過程，進樣流速過快，目標分子與樹脂還未充分接觸就已下移到下一個吸附層面，以至于很快通過層析柱流出柱外，這樣就無法形成有效的吸附，從而影響分離效果[20-21]。較小的流速則有利于黃酮分子充分與樹脂接觸結合，被樹脂吸附。但流速太小，會造成操作周期長，因此要選擇合適的流速[18,20,22-23]。從結果來看，當流速大于2 mL/min時，吸附量迅速下降，因此選擇2 mL/min的流速為上樣速度。

2.2.2.3 洗脫劑乙醇體積分數的確定

圖3 乙醇體積分數對樹脂性能的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the desorption efficiency of HPD826

從圖3可看出，隨著乙醇體積分數的增加，茶葉籽黃酮的解吸率逐漸增加，當乙醇體積分數達到50%時，解吸率的變化趨于平緩，乙醇體積分數60%時解吸率達到最大，再增加乙醇體積分數解吸率反而成下降趨勢。雖然用體積分數60%的乙醇洗脫時解吸率最高，但乙醇體積分數越高，洗脫液中醇溶性雜質就越多，成本也更高。所以綜合考慮解吸率、純度和成本等因素，選擇體積分數50%乙醇作為本實驗的洗脫劑。

圖4 洗脫流速對樹脂性能的影響Fig.4 Effect of ethanol flow rate on the desorption efficiency of HPD826

2.2.2.4 洗脫劑流速的確定從圖4可看出，隨著洗脫流速的增大，茶葉籽黃酮的解吸率逐漸降低，乙醇還沒有把大孔吸附樹脂吸附的黃酮完全洗脫就流出了柱子，造成了原料的浪費。另外，流速太低又使生產周期延長，降低效率。通常情況下控制洗脫流速為吸附流速的1/3～1/2[22-23]。因此，洗脫液流速選擇1 mL/min。

2.2.2.5 動態洗脫曲線

圖5 動態洗脫曲線Fig.5 Dynamic elution curve of HPD826 resin

動態洗脫曲線如圖5所示，該洗脫曲線峰形良好，無明顯拖尾現象，表明用體積分數50%乙醇溶液以2 mL/min的速度洗脫效果良好。先用蒸餾水洗柱可以除去多糖、茶皂素等水溶性雜質。再用體積分數50%乙醇洗脫，6 h后洗脫液的吸光度降到與乙醇洗脫前基本相同且長時間保持不變，可認為樹脂上的黃酮已基本被洗脫下來，可以停止洗脫。

2.2.2.6 大孔樹脂HPD826純化效果

茶葉籽黃酮粗提物，經初步除雜、大孔樹脂純化、真空濃縮干燥得到的茶葉籽黃酮純化物的純度為40.81%，比純化前4.73%提高了7.63 倍，說明HPD826樹脂純化效果較好，適合茶葉籽黃酮的富集純化。

2.2.3 HPLC-MS分析鑒定茶葉籽黃酮純化液

茶葉籽黃酮純化液經HPLC-MS聯用儀分析，所得HPLC圖和總離子流圖如圖6所示，根據一、二級質譜圖和紫外吸收光譜圖分析其中主要成分，結合文獻[7]初步確定圖中4 個峰均為黃酮類化合物。

圖6 純化液總離子流圖（A）和高效液相色譜圖（B）Fig.6 Total ion chromatogram (A) and HPLC chromatogram (B) of purified flavonoids

2.2.3.1 化合物Ⅰ的結構分析

為更確切地獲得目標分子的質譜信息，本實驗采用正、負離子雙重模式獲得電噴霧電離質譜圖。在HPLC條件下，ESI正離子模式（ESI+-MS）中，會出現[M+ Na]+、[M+K]+、[M+H]等離子峰[9,13,15]；ESI負離子模式（ESI－-MS）中，會出現[M+Cl]－、[M－H]－等離子峰[24-26]。化合物Ⅰ的一、二級質譜圖見圖7（A、B、C），在ESI+-MS圖中離子峰m/z 897.4為[M+Na]+峰，m/z 913.3為[M+K]+峰，在ESI-MS圖中，m/z 873.4為準分子離子峰[M－H]－，m/z 909.3為[M+Cl]－峰，說明化合物Ⅰ的相對分子質量為874.4。繼續對m/z 873.4離子進行二級質譜分析，碎片離子m/z 271.0[M－H－162－132－162－146]－為[M－H]－脫去4 個糖配基的產物，m/z 753.1[M－H－120]－為[M－H]－通過逆狄爾斯-阿德爾（Retro Diels-Alder，RDA）裂解反應脫去B環產生，此碎片說明該分子母核B環上有—OH取代，另有m/z 150.8的碎片離子，這與柚皮素的裂解規律一致[27-28]，聯系該物質的紫外吸收光譜，推測其可能為苷元為柚皮素的四糖苷。此外，在ESI-MS-MS圖譜中，碎片離子m/z 710.2[M－H－162]－為[M－H]－脫去一分子葡萄糖基的產物，碎片離子m/z 577.2[M－H－162－132－H]－為m/z 710.2脫去一分子吡喃木糖基的產物。結合文獻[7]推斷該物質為柚皮素-7-O-[β-D-吡喃木糖基（1→6）] [β-D-葡萄糖基（1→3）-α-L-鼠李糖基（1→2）]-β-D-葡萄糖苷（naringenin-7-O-[β-D-xylopyranosyl（1→6）] [β-D-glucopyranosyl（1→3）-α-L-rhamnopyranosyl（1→2）]-β-D-glucopyranoside）。

圖7 化合物Ⅰ的一級（A、B）、二級（C）質譜圖及紫外吸收光譜圖（D）Fig.7 Primary (A, B) and secondary (C) MS spectra as well as ultraviolet (UV) spectrum (D) of compound Ⅰ

2.2.3.2 化合物Ⅱ的結構分析

化合物Ⅱ的一、二級質譜圖見圖8（A、B、C），在ESI+-MS圖中離子峰m/z 735.3為[M+Na]+峰，m/z 751.3為[M+K]+峰，在ESI-MS圖中，m/z 711.2為準分子離子峰[M－H]－，m/z 747.1為[M+Cl]－峰，說明化合物Ⅱ的相對分子質量為712.2。繼續對m/z 712.2離子進行二級質譜分析，碎片離子m/z 271.0[M－H－132－162－146]－為[M－H]－脫去3 個糖配基的產物，m/z 591.2[M－H－120]－為[M－H]－通過RDA裂解反應脫去B環產生，此碎片說明該分子母核B環上有－OH取代，另有m/z 150.8和119.1的碎片離子，這與柚皮素的裂解規律一致[27-28]，聯系該物質的紫外吸收光譜，推測其可能為苷元為柚皮素的三糖苷。此外，在ESIMS-MS圖譜中，碎片離子m/z 458.7[M－H－120－132]－為m/z 591.2脫去一分子吡喃木糖基的產物。結合文獻[7]，推測其結構為柚皮素-7-O-α-L-鼠李糖基（1→2）-[β-D-吡喃木糖基（1→6）]-β-D-葡萄糖苷（aringenin-7-O-α-L-rhamnopyranosyl（1→2）-[β-D-xylopyranosyl（1→6）]-β-D-glucopyranoside）。

圖8 化合物Ⅱ的一級（A、B）、二級（C）質譜圖及紫外吸收光譜圖（D）Fig.8 Primary (A, B) and secondary (C) MS spectra as well as UV spectrum (D) of compound Ⅱ

2.2.3.3 化合物Ⅲ的結構分析

化合物Ⅲ的一、二級質譜圖見圖9，在ESI+-MS圖中離子峰m/z 765.0為[M+Na]+峰，m/z 781.2為[M+K]+峰，在ESI－-MS圖中，m/z 741.3為準分子離子峰[M－H]－，m/z 777.3為[M+Cl]－峰，說明化合物Ⅲ的相對分子質量為742.3。繼續對m/z 741.3離子進行二級質譜分析，碎片離子m/z 271.0[M－H－162－162－146]－為[M－H]－脫去3個糖配基的產物，m/z 621.3[M－H－120]－為[M－H]－通過RDA裂解反應脫去B環產生，此碎片說明該分子母核B環上有－OH取代，另有m/z 151.0的碎片離子，這與柚皮素的裂解規律一致[27-28]，聯系該物質的紫外吸收光譜，推測其可能為苷元為柚皮素的三糖苷。此外，在ESI－-MS-MS圖譜中，碎片離子m/z 579.2[M－H－162]－為[M－H]－脫去一分子葡萄糖基的產物，碎片離子m/z 433.1[M－H－162－146]－為m/z 579.2脫去一分子鼠李糖基的產物。結合文獻[7]，推測其結構為柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖基（1→3）-α-L-鼠李糖基（1→2）-β-D-葡萄糖苷（naringenin-7-O-β-D-glucopyranosyl（1→3）-α-L-rhamnopyranosyl（1→2）-β-D-glucopyranoside）。

圖9 化合物Ⅲ的一級（A、B）、二級（C）質譜圖及紫外吸收光譜圖（D）Fig.9 Primary (A, B) and secondary (C) MS spectra as well as UV spectrum (D) of compound Ⅲ

圖10 化合物Ⅳ的一級（A、B）、二級（C）質譜圖及紫外吸收光譜圖（D）Fig.10 Primary (A, B) and secondary (C) MS spectra as well as UV spectrum (D) of compound Ⅳ

2.2.3.4 化合物Ⅳ的結構分析

化合物Ⅳ的一、二級質譜圖見圖10（A、B、C），在ESI+-MS圖中離子峰m/z 589.2為[M+Na]+峰，m/z 605.2為[M+K]+峰，在ESI－-MS圖中，m/z 565.2為準分子離子峰[M－H]－，m/z 601.2為[M+Cl]－峰，說明化合物Ⅳ的相對分子質量為566.2，繼續對m/z 565.2離子進行二級質譜分析，產生碎片離子m/z 271.0為[M－H－132－162]－離子，另有m/z 151.1、176.9、119.0的碎片離子，這與柚皮素的裂解規律一致[27-28]，聯系紫外吸收光譜，推測其可能為柚皮素的二糖苷。此外，在ESI-MS中還得到m/z 435.2的碎片離子，表明該物質的外側糖基可能為木糖。結合文獻[7]，推測其結構為柚皮素-7-O-β-D-吡喃木糖基（1→6）-β-D-葡萄（naringenin-7-O-β-D-xylopyranosyl（1→6）-β-D-glucopyranoside）。

3 結 論

通過考察12 種樹脂對茶葉籽總黃酮的吸附、解吸特性，綜合考慮吸附率、解吸率、靜態動力學等因素，HPD826樹脂有較高的吸附率和解吸率，適合用來純化茶葉籽總黃酮。對影響HPD826樹脂吸附解吸的各因素進行了系統研究，最終確定最佳條件為：上樣液質量濃度為1.8 mg/mL、上樣流速2 mL/min、體積分數50%的乙醇作為洗脫劑、洗脫劑流速1 mL/min。此條件下的洗脫曲線峰形對稱，分離較為完全。樣品純化后的茶葉籽黃酮純度為40.81%，比純化前提高了7.63 倍，說明HPD826樹脂純化效果較好。通過HPLC-MS對茶葉籽黃酮做了分析，初步確定茶葉籽中的4 種黃酮結構，均為柚皮素的多糖苷。

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Purification of Total Flavonoids from Tea (Camellia sinensis L.) Seeds and Composition Analysis by HPLC-MS

YANG An-qi, Lü Li-shuang, WANG Hua-qing, LI Jian-lin, ZHENG Tie-song*
(Department of Food Science and Nutrition, Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

HPD826 resin was selected to purify flavonoids from tea seeds and the optimum chromatographic conditions were determined as follows: sample concentration 1.8 mg/mL, sample loading flow rate 2 mg/mL, and 50% ethanol as the eluent at a flow rate of 1 mL/min. Under these conditions, the purity of flavonoids from tea seeds was increased 7.63 times to 40.81% compared with that before optimization. The composition and structures of the extracted flavonoids were analyzed by HPLC-MS. The four flavonoid compounds purified from tea seeds were all characterized as aglycon naringenin.

tea seed; total flavonoids; purification; high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS)

TS201.2

A

1002-6630（2014）24-0228-07

10.7506/spkx1002-6630-201424044

2014-06-26

江蘇省自然科學基金項目（BK2012850）；江蘇省高校自然科學研究項目（12KJB5500005）；

浙江省自然科學基金項目（LY12C15001）

楊安琪（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品化學與加工。E-mail：yanganqi91528@163.com

*通信作者：鄭鐵松（1963—），男，教授，博士，研究方向為食品生物化學。E-mail：tiesongzheng@sina.com