實時熒光聚合酶鏈式反應法檢測食品中貓源性成分

高曉麗，楊昕霆，王 丹，趙琳娜，陳吉漢，侯彩云,*

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室，北京 100083；2.北京市食品安全監控中心，北京 100041）

實時熒光聚合酶鏈式反應法檢測食品中貓源性成分

高曉麗1，楊昕霆2，王 丹2，趙琳娜2，陳吉漢1，侯彩云1,*

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，教育部-北京市共建功能乳品重點實驗室，北京 100083；2.北京市食品安全監控中心，北京 100041）

根據貓線粒體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化還原酶亞基1（ND1）基因中的保守序列設計貓特異性引物和TaqMan探針，建立食品中貓源性成分的實時熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法。通過實時熒光PCR反復驗證，結果表明，引物和TaqMan探針對貓源性成分的特異性良好，檢測靈敏度可達1 pg，適用于食品中貓源性成分的快速鑒定。通過對隨機抽取的市售肉制品的檢測，尚未發現摻有貓源性成分的行為。

實時熒光聚合酶鏈式反應；線粒體ND1基因；貓源性成分

動物源性食品由于其富含蛋白質、脂肪、維生素和礦物質等營養成分，在日常飲食中所占的比例越來越大。但是，國內外不斷報道的食品安全問題，尤其是肉制品的摻假摻雜，不僅嚴重侵害了消費者的健康和權益，同時直接影響到國家的形象、社會的和諧發展以及政府的公信力[1]，甚至因宗教因素導致的民族矛盾。因此，有必要建立快速、準確、高效的食品中動物源性成分篩查方法，對未知成分的動物源性食品進行快速篩查。

目前，國內外學者主要利用以實時熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）為基礎的檢測技術對動物源性物種成分的鑒定進行研究，大量報道了普通PCR和實時熒光PCR法檢測食品中豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、火雞肉、馬肉、驢肉、駱駝等常見的肉類物種[2-15]，以及食品中鳥類、魚類的檢測[16-19]。與普通PCR相比，實時熒光PCR法特異性強、靈敏度高、準確性好；反應過程中反應管保持封閉，大大減少了外來污染；擴增產物無需電泳，檢測自動化程度較高，分析快速，能同時進行多個物種的高效篩選；能夠實時監測每個擴增循環，可實現定性、定量檢測。因此，實時熒光PCR技術被認為是肉品鑒定中最有潛力的分子學檢測工具[20]。

國內外雖有大量PCR法檢測肉制品中物種成分的研究報道，但針對貓源性成分鑒定的還不多。Martín等[20]建立了食品和飼料中貓、狗、鼠源性成分鑒定的普通PCR方法，檢測限為0.1%。國內僅有張舒亞等[21]以12S rRNA為靶標設計了引物和TaqMan探針，建立了食品和飼料中貓源性成分的實時熒光PCR檢測方法，可檢出動物和植物材料基質中0.01%的貓源性成分。尚未有針對貓線粒體ND1基因為靶標的實時熒光PCR方法，而動物線粒體ND1基因進化速率快[14]，可以更好地與其他物種進行區分。因此，本研究設計了貓線粒體ND1基因特異性引物和TaqMan探針，建立了食品中貓源性成分的實時熒光PCR檢測方法，實現快速、高效、準確地檢測肉制品中的物種成分，從而為保障食品質量安全、打擊摻假摻雜違法行為提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、鵪鶉肉、兔肉等動物材料購自北京市農貿市場或超市；駱駝肉、馬肉、驢肉、鹿肉、狗肉、貓肉等動物材料為實驗室自存。15 個牛羊肉串樣品購自北京市農貿市場。

Tris-平衡酚、氯仿（三氯甲烷）、無水乙醇、異丙醇、乙酸鈉均為國產分析純；十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）提取緩沖液（20 g/L CTAB、1.4 mol/L NaCl、0.02 mol/L Na2EDTA、0.1 mol/L Tris-HCl、pH 8.0）、Tris -乙二胺四乙酸緩沖液（Tris-ethylene diamine tetra-acetic acid buffer，TE）（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA）由本實驗室配制；實時熒光PCR預混合液（Premix Ex TaqTM） 寶生物工程（大連）有限公司；貓ND1基因序列特異的上下游引物、TaqMan探針，由北京賽百盛基因技術有限公司合成。

1.2 儀器與設備

QIA Cube核酸自動提取儀 美國QIA Gene公司；核酸蛋白定量分析儀 德國Eppendorf公司；MyiQ單色實時定量PCR儀 美國伯樂公司；3K18冷凍離心機 德國Sigma公司；Biomedical freezer超低溫冰箱（－40 ℃）日本Sanyo公司；Mili-Q純水器 美國Milipore公司。

1.3 方法

1.3.1 動物組織DNA的提取

用滅菌手術剪分別剪取一定量的豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、鵪鶉肉、兔肉、駱駝肉、馬肉、驢肉、鹿肉、狗肉、貓肉的肌肉組織，剪碎置于研缽中（注意防止交叉污染）；加入石英砂，用液氮充分研磨至粉末狀，迅速取2 g左右于2.0 mL離心管中，立即加入1 mL CTAB，混勻；置于核酸自動提取儀中加熱振蕩，消化30 min；離心取600 μL上清液于新的2.0 mL離心管中，加入等體積的氯仿和Tris-平衡酚各300 μL，用力振蕩5 min，使其充分反應，12 000 r/min室溫離心10 min；取上清液，加入600 μL氯仿，同上，12 000 r/min室溫離心10 min；取上清液，加10%體積3 mol/L乙酸鈉和2 倍體積無水乙醇，輕緩顛倒數次，可見白色絮狀DNA，12 000 r/min室溫離心10 min，棄上清液；加入1 mL 70%乙醇洗滌沉淀2 次，12 000 r/min室溫離心10 min，棄乙醇；待DNA沉淀干燥后，將DNA溶于50～100 μL TE溶液或無菌水中；核酸蛋白定量分析儀測定濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，置于4 ℃冰箱備用，或于－20 ℃保存。

1.3.2 實時熒光PCR引物與TaqMan探針的設計

根據GenBank基因數據庫已發表的貓（Felis silvestris catus）線粒體序列（Accession NO：NC_001700，GI：5835205）和豬、牛、山羊、綿羊、雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉、兔、駱駝、馬、驢、鹿、狗的線粒體序列，分析生物進化樹的規律，使用DNAMAN軟件比對以上基因序列，尋找種內保守、種間差異較大的基因片段。應用Primer Express軟件對各物種選取的特定序列進行引物、TaqMan探針的設計。最終設計的引物和探針經過BLAST比對，進一步驗證引物和探針的特異性。本研究最終選取貓ND1基因序列設計了貓特異性引物和探針，既可以保證種內保守，又能保證種間特異。擴增產物長度為100 bp左右。

1.3.3 引物和TaqMan探針的驗證

以貓肉線粒體DNA為陽性對照，豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、鵪鶉肉、兔肉、駱駝肉、馬肉、驢肉、鹿肉、狗肉的線粒體DNA為陰性對照。DNA模板的質量濃度均稀釋至100 ng/μL，分別加入貓線粒體ND1基因特異性引物、TaqMan探針，以驗證特異性，空白對照中以無菌水代替DNA模板。實時熒光反應體系為20 μL，具體包括： Premix Buffer（2×）10 μL、上游引物（10 μmol/L）0.5 μL、下游引物（10 μmol/L）0.5 μL、TaqMan探針1 μL、DNA 模板1 μL、無菌水將體系補充至總體積20 μL。實時熒光PCR擴增條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環；72 ℃延伸10 min。

在實時熒光PCR檢測方法中，Ct值是指每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數。以Ct值35為界限，根據實時熒光PCR儀所得的Ct值來驗證引物與探針對貓源性成分的特異性。

為檢測方法的靈敏度，將貓肉基因組DNA溶液分別稀釋為100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.000 01 ng/μL，各個質量濃度進行3 次重復實驗，設置空白對照。根據各梯度的擴增曲線，建立Ct值-模板DNA質量濃度對數值的標準曲線，用于貓源性成分的靈敏度檢測。

1.3.4 市售肉制品中貓源性成分的檢測

從北京超市和農貿市場中隨機取樣15 個羊肉串，檢驗是否摻雜貓肉。首先提取所有的羊肉串樣本DNA，然后按照實時熒光反應體系，設置陽性對照、陰性對照和空白對照，進行實時熒光PCR反應。

2 結果與分析

2.1 利用設計的引物進行普通PCR產物的測序結果

利用本研究設計的引物對貓肉DNA以及豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、鵪鶉肉、兔肉、駱駝肉、馬肉、驢肉、鹿肉、狗肉進行普通PCR反應，通過DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，只擴增了貓肉基因組DNA。將貓肉DNA擴增產物送往上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。利用GenBank中的BLAST功能對測序結果進行同源性搜索，結果只出現了一條貓基因序列的比對信息，同源性為93%，由此可以確定物種的真實性。而且，DNA質量能夠保證實時熒光PCR的正常進行，這與實驗預期相符合，可以進一步進行TaqMan實時熒光PCR。測序比對結果見圖1。

圖1 貓源性成分PCR產物的測序結果Fig.1 Sequencing of PCR products of feline DNA

2.2 引物和TaqMan探針的特異性檢測結果

引物和TaqMan探針是以貓線粒體ND1基因為靶序列所設計的。實驗表明，豬肉、牛肉、山羊肉、綿羊肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子肉、鵪鶉肉、兔肉、駱駝肉、馬肉、驢肉、鹿肉、狗肉等動物材料DNA模板和空白對照所擴增的曲線Ct值均大于40，而貓肉DNA擴增曲線的Ct值為17。說明該體系對貓源性成分的檢測具有良好的特異性。特異性實驗擴增曲線如圖2所示。

圖2 貓引物探針實時熒光PCR的特異性檢測結果圖Fig.2 Specificity of real-time PCR for detection of cat-derived components

2.3 靈敏度檢測結果

對貓肉基因組不同梯度的DNA溶液進行實時熒光PCR檢測（表1），其中，100、10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL的DNA模板均有擴增，且Ct值在35之內，0.000 1 ng/μL質量濃度的擴增曲線Ct值略大于35，而0.000 01 ng/μL質量濃度的貓肉DNA未出現擴增。因此可知，貓源性成分的引物、TaqMan探針檢測靈敏度為1 pg（0.001 ng/μL，相當于0.001%）。當實時熒光PCR反應處于指數期階段，所有DNA模板的反應效率穩定且近似相等，DNA質量濃度的對數值與到達閾值時的循環數Ct值呈線性關系。為檢測實時熒光PCR法的靈敏度及其線性范圍關系，建立Ct值-模板DNA質量濃度對數值的標準曲線，見圖3。由圖3可知，該曲線線性相關度良好，R2為0.999，靈敏度可低至1 pg。根據PCR擴增效率計算公式，擴增效率/% =（－1+10[-1/slope]）×100，其中slope為斜率，可得PCR擴增效率是96%。

表1 貓DNA引物、探針體系的靈敏度檢測結果Table 1 Sensitivity obtained with the species-specific primer-probe sets for detection of cat-derived components

2.4 市售食品中貓源性成分檢測

為進一步驗證貓引物探針體系的實際應用能力，對市場上抽檢的15 個羊肉串進行是否摻雜貓源性成分的鑒定。結果顯示，陽性對照的擴增曲線正常，陰性對照未擴增曲線，檢樣也未出現擴增曲線，表明15 個羊肉串中不含貓源性成分。

3 討 論

實時熒光PCR檢測方法由于其靈敏度、準確性、重復性參數上具有無可比擬的優勢[23]，因而得到了廣泛的應用。在實時熒光PCR法的檢測中，國內外學者主要以線粒體cytb、D-loop、12S rRNA、16S rRNA等基因作為靶序列來設計引物和TaqMan探針，主要是因為線粒體DNA是高等動物唯一的核外遺傳物質，是檢測中比較理想的靶基因，而且細胞中均含有大量的線粒體。本研究通過大量篩選貓線粒體中的不同基因，并將設計的引物和探針序列在NCBI的BLAST中搜索、比對，最終在貓線粒體ND1基因位點上，發現既可以保證種內保守，又可保證種間特異的引物和探針序列，從而建立了針對貓源性成分的實時熒光PCR定性檢測方法。該方法可以很好地特異性擴增出目標產物，常見的畜禽類物種DNA模板均未擴增，Ct值-模板DNA質量濃度對數值標準曲線的線性關系良好（R2≥0.990），靈敏度可達1 pg，PCR擴增效率為96%。

動物的不同組織中線粒體數量有區別，比如，心臟和肝臟等組織的線粒體就多于普通肌肉組織，或加工程度不同可能會導致熒光PCR定量結果的偏差，只能判斷大致含量，但定性結果可靠。本實驗中，貓線粒體DNA在提取后，需反復實驗來驗證結果，若DNA多次反復凍融容易降解，所以應該及時進行實時熒光PCR的反復驗證實驗，減少由于DNA的降解對實驗結果造成假陰性的影響。

總之，本研究建立的針對貓源性成分的實時熒光PCR定性檢測方法特異性良好、靈敏度較高、重復性好、實用性強。這對食品中貓源性成分摻假摻雜的檢測具有重要意義，可作為食品中貓源性成分檢測方法之一，同時為保障食品安全、打擊摻假的違法行為提供技術參考。

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Detection of Cat-Derived Components in Foods by Real-Time Polymerase Chain Reaction

GAO Xiao-li1, YANG Xin-ting2, WANG Dan2, ZHAO Lin-na2, CHEN Ji-han1, HOU Cai-yun1,*
(1. Key Laboratory of Functional Dairy, Co-constructed by Ministry of Education and Beijing Municipality, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China; 2. Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring, Beijing 100041, China)

In this study, a TaqMan-based, sensitive and specific real-time polymerase chain reaction (PCR) assay was developed for the detection of cat-derived components in foods. Primers and TaqMan probe were designed based on the conserved sequence of the feline mitochondrial ND1, and the performance of the method was invalidated. Results indicated that no cross-reaction was observed between the feline and non-target species, and this method revealed a high sensitivity and could detect 1 pg of cat template DNA. In conclusion, the TaqMan probe assay used in this study can be a rapid and sensitive method for the routine identification of meat species in foods.

real-time PCR; mitochondrial ND1; cat-origin component

TS201.6

A

1002-6630（2014）24-0235-04

10.7506/spkx1002-6630-201424045

2014-03-17

北京市科技計劃課題（Z131100005613005）

高曉麗（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品質量安全檢測。E-mail：xiaoligao606@163.com

*通信作者：侯彩云（1963—），女，教授，博士，研究方向為食品科學與加工技術。E-mail：cyhou@cau.edu.cn