固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法測定牛乳和豬肉中5 種青霉素類抗生素

劉莉萍

（深圳職業技術學院，廣東 深圳 518055）

固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法測定牛乳和豬肉中5 種青霉素類抗生素

劉莉萍

（深圳職業技術學院，廣東 深圳 518055）

建立一種用固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法檢測牛乳和豬肉中芐星青霉素G、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林5種青霉素類抗生素方法。樣品經乙腈提取，Bond Elut C18固相萃取柱凈化，用高效液相色譜-串聯質譜檢測，外標法定量。結果表明，本方法5 種青霉素在2.0～200 μg/L范圍內呈良好線性關系，線性相關系數大于0.999；牛乳樣品添加回收實驗，回收率為85.2%～122.7%，相對標準偏差為3.43%～16.8%（n=6）；豬肉樣品添加回收實驗在50 μg/kg和100 μg/kg添加水平，除氨芐西林外，回收率在94.3%～116.4%，相對標準偏差為1.62%～5.09%（n=6）。方法定量限為1.0～2.0 μg/kg。該方法具有簡便快捷、準確度高、定量限低的優點，適用于牛乳和豬肉中青霉素類抗生素的測定。

固相萃取；高效液相色譜-串聯質譜；青霉素；牛乳；豬肉

青霉素類抗生素主要用于治療革蘭氏陽性菌引起的各種感染，因高效低毒，成本低，在畜禽中廣泛應用。據文獻[1]報道，青霉素可產生各種過敏反應，嚴重的會引發過敏性休克，同時還能產生耐藥性，對人體健康造成嚴重危害。因此世界各國對青霉的最大殘留量（maximum residue limits，MRL）均提出了限量要求[2-3]，我國農業部規定食用動物組織中氨芐青霉素的MRL均為50 μg/kg；美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）規定青霉素類抗生素在各類農產品中的MRL不超過5 μg/kg。青霉素類抗生素的分析方法主要有微生物法[4]、免疫分析法[5-7]、電化學分析法[8]、光學分析法[9-11]、毛細管電泳法[12]、高效液相色譜法[13-14]和液相色譜-質譜聯用法[15-22]，其中高效液相色譜-質譜聯用因可彌補其他方法準確定性、高靈敏檢測的困難，而成為國際上廣泛采用的青霉素類抗生素分析方法。本實驗采用固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜（solid-phase extraction and high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，SPE-HPLC-MS-MS）法同時檢測牛乳和豬肉中青霉素類抗生素殘留，方法簡便快捷、定量限低，完全能滿足獸殘分析要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純）；磷酸二氫鈉、正己烷、磷酸、氫氧化鈉、乙酸銨、氯化鈉（均為分析純）。

青霉素類抗生素標準品：氯唑西林、雙氯西林、芐星青霉素G、氨芐西林和苯唑西林（純度為96%～99%）德國Riedel-Dehaen公司；芐青霉素-D7德國Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設備

API 3000液相色譜-質譜儀（配有電噴霧離子源和1100高效液相色譜儀） 美國應用生物系統公司；LV型吹氮濃縮儀 美國Zymark公司；Minishaker MS1型旋渦混合器 德國IKA公司；UNIVERSAL 32R型低溫離心機 德國Hettich公司；4000旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司；TF-123組織切碎機 日本Hitachi公司；POLYGRON PT3000型均質器 德國Brinkmann公司；Bond Elut C18固相萃取柱（500 mg，6 mL） 美國Varian公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

0.15 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 8.5）：準確稱取0.018 g磷酸二氫鈉，用去離子水溶解，并使溶液總體積達到約950 mL，然后用磷酸或氫氧化鈉溶液調節pH值至8.5，用去離子水定容至1 000 mL。

1∶1乙腈溶液：500 mL乙腈與500 mL去離子水等體積混合。

標準貯備溶液（100 mg/L）：分別稱量經折算相當于10 mg（精確到0.1 mg）的各種青霉素標準品，用乙腈-水（50∶50，V/V）溶液溶解，定容至100 mL。此溶液各種青霉素質量濃度分別為100 mg/L。溶液可在－18 ℃條件下避光保存6 個月。

標準使用溶液（1 mg/L）：準確吸取1.00 mL標準貯備溶液至100 mL容量瓶中，用乙腈-水（50∶50，V/V）溶液定容。此溶液各種青霉素質量濃度分別為1 mg/L。溶液可在4 ℃條件下避光保存1 個月。

標準工作溶液：用20 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.0）配制質量濃度分別為0、5、10、50、100、200 μg/L青霉素標準工作溶液（現用現配）。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：SunFireTMC18（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；流速0.3 mL/min；流動相A為乙腈，流動相B為5 mmol/L乙酸銨溶液（pH 4.5），梯度洗脫程序：0～10.0 min，5%～80% A；10.0～11.0 min，80%～90% A；11.0～12.0 min，90% A；12.0～13.0 min，90%～5% A；13.0～18.0 min，5% A。

1.3.3 質譜條件

電噴霧離子源；正離子掃描；多反應監測；噴霧電壓：4 000 V；離子源溫度：450 ℃；霧化氣流量：11.00 L/min；氣簾氣流量：11.00 L/min；碰撞氣流量：5.00 L/min；射入電壓：10.00 V。其他質譜參數見表1。

表1 5種青霉素類抗生素的質譜分析參數Table 1 Mass spectrometric parameters for analysis of 5 penicillins

1.3.4 樣品處理

1.3.4.1 豬肉試樣

取代表性豬肉樣品（應盡量避免取脂肪部分），用組織切碎機攪碎，均質處理。準確稱取均質良好的樣品2 g（精確到0.01 g）于15 mL具塞離心管中，加入芐青霉素-D7內標50 μg/kg，再加入2 mL磷酸緩沖溶液（50 mmol/L）和8 mL乙腈，渦旋2 min，在低于10 ℃條件下2 500×g離心10 min。上層清液轉移到另一干凈的50 mL具塞離心管中，分別加入8、5 mL乙腈進行提取，合并提取液。

1.3.4.2 牛乳試樣

準確取5 mL牛乳樣品于50 mL具塞離心管中，稱量和記錄其質量。加入內標芐青霉素-D74 μg/kg，再加入5 mL 磷酸緩沖溶液（50 mmol/L）和30 mL乙腈，渦旋2 min，在低于10 ℃條件下2 500×g離心10 min。取20 mL上清液到另一個干凈的50 mL具塞離心管中，注意不要混入析出的乳脂肪。

1.3.5 樣品的凈化

在提取液中加入10 mL正己烷，渦旋2 min，以5 000 r/min離心5 min，去除上層有機相，正己烷重復去脂一次。于45 ℃水浴旋蒸至約5 mL，加入5 mL 0.15 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 8.5），混合均勻。

取Bond Elut C18固相萃取柱，依次用3 mL甲醇、3 mL水處理和3 mL磷酸緩沖溶液平衡。當溶劑液面達到小柱吸附層表面時，立即將上述提取液加入萃取柱中（以1 mL/min流速），依次用3 mL 50 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 8.0）和3 mL水洗柱，最后用3 mL乙腈-水（1∶1，V/V）洗脫，定容至5.0 mL。過0.22 μm濾膜供HPLC-MS-MS分析。

2 結果與分析

2.1 提取液的選擇

選擇去離子水、4%氯化鈉溶液和磷酸二氫鈉緩沖液（0.15 mol/L）作為提取液，5 種青霉素測定回收率實驗，結果見表2。

表2 不同提取液對5 種青霉素回收率的影響Table 2 Effects of different extractants on recoveries of 5 penicillins %

由表2可見，選擇去離子水和4%氯化鈉溶液作為提取液時，氨芐西林的回收率小于30%，其他4 種青霉素的回收率均在87%～101%之間，故此應選用磷酸二氫鈉緩沖液作為5種青霉素提取液。

由于磷酸二氫鈉緩沖溶液濃度和pH值對氨芐西林回收率的影響較大，分別比較磷酸二氫鈉濃度和pH值對氨芐西林回收率的影響，見表3。

表3 不同濃度磷酸二氫鈉緩沖溶液和pH值對氨芐西林回收率的影響Table 3 Effect of buffer concentration and pH on recoveries of ampicillins

由表3可見，磷酸二氫鈉濃度在0.03～0.1 mol/L之間，回收率和重復性不好；當磷酸二氫鈉濃度大于0.17 mol/L時，峰形變寬，流速減慢。本方法選擇0.15 mol/L的磷酸二氫鈉緩沖溶液作為提取液，pH值為8.5。

2.2 固相萃取柱及洗脫條件的選擇

2.2.1 固相萃取柱的選擇

分別選用Oasis HLB固相萃取柱、Bond Elut C18固相萃取柱、ENVI-18固相萃取柱、Octadecyl C18固相萃取柱、LiChrolut EN固相萃取柱和Sep-Pak C18固相萃取柱對5 種青霉素類抗生素的提取效率和凈化效果進行比較，結果表明：Bond Elut C18固相萃取柱提取效率和凈化效果較好，重復性好；ENVI-18固相萃取柱、Octadecyl C18固相萃取柱、LiChrolut EN固相萃取柱和Oasis HLB固相萃取柱回收率均良好，但樣品溶液過柱速度較慢，樣品預處理時間長，不同批次之間回收率有顯著差異；Sep-Pak C18固相萃取柱回收率小于60%，凈化效果不理想。本方法選用Bond Elut C18固相萃取柱凈化樣品。

2.2.2 洗脫條件的選擇

本方法選用乙腈-水（1∶1，V/V）為固相萃取樣品洗脫劑，比較不同用量洗脫劑對5 種青霉素回收率的影響，見表4。

表4 乙腈-水洗脫劑用量對5種青霉素回收率的影響Table 4 Effect of elution with different amounts of acetonitrile-water on recoveries of 5 penicillins%

由表4可見，當洗脫劑用量小于3 mL時，氨芐西林的回收率偏低，其他4 種青霉素的回收率為82.0%～94.0%；當洗脫劑用量為3 mL時，5種青霉素回收率為95.6%～102.2%，滿足工作要求。洗脫劑用量為4 mL時，5 種青霉素回收率沒有顯著提高。因此，本方法使用3 mL乙腈-水（1∶1，V/V）作為固相萃取柱的洗脫劑。

2.3 液相色譜分析柱的選擇

分別使用μBondapak C18（300 mm×4.0 mm，10 μm）色譜柱和SunFireTMC18（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）色譜柱對5 種青霉素分析進行比較。實驗發現，這兩種色譜柱的靈敏度均能滿足要求，但μBondapak C18色譜柱對氯唑西林分離度不如SunFireTMC18色譜柱好。μBondapak C18柱流速在1.5 mL/min時，進質譜儀之前必須分流，但分流時對5種青霉素結果的測定會產生一定誤差；而使用SunFireTMC18柱則不需分流，定量準確度優于μBondapak C18柱。本方法選用SunFireTMC18（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）色譜柱為5 種青霉素的分析柱。

2.4 線性范圍和方法定量限

配制含苯唑西林質量濃度為1.0～200 μg/L；芐星青霉素G、氨芐西林、氯唑西林、雙氯西林質量濃度分別為2.0～400 μg/L的樣品基質混合標準溶液。在選定的條件下進行測定，進樣量為20 μL，以各青霉素與芐青霉素-D7峰面積之比為縱坐標，各青霉素質量濃度為橫坐標進行線性回歸分析。采用空白樣品中添加青霉素抗生素的方法，以RSN不小于10的方法確定定量限，5 種青霉素的線性方程、相關系數和定量限見表5。

表5 5種青霉素線性方程、相關系數和定量限Table 5 Linear equations, correction coefficients and LOQs for 5 penicillins

2.5 方法的回收率和精密度

用空白樣品進行加標回收率和和精密度實驗，樣品中添加3 個不同水平的5 種青霉素后，按本方法提取和凈化，用HPLC-MS-MS進行測定，其回收率和精密度結果見表6。

表6 牛乳和豬肉中5 種青霉素加標回收率和精密度（n=6）Table 6 Recoveries and precision (RSDs) of 5 penicillins from spiked milk and pork (n = 6)

由表6可見，對于牛乳樣品，2、4 μg/kg和8 μg/kg添加水平5 種青霉素加標回收率在85.2%～122.7%之間，相對標準偏差均在3.43%～16.8%之間；對于豬肉樣品，5 μg/kg添加水平，5 種青霉素加標回收率均較低；50 μg/kg和100 μg/kg添加水平，除氨芐西林外，回收率為94.3%～116.4%，相對標準偏差均在1.62%～5.09%，符合獸藥殘留分析要求。

3 結 論

豬肉組織的基質非常復雜，其中的微量青霉素很難檢測。本實驗采用SPE-HPLC-MS-MS分析技術建立了牛乳和豬肉中5 種青霉素類抗生素殘留的檢測和確證方法，該方法適用于牛乳和豬肉中青霉素類抗生素的定量檢測。

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Determination of 5 Penicillin Residues in Milk and Pork by SPE-HPLC-MS-MS

LIU Li-ping
(Shenzhen Polytechnic, Shenzhen 518055, China)

A method was established for the determination of 5 penicillin residues in milk and pork by solid-phase extraction and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (SPE-HPLC-MS-MS). The samples were extracted with acetonitrile, purified on a Bond Elut C18column by solid-phase extraction, and finally detected by HPLC-MS-MS and quantified by an external standard method. As a result, the method showed a good linearity with a correlation coefficient higher than 0.999 in the range from 2.0 to 200 μg/L for 5 penicillin compounds. The average recoveries of these five penicillins in milk were in the range of 85.2% to 122.7% with relative standard deviations (RSDs) of 3.43% to 16.8% (n = 6). As for pork samples spiked at 50 and 100 μg/kg, the average recoveries were between 94.3% and 116.4% except for ampicillin with RSDs of 1.62% to 5.09%. The limit of quantification (LOQ) was in the range of 1.0–2.0 μg/kg. In conclusion, the method is convenient, rapid, accurate and sensitive so that it can be applied to determinate penicillin residues in milk and pork.

solid-phase extraction; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS-MS); penicillins; milk; pork

TS207.3

A

1002-6630（2014）24-0308-04

10.7506/spkx1002-6630-201424059

2014-02-24

劉莉萍（1962—），女，高級工程師，碩士，研究方向為食品安全檢測。E-mail：maryliu@szpt.edu.cn