超高壓處理對僵直前獺兔肉品質及微觀結構的影響

王穩航，徐倩倩，劉 婷，魯冬雪，李 茜，趙文萍

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

超高壓處理對僵直前獺兔肉品質及微觀結構的影響

王穩航，徐倩倩，劉 婷，魯冬雪，李 茜，趙文萍

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

以僵直前獺兔肉為原料，在室溫（25 ℃）條件下，分別用100、200、400 MPa超高壓處理15 min，-8 ℃貯存24 h，然后對兔肉進行品質分析和超微結構研究。結果表明：隨著壓力的升高，兔肉亮度（L*）值升高，紅度（a*）值降低，兔肉顏色由淺紅色逐漸變為灰白；隨著壓力的升高兔肉蒸煮損失率、滴水損失率呈現先下降后上升的趨勢，在200 MPa時兔肉的蒸煮損失率、滴水損失率最低，分別為31.54%和2.61%；超高壓對兔肉嫩度影響顯著（P＜0.05），在0.1～200 MPa之間，剪切力隨壓力增大而降低，而400 MPa處理時，兔肉剪切力急劇升高并顯著高于對照組（0.1 MPa）；100 MPa壓力處理，兔肉組織結構與對照組相比變化不大，而400 MPa時兔肌肉顯微組織結構變化明顯：肌節收縮，肌纖維歪曲、片段化，蛋白質發生解聚、三級結構遭到破壞。可見，不同的超高壓對僵直前獺兔肉的品質和微觀結構有顯著影響，且200 MPa是最適于僵直前兔肉處理的超高壓條件。

超高壓；僵直前；兔肉；品質；微觀結構

隨著社會的發展，人們對肉制品種類的要求越來越多，對肉制品安全、營養的要求也越來越高。超高壓技術（ultra high pressure，UHP）作為一種新興的物理處理技術，在肉制品中的應用受到廣泛的關注[1]。食品超高壓技術是將食品原料密封包裝后，利用100 MPa及以上的靜水壓力（常用的壓力范圍為100～1 000 MPa），在常溫或一定溫度下處理食品一定時間，從而引起食品成分、非共價鍵（氫鍵、離子鍵和疏水鍵等）的破壞或形成，使食品中的蛋白質、酶、淀粉等生物高分子物質分別失活、變性和糊化，并殺死食品中的微生物，從而達到食品滅菌保藏和加工的目的[2-3]。

超高壓技術在肉品加工中的應用主要目的是改善肉品品質[4]。超高壓對肉類品質的改善主要包括：提高肉的嫩度[5]、改善肉的顏色[6]、增加肉的凝膠性和乳化性[7]、殺死肉中的細菌、延長肉制品的保質期[8]等。此外超高壓還能改變肌肉的微觀結構，使肌動球蛋白在壓力作用條件下解聚。Macfarlane等[9]研究發現150 MPa的超高壓處理條件可以提高羊肉肌纖維蛋白的溶解性。有研究證明鮮肉在僵直前進行100～200 MPa的超高壓處理對肉質嫩化有顯著效果；而對僵直發生后的肉進行100～200 MPa超高壓處理，在溫度低于30 ℃時其剪切力、嫩度和多汁性都沒有改善[4]。隨著超高壓技術的發展，其在肉制品加工中應用也越來越廣泛，但是超高壓對肉品質的研究主要集中在牛肉、羊肉、豬肉等幾種肉類[10-12]，對兔肉品質影響的研究卻十分鮮見。

我國是世界上最大的兔肉生產、出口國，兔肉由于具有高蛋白、高賴氨酸、高消化率、高磷脂、低熱量、低脂肪、低膽固醇等特點[13]，深受消費者喜愛。近年來，國內外學者在兔肉肉質特性方面開展了大量的研究，研究結果揭示了兔肉獨特的加工品質和營養價值[14]。本實驗以僵直前獺兔作為研究對象，通過不同壓力超高壓處理各組樣品，研究超高壓對僵直前獺兔肉品質的影響，旨在為超高壓在兔肉加工方面的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獺兔 天津動物所實驗研究中心。

考馬斯亮藍（分析純） 上海科星實驗室設備有限公司；蘇木精（分析純） 美國Amreso公司；丙烯酰胺（分析純）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，分析純）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS，化學純）北京索萊寶公司；戊二醛、冰醋酸、無水乙醇、氯化鈉（均為分析純） 天津市江天化工技術有限公司；標準分子質量蛋白 北京康為世紀試劑公司；伊紅（優級純） 上海三愛思有限公司。

1.2 儀器與設備

HPP-L3型超高壓設備 天津市華泰森淼生物技術有限公司；PHS-3C型pH計 上海理達儀器廠；ST40R冷凍離心機 美國Thermo Fisher科技有限公司；XSZ-H型生物顯微鏡 重慶光電儀器總公司；冷凍切片機（CM1900號） 德國Leica公司；SU1510SU1510型掃描電子顯微鏡 日本Hitacahi公司；CIE-LAB全自動色差計 日本Minolta公司；JY600C型電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肉樣制備與處理

獺兔購回后緩養12 h，屠宰前稱質量。參考范成強等[15]的屠宰方法，應用頭部電擊（90 V，160 Hz）的方式將獺兔擊暈，倒掛割脖放血，然后從后腿腳跟處開始剝皮。取兔肉，去除可見的結締組織和脂肪，將兔肉放入聚乙烯塑料袋，排除袋內空氣抽真空，將兔肉分為4 組進行超高壓處理。分別為：0.1（對照組）、100、200、400 MPa，超高壓在室溫下進行，時間為15 min。此過程操作要迅速，在兔肉僵直前完成處理。迅速將處理后樣品在-18 ℃保存24 h，然后在4 ℃冰箱中平衡12 h使兔肉解凍，將解凍后樣品切為1 cm×1 cm×3 cm小塊，進行相關指標測定。

1.3.2 色度測定

在測定樣品肉的色度值前，先用黑板、白板校準色度計，然后把自封帶套到白板上，測定CIE（色度值）作為參照。將裝有肉的自封袋鋪平，使其沒有氣泡和間隙，每個處理測3 組取平均值[16]。測定指標包括總色差值（ΔE）、亮度（L*）值、紅度（a*）值、黃度（b*）值。

1.3.3 剪切力的測定

將數顯溫度計的溫度探頭插入肉的中心位置，扎緊袋口，然后置于80 ℃恒溫水浴中加熱，用溫度計記錄肉塊中心溫度的變化。參照徐舶等[17]的方法并略加調整，當肉中心溫度達75 ℃時取出（大概時間為20 min），然后放入4 ℃冰箱冷卻，使肌肉樣品的中心溫度降到4 ℃，采用Warner-Bratzler[18]的方法測定肌肉的剪切力，刀頭平行于紋理切割，探頭為HDP/BS；測前速率為1.5 mm/s；測定速率為1.5 mm/s；測后速率為10.0 mm/s；負載類型為Auto-40 g[19]。

1.3.4 pH值的測定

參考Chan等[20]的方法，將肌肉組織放入去離子水中，去離子水和肌肉組織質量比為9∶1，用組織勻漿機勻漿，用電子pH計測定肌肉組織勻漿的pH值。

1.3.5 滴水損失率和蒸煮損失率的測定

參照Fernández等[21]的方法，稱肉樣質量（m1），再將肌肉樣品掛到有曲別針改造的小鉤上，外面罩上塑料袋，用細繩將口封死，將小鉤懸掛于4 ℃冰箱，24 h后取出，用吸水紙吸取表面水分后，稱質量（m2）。按公式（1）計算滴水損失率。

參照Li Chunbao等[22]的方法，稱肉樣質量（m1），然后外面罩上塑料袋，將數顯溫度計的溫度探頭插入肉的中心位置，扎緊袋口，放入80 ℃的水浴鍋，當中心溫度達到75 ℃時，取出肉樣，放入4 ℃冰箱過夜，用吸水紙吸取表面水分，稱質量（m2）。按公式（2）計算蒸煮損失率。

1.3.6 兔肉鹽溶蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）

按照Xiong Youling L.等[23]的方法提取兔肉鹽溶蛋白，然后參考Chan等[20]的方法，將提取的鹽溶蛋白溶解，取20 μL加入Eppendorf管中，加入5 μL 5倍樣品濃度緩沖液，置于沸水浴中加熱5 min。配制12%分離膠和5%濃縮膠，在恒壓（80 V）條件下電泳，完成后關閉電源，取下膠塊，然后用考馬斯亮藍 R-250染色1 h，再用醋酸-甲醇溶液（3∶2，V/V）進行脫色，直到背景清晰。

1.3.7 HE染色觀察細胞形態的變化

用冷凍切片機將兔肉切片，按姚海嵩等[24]的方法對冷凍切片進行固定。然后配制醇溶性伊紅溶液，Mayer蘇木精A液及Mayer蘇木精B液，按下列步驟染色：

切片后放入A液固定（30 s）→水洗（30 s）→放入B液固定（1 min）→放入蘇木素（5 min）→水洗→1%鹽酸分化（20 s）→水洗→放入1%的氨水（40 s）→水洗→伊紅染色（5 min）→水洗→70%酒精（30 s）→80%酒精（30 s）→95%酒精Ⅰ（1 min）→95%酒精Ⅱ（1 min）→100%酒精脫水Ⅰ（3 min）→100%酒精脫水Ⅱ（3 min）→二甲苯透明Ⅰ（10 min）→二甲苯透明Ⅱ（10 min）→中性樹膠封片。

制作好的組織切片在100 倍顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.8 兔肉組織結構的掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察

參照Sotelo等[25]的方法處理樣品并加以調整。將樣品用刀片切成3 mm×3 mm×l mm小片，放入2.5%的戊二醛溶液中于4 ℃固定2 h，倒掉固定液，用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3 次，每次15 min。再放入1%鋨酸后固定1.5 h。用體積分數為25%、50%、75%、90%和95%的乙醇溶液對樣品進行脫水處理，每個體積分數處理15 min，再用無水乙醇處理兩次，每次20 min。再進行醋酸異戊醇梯度置換出乙醇后，將樣品置于冷凍真空干燥機中凍干，經真空離子濺射鍍金膜（20 nm左右）處理好的樣品用于掃描電鏡觀察。

1.4 統計分析

2 結果與分析

2.1 超高壓對兔肉色度的影響

表1 不同超高壓處理對兔肉色澤的影響Table1 Effect of UHP on rabbit meat color

由表1的ΔE可以看出，不同的壓力處理后，兔肉的色澤發生明顯的變化。實驗中觀察到：室溫下，僵直前超高壓處理的兔肉的色澤隨著壓力的升高由淺粉色逐漸變為灰白色，當壓力升高到400 MPa時變成灰色。兔肉L*值隨著壓力的增加而增大，100 MPa處理兔肉L*值與對照組相比差異不顯著，而200、400 MPa處理的兔肉L*值顯著大于對照組（P＜0.05）。兔肉a*值隨著壓力的增加而逐漸減小，100 MPa處理的兔肉a*值與與對照組相比差異不顯著，而200、400 MPa處理的兔肉a*值則顯著減小（P＜0.05）。這與馬漢軍等[26-27]的實驗結果基本相符。

Willems等[28]在研究超高壓對牛肉色澤的影響時提出牛肉經超高壓處理后表面亮度值的增加可能是由于肌球蛋白變性和亞鐵血紅素被取代或釋放，或使卟啉環被破壞和蛋白聚合；壓力超過400 MPa時失去紅色（a*值顯著減小）是由于肌紅蛋白在400 MPa超高壓下發生變性，亞鐵肌紅蛋白氧化而變成高鐵肌紅蛋白。

2.2 超高壓對兔肉嫩度的影響

圖1 超高壓處理對兔肉剪切力的影響Fig.1 Effect of UHP on the shear force of rabbit meat

由圖1可知，4 組超高壓處理下兔肉剪切力平均值分別為3.20、2.52、2.21、3.47 kg。在0.1～200 MPa內兔肉的剪切力隨著壓力的增大而降低，在400 MPa時剪切力卻顯著增大，200 MPa的超高壓處理兔肉剪切力最小，可以有效的改善兔肉的嫩度，該結果與張秋勤等[29]的研究結論相一致。

2.3 超高壓對屠宰24 h后兔肉pH值的影響

圖2 不同超高壓處理對屠宰24 h后pH值的影響Fig.2 UHP effects on the pH of Rex rabbit meat at 24 h postmortem

由圖2可知，屠宰24 h后兔肉的pH值隨壓力升高而增大，200 MPa和400 MPa壓力處理后兔肉pH值顯著高于對照組（P＜0.05）。這與Angsupanich[30]和Sikes[31]等的結果基本一致。超高壓處理后pH值的上升一方面是由于肌肉組織結構遭到破壞，使其內部的堿溶性物質外滲或堿性基團暴露出來，與酸性基團或酸性物質發生中和反應；另一方面超高壓處理可能會使肌原纖維的肌漿網破裂，釋放出大量Ca2+，激活鈣激活中性蛋白酶，降解部分肌原纖維蛋白，使酸性基團減少[32]。pH值的變化會影響鈣激活中性蛋白酶活性及蛋白質空間結構，從而影響兔肉的嫩度和保水性。

2.4 超高壓對蒸煮損失率和滴水損失率的影響

圖3 不同超高壓條件下樣品的蒸煮損失率（a）和滴水損失率（b）變化Fig.3 Changes in cooking loss rate (a) and drip loss rate (b) of rabbit meat treated with different UHPs

由圖3可知，隨著壓力的增大兔肉的滴水損失率和蒸煮損失率均呈現先下降后上升的趨勢。4 組超高壓處理后兔肉的蒸煮損失率和滴水損失率分別為：35.96%、32.23%、31.54%、38.98%和2.98%、2.65%、2.61%、3.82%。100、200 MPa處理組的滴水損失率和蒸煮損失率顯著小于對照組（P＜0.05），且兩組之間無顯著性差異（P＞0.05），保水性良好；400 MPa處理組的滴水損失率和蒸煮損失率顯著大于其他處理組（P＜0.05），保水性最差。這可能是因為100、200 MPa兩組超高壓處理使蛋白質解聚，促使肌纖維蛋白溶解度增加，從而提高了肉品的保水性，而400 MPa則使肌纖維結構變得疏松，因而會使得肉中部分汁液流出，從而使其保水性急劇下降。由于蒸煮損失和滴水損失的減少，相應得率的增加，說明200 MPa超高壓對提高肉制品出品率效果顯著。

2.5 超高壓處理對兔肉鹽溶蛋白質的影響

標準分子質量蛋白包括兔磷酸化酶B（97.4 kD）、和兔肌動蛋白（45 kD）、組織相容性復合體（135 kD）等。由圖4可知，隨著壓力的增大，在100、200 MPa時肌動蛋白分子條帶與對照組相比略微變淺，但變化不大，在400 MPa時，肌動蛋白條帶消失；肌球蛋白分子重鏈和兩條輕鏈均逐漸變淡，在壓力400 MPa時最淺。Angsupanich等[30]對超高壓處理的鱈魚肉進行差示掃描量熱分析顯示，400 MPa高壓處理能使肌動蛋白和大部分的肌漿蛋白變性，而肌球蛋白在200 MPa就已經完全變性； 由Lakshmanan等[33]對鮭魚蛋白水解酶的研究也可得出超高壓處理過程中壓力大小的不同會對蛋白質結構產生不同的影響，當壓力較小時，低聚蛋白質的結構易發生解離，當壓力為200 MPa時，蛋白質易發生解離，當壓力為400 MPa時，部分蛋白亞基易發生凝聚。一般情況下，超高壓壓力為100～200 MPa時，蛋白質變化可逆，當壓力大于300 MPa時，蛋白質的三級結構遭到了破壞，發生不可逆變性[33]。

圖4 不同超高壓條件下兔肉鹽溶蛋白電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of salt-soluble proteins in rabbit meat treated with different UHPs

2.6 光學顯微鏡觀察兔肌纖維變化

圖5 橫切肌纖維的HE染色結果Fig.5 HE-stained transverse sections of skeletal muscles

圖6 縱切肌纖維的HE染色結果Fig.6 HE-stained longitudinal sections of skeletal muscles

由圖5、6可以清楚地觀察到隨著壓力的增加肌纖維結構逐漸發生變化的過程。0.1 MPa處理組的肌纖維排列整齊、連貫；200 MPa處理組的肌纖維歪曲并出現部分片段化；400 MPa處理組的肌纖維幾乎完全片段化。超高壓處理對肉的嫩化機理主要有以下兩個方面：一是機械力的作用使肌肉纖維收縮和肌纖維蛋白解離成小片段，造成肌肉剪切力下降；二是壓力處理使肌肉中內源蛋白酶鈣激活酶的活性增加，加速了肌肉蛋白水解，加快肌肉成熟所致[34]。當壓力達到200 MPa時，肌細胞膜遭到破壞，使Ca2+離子釋放，激活鈣蛋白酶水解蛋白質，導致肌肉嫩化；當壓力增加到400 MPa時，ATP酶、鈣激活酶系統和組織蛋白酶等與肉嫩化有關的酶的失活，故在此壓力下肉的剪切力反而升高[35]。

從圖5、6兔肉染色圖片觀察到隨壓力增大，紅色部分減少，鮮兔肉的色澤隨處理壓力的升高而變淺，汁液溶出量增大，高壓處理使肌纖維收縮。這是因為高壓激活了肌肉中的ATP酶，ATP釋放能量使肌動蛋白和肌球蛋白結合成肌動球蛋白從而導致肌纖維收縮[36]。

2.7 掃描電鏡下觀察肌纖維變化

圖7 縱切肌纖維的掃描電鏡觀察結果Fig.7 Scanning electron micrographs of longitudinal sections of skeletal muscles

由圖7可知，不同超高壓條件處理下的兔肉的微觀結構差異很大。常壓（0.1 MPa）下的樣品肌纖維呈現完整、有序的排列；在100 MPa處理組中，肌纖維彎曲，排列更加緊湊；使用200 MPa的壓力處理時，肌纖維斷裂，聚集在一起；當施加400 MPa壓力時，兔肉結構的空間間隙明顯因受壓而擠在一起，兔肉組織肌原纖維間隙消失，蛋白質膠凝化現象嚴重，兔肉組織纖維狀結構變成網狀結構，表明400 MPa 的壓力處理有利于良好凝膠的形成。鄭捷等[37]研究了超高壓處理對海鱸魚肉凝膠形成的影響，結果表明用400 MPa高壓處理時，蛋白質分子的二硫鍵會發生部分的斷裂，巰基含量有所上升，使體系中氫鍵和疏水交聯以及二硫鍵的比例變化，因此使超高壓對蛋白質的凝膠特性起到改善作用。

3 結 論

超高壓處理能夠使僵直前獺兔肉品質和微觀結構發生顯著變化。適當的超高壓（200 MPa）對肉的嫩度、保水性、色度均有改善作用。同時，從SEM圖和HE染色結果可以看出超高壓處理能使兔肌肉肌節收縮、肌纖維片段化、蛋白質發生解聚。超高壓技術能開發出外觀和質地不同的新型肉類食品，在肉品加工及貯藏中超高壓技術具有多方面的優勢，有很大的開發潛能。

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Effects of Ultra High Pressure on the Quality and Ultrastructure of Pre-rigor Rex Rabbit Meat

WANG Wen-hang, XU Qian-qian, LIU Ting, LU Dong-xue, LI Qian, ZHAO Wen-ping
(School of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Pre-rigor Rex rabbit meat was subjected to high pressure processing at 100, 200 and 400 MPa, respectively, at 25 ℃ for 15 min prior to storage at -18 ℃ for 24 h. The quality and ultrastructure of the rabbit meat were studied. With increasing pressure, L* increased, a* decreased and the reddish meat turned gray. Furthermore, cooking loss rate and drop loss rate showed an upward trend after the fi rst drop. The lowest drip loss and cooking loss (31.54% and 2.61%, respectively) were observed for rabbit meat when treated with 200 MPa. Ultra high pressure (UHP) had a signif i cant effect on the tenderness of rabbit meat (P ＜ 0.05). The shear force declined as the pressure increased from 0.1 to 200 MPa, but sharply increased at 400 MPa to be signif i cantly higher than that of the control group (0.1 MPa). There were only little changes in the organizational structure of the meat treaded with 100 MPa as compared to that of the control group (0.1 MPa). However, UHP processing at 400 MPa signif i cantly altered the microstructure of rabbit meat: sarcomere contraction, muscle fi ber distortion and fragmentation, protein depolymerization and tertiary structure were all destroyed. These results showed that ultra -high pressure causes signif i cant effects on the quality and ultrastructure of pre-rigor Rex rabbit meat and that the best ultra-high pressure condition for pre-rigor rabbit meat is 200 MPa.

ultra high pressure (UHP); pre-rigor; rabbit meat; quality; ultrastructure

TS251.5

A

1002-6630（2014）21-0073-06

10.7506/spkx1002-6630-201421015

2013-12-17

公益性行業（農業）科研專項（201303082）

王穩航（1977—），男，副研究員，博士，研究方向為動物源性食品加工與控制、食品大分子結構、性質與功能。E-mail：wangwenhang@tust.edu.cn