植物乳桿菌NDC75017抗氧化活性研究

宋曉辰，彭新顏,*，李鳳梅，姜毓君，于海洋

（1.魯東大學食品工程學院，山東 煙臺 264025；2.國家乳業工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150086；3.山東商務職業學院食品工程系，山東 煙臺 264670）

植物乳桿菌NDC75017抗氧化活性研究

宋曉辰1，彭新顏1,*，李鳳梅1，姜毓君2，于海洋3

（1.魯東大學食品工程學院，山東 煙臺 264025；2.國家乳業工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150086；3.山東商務職業學院食品工程系，山東 煙臺 264670）

目的：研究酸奶中所篩選的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）NDC75017在不同體系中的抗氧化作用模式。方法：測定了活細胞、無細胞提取物、胞外分泌物及菌體滅活物質的自由基清除能力、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）活性、還原能力和金屬離子螯合能力。結果：株菌能夠耐受一定濃度的過氧化氫（H2O2），無細胞提取物的超氧陰離子自由基（O2-·）和DPPH自由基清除能力最強，胞外分泌物的羥自由基（·OH）清除作用最好。無細胞提取物和胞外分泌物的T-AOC效果最佳，與另外兩組差異顯著（P＜0.05）。胞外分泌物的GSH-Px和T-SOD酶活性最高，明顯比無細胞提取物和菌體滅活組效果好（P＜0.05）。4 組樣品都具有還原能力和金屬離子螯合能力，但Cu2+螯合能力不如Fe2+螯合能力效果好。結論：菌株具有抗氧化活性，其抗氧化本質可能與其具有金屬離子螯合能力、提供電子和清除自由基等作用模式有關。

植物乳桿菌NDC75017；抗氧化活性；作用模式

為了防止食品氧化變質及機體受過多自由基的侵害，較理想的方法是使用抗氧化劑，提高抗氧化性能。從食品安全性上考慮天然抗氧化物質有著合成抗氧化劑無法比擬的優勢，現已成為食品和醫學專家追求的目標[1]。研究表明，乳酸菌不僅具有增強機體免疫力、抑菌、抗癌和抗衰老等生理功能[2]，其抗氧化活性也得到專家的廣泛關注[3-4]。我國疆域遼闊，蘊藏著豐富多樣的乳酸菌資源，特別是科爾沁草原地理環境獨特，當地牧民家庭自制酸奶營養成分比普遍酸奶還要豐富[5]。如果能從中篩選出具有抗氧化活性的優良菌株，作為天然抗氧化劑資源，將對推動我國益生菌產業及開發功能型發酵食品具有重要的意義。

課題組從內蒙古科爾沁草原牧民家傳統酸奶樣品中篩選出一株具有高產γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能力的植物乳桿菌[6-7]，通過形態學和16S rDNA的序列分析對其進行了鑒定，命名為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）NDC75017。前期動物實驗表明，菌株可以減輕脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的大鼠氧化應激損傷及顯著下調肝臟核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）和Toll樣受體（Tolllike receptors，TLR4）mRNA的表達，這些可能都與其自身的抗氧化能力有關[8]。鑒于此，本實驗通過測定菌株的自由基清除能力、銅鐵金屬離子螯合能力及總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）能力和總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）活力等指標，評價菌株的抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌NDC75017（Lactobacillus plantarum）分離于科爾沁草原牧民家自制酸奶，采用MRS培養基培養。

抗壞血酸鈉、菲洛嗪（Ferrozine）、三吡啶三吖嗪（2,4,6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-pycryl hydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；總抗氧化能力、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和總超氧化物歧化酶試劑盒購于南京建成科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

CP214精密分析天平 美國奧豪斯儀器（上海）有限公司；ER 200D-SRC電子自旋共振儀 德國Bruker公司；pHS-25型酸度計 上海精科雷磁儀器廠；LG10-24A高速離心機 北京醫用離心機廠；XHF-I高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的培養及各組樣品的制備[9-10]

將篩選得到的乳酸菌株活化，傳代3 次后，接種于MRS液體培養基，37 ℃培養24 h，培養液經4 000 r/min， 4 ℃離心l0 min，收集菌體沉淀，經無菌去離子水洗滌兩次，再重懸調整細胞終濃度為1.0×109CFU/mL。

所得菌懸液分為4 組，一組作為活細胞組（Ⅰ組，1.0×109CFU/mL）；另一組將密度為1.0×109CFU/mL菌體用生理鹽水制成菌體懸液；冰浴條件下用超聲波粉碎儀進行粉碎，300 W條件下，每處理5 s，間隔5 s，持續25 min，顯微鏡下檢查沒有完整細胞后，在4 ℃、8 000 r/min離心15 min，收集上清，即為無細胞提取物（Ⅱ組）；將菌數調整到109CFU/mL后，在5 000 r/min離心15 min，收集上清液，即為胞外分泌物組（Ⅲ組）；將菌數調整至109CFU/mL，在100 ℃條件下加熱處理30 min，即為菌體滅活組（Ⅳ組）。為方便實驗后續實驗分別將這4 組用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ表示。

1.3.2 菌株對不同濃度過氧化氫（H2O2）溶液的耐受能力

將60 mL的MRS培養基加入到滅過菌的三角瓶中，添加H2O2，使培養基中的起始H2O2濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L。從-80 ℃取出甘油凍存的植物乳桿菌，按照1%的比例接種到液體培養基中，37 ℃培養24 h，測定600 nm波長處的吸光度A600nm，以吸光度反映其菌體濃度的變化，確定菌株對H2O2耐受性。

1.3.3 電子自旋共振（electron spin resonan-ce spectroscopy，ESR）法測定DPPH自由基清除能力

測定方法參照Peng Xinyan等[11]的方法。將60 μL的樣品（以酒精溶液為對照組）加入到60 μL DPPH溶液（60 μmol/L）中，劇烈振動10 s，使其混合充分，轉入100 μL密封的石英毛細管中反應2 min，利用ER 200D-SRC ESR儀進行分析測定。

信號的相對強度用波譜信號的第3個峰值來表示，樣品DPPH自由基的清除能力按照公式（1）計算。

式中：H和H0分別為樣品與空白波譜信號強度。

1.3.4 ESR法測定清除O-2·能力

參照Peng Xinyan等[11]的方法，O2-·由紫外照射的核黃素/EDTA系統產生。反應體系中含有0.3 mmol/L核黃素、5 mmol/L的EDTA、0.10 mL二甲基吡咯啉氮氧化物（dimethyl pyrroline nitrogen oxides，DMPO）以及樣品。利用紫外燈在365 nm波長處照射1 min，將混合液吸入毛細管并放入共振腔，用氙燈光照30 s（光源的功率為1 000 W，腔距為70 cm），然后立即用光譜儀ER 200D SRC ESR進行測定，并記錄ESR圖譜。樣品對O-2·的清除率計算同公式（1）。式中：H0和H分別為對照與樣品波譜信號第一峰的高度。

1.3.5 ESR法測定清除·OH能力

參照Rosen等[12]的方法，·OH由Fenton反應產生。將50 μL樣品加入到50 μL濃度為0.3 mol/L的DMPO后，把反應的體系轉入到密封的石英毛細管中，然后加50 μL濃度為10 mol/L的H2O2啟動反應。反應2.5 min后，通過ER 200D SRC ESR光譜儀分析。對照為0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）。樣品對·OH的清除作用以清除率表示，公式同1.3.3節，這里H和H0分別表示樣品與對照波譜信號強度，信號的相對強度用波譜信號的第二個峰值來表示。

1.3.6 T-AOC、GSH-Px和T-SOD酶活性的測定

采用南京建成試劑盒，按照產品說明書的方法操作。

1.3.7 FRAP（ferric reducing/antioxidant power）法測定還原能力

參照Peng等[13]的方法，準確吸取6.0 mL新配制的FRAP試劑于反應管中，加熱到37 ℃，加入0.2 mL樣品，0.6 mL的H2O，混合均勻，靜置反應10 min，于593 nm波長處測定吸光度。以100～1 000 μmol/L的FeSO4·7H2O制作標準曲線，樣品的抗氧化活性是以達到同樣吸光度所需要的FeSO4·7H2O毫摩爾數表示。

1.3.8 Cu2+和Fe2+金屬離子螯合能力的測定

參考Peng等[13]的方法稍作修改進行研究。Cu2+的螯合能力：取1 mL新配制的2 mmol/L的CuSO4溶液，加入10%的吡啶1 mL和0.1%的鄰苯二酚紫20 μL，混合均勻，向其中添加1 mL的樣品溶液，靜置反應后，于632 nm波長處測定吸光度。

Fe2+的螯合能力：向反應體系（20 μmol/L的FeCl2溶液1 mL與0.5 mmol/L的Ferrozine溶液1 mL）中加入0.5 mL的樣品，充分混勻，在562 nm波長處測得其吸光度。螯合能力按照公式（2）計算。

式中：A0空白溶液的吸光度；A1樣品溶液的吸光度。

1.4 統計分析

2 結果與分析

溶液中的吸光度Fig.1 Absorbance of Lactobacillus plantarum NDC75017 in different concentrations of H2O2solution圖1 植物乳桿菌NDC75017在不同濃度H2O2

2.1 菌株對H2O2的耐受能力由圖1可知，植物乳桿菌NDC75017在H2O2濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的培養基中培養時，吸光度變化并不大，而且沒有顯著差異（P＞0.05），說明此菌株對H2O2也有一定的耐受能力。

2.2 ESR法測定自由基清除能力

2.2.1 清除DPPH自由基的能力

圖2 ESR法測定不同組樣品清除DPPH自由基的能力Fig.2 ESR spectra for the determination of DPPH radicalscavenging capability

表1 不同組樣品清除DPPH自由基的能力Table1 DPPH radical-scavenging capability of four samples

DPPH自由基是一種以氮為中心、比較穩定的自由基。當有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對而使其本身深紫色逐漸消失或減弱，褪色程度與抗氧化物質呈定量關系。因此，廣泛用于評價物質的抗氧化活性。ESR信號降低表明樣品具有自由基的清除能力，由圖2、表1可知，4 個組的樣品都具有DPPH自由基清除能力，其清除自由基的次序為：第Ⅱ組＞第Ⅲ組＞第Ⅳ組＞第Ⅰ組，可見，無細胞提取物的DPPH自由基的清除效果最好，達到了65.10%，其次依次為58.56%、15.30%、8.60%，與其他組比差異顯著（P＜0.05）。

圖3 ESR法測定不同樣品的清除能力Fig.3 ESR spectra for the determination of superoxide anion radicalscavenging capability

表2 不同組樣品清除·的能力Table2 Superoxide anion radical-scavenging capability of four samples

表2 不同組樣品清除·的能力Table2 Superoxide anion radical-scavenging capability of four samples

組別ⅠⅡⅢⅣ清除率/%45.42±1.00c57.25±1.61a50.00±1.21b15.30±1.41d

2.2.3 清除·OH的能力

圖4 ESR法測定不同樣品·OH清除能力Fig.4 ESR spectra for the determination of hydroxyl radicalscavenging capability

表3 不同組樣品清除·OH的能力Table3 Hydroxyl radical-scavenging capability of four samples

·OH也是機體常見的一種活性氧。在病理實驗中，研究·OH的清除作用對找到某些病變原因、衰老機理的揭示具有重要意義。由圖4、表3可知，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組對·OH清除能力分別是12.70%、47.25%、67.84%和9.96%。可見，對于·OH，胞外分泌物的清除作用比其他組更有效（P＜0.05）。

2.3 T-AOC、GSH-Px和T-SOD酶活性的測定

表4 T-AOC、GSH-Px和T-SOD酶活力的測定結果Table4 T-AOC, GSH-Px and T-SOD activities of Lactobacillus plantarum

由表4可知，活細胞、無細胞提取物、胞外分泌物和菌體滅活組的T-AOC分別為11.52、22.86、24.20、9.47 U/mg pro，其中無細胞提取物、胞外分泌物的效果最佳，與其他兩組有顯著差異（P＜0.05）。4 個樣品組都具有GSH-Px酶活性，其中胞外分泌物酶活性最高，與其他3 組有顯著差異（P＜0.05），但其平均值只有4.63 U/mg pro，也并不明顯。前3 組T-SOD酶活性分別為21.52、22.56、23.93 U/mg pro，效果比較好，明顯高于菌體滅活組（P＜0.05）。

2.4 Cu2+和Fe2+金屬離子螯合能力及還原能力的測定

由表5可知，胞外分泌組的FRAP值為642.85 μmol/L，明顯高于其他3 組（P＜0.05），甚至是達到了無細胞提取物組和菌體滅活組的2 倍。可見，從還原能力上看，胞外分泌組的效果最好。對于金屬離子螯合能力，第Ⅲ組Cu2+螯合能力最強，但也只有4.81%。第Ⅳ組與前3 組比，Cu2+螯合能力存在差異顯著性（P＜0.05）。所有樣品都具有Fe2+螯合能力，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組Fe2+螯合率分別為22.90%、25.58%、23.96%和15.37%，效果要明顯強于Cu2+螯合能力。

表5 樣品對Cu2+及Fe2+螯合能力和還原能力Table5 Copper (Cu2+), ferrous iron (Fe2+) chelating capacity and FRAP values of samples

3 討 論

H2O2是重要的活性氧之一，容易分解形成自由基，因此是一種常用的氧化脅迫試劑。研究表明，具有潛在的抗氧化能力的乳酸菌，對H2O2具有一定的耐受能力。將植物乳桿菌NDC75017分別接種于不同濃度H2O2培養基中恒溫培養后，各組吸光度并沒有明顯的變化，不存在顯著差異性（P＞0.05)。與之相似，具有抗氧化能力的植物乳桿菌CCFM8661和干酪乳桿菌CCFM1566在0.5 mmol/L的H2O2溶液中的存活率分別為64%和80%[14]，對H2O2也有一定的耐受能力。

一般而言，自由基清除作用是通過阻斷自由基的鏈式反應或螯合自由基的作用來實現的，在常用的抗氧化評價方法中，清除·OH、DPPH自由基、O2-·能力和還原能力等方式，都能直接或間接的反映物質具有清除自由基的效果。Tomomi等[3]在從鯽魚壽司中分出的4 株植物乳桿菌和1 株腸膜明串珠菌，這5 株菌都具有清除DPPH自由基和O2-·的能力。Takashi等[15]篩選出的乳酸桿菌表現出很高的自由基清除活性，該株菌發酵生產的酸奶后，O2-·清除能力有所增加。Bae等[16]也報道，從發酵植物中分離的短乳桿菌在發酵海藻過程中，表現出很強的DPPH自由基清除能力而且其效果優于丁基羥基茴香醚（butyl hydroxy anisd，BHA）。黃珊珊等[9]對比研究了德氏乳桿菌和植物乳桿菌的羥自由基的能力，結果證實，兩株菌都具有清除自由基的作用，其清除效果O2-·為無細胞提取物＞完整細胞＞菌體滅活組，恰與文獻[17]的結果一致，說明菌株的胞內物質對清除O2-·起主要作用。本實驗通過ESR法測定了菌株自由基清除能力，結果證明，該菌株具有良好的DPPH自由基、O2-·和·OH清除效果。但各種自由基的清除效果并不完全一致，如無細胞提取物的DPPH自由基和·OH的清除能力最高，而·中胞外分泌物效果最好。

王玉華等[18]研究了4 株鼠李糖乳桿菌B7、B8、B10和B44的無細胞抽提物、活細胞和細胞裂解液的抗氧化活性，結果證明，4 株菌種的抗氧化活性與其具有SOD、CAT和GSH-Px的活性有關。Hanie等[19]每天給兩組糖尿病人服用酸奶，一組為普通酸奶，另一組為含嗜酸乳桿菌La5和雙歧桿菌Bb12的酸奶，結果表明，第二組病人紅細胞的SOD和GSH-Px酶活性增加，總抗氧化活性也有所增強。Kang等[20]也得到類似結論，健康志愿者在食用過乳酸菌發酵海帶后，血清抗氧化酶活性明顯增強。GSH-Px酶是一種重要的催化H2O2分解的酶，可以起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。本實驗中胞外分泌物GSH-Px的酶活性較高，與圖1中植物乳桿菌NDC75017對H2O2的耐受性一致。即提示可能就是由于菌株胞外分泌物具有GSH-Px酶活性，催化了H2O2的分解，才使菌株對H2O2有一定的耐受性。實驗通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生O2-·，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，當被測樣品中含SOD時，則對O2-·有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少。菌株無細胞提取物和胞外分泌物的SOD酶活力之間不存在顯著差異（P＞0.05），劉天祎等[21]篩選出得到抗氧化活性較高兩株菌的無菌體細胞發酵液和菌體細胞提取物的T-SOD酶活性值無差異，與本結果一致。張江巍等[22]檢測到乳酸菌L4無細胞提取物SOD活性為（73.70±1.77）U/mg。但未檢測到乳酸菌L3和L4具有GSH-Px活性。以上結果與Kullisssr等[17]的報道相符，即一些乳酸菌具有抗氧化作用是由于含有一些抗氧化酶類物質，如SOD、過氧化氫酶、GSH-Px、和NADH氧化酶等，它們對氧化和抗氧化平衡起著至關重要的作用。

還原能力是用來評價抗氧化活性的常用方法，也是測定乳酸菌是否具有電子供體和清除自由基能力的一種方法。本實驗通過將TPTZ-Fe（Ⅲ）還原為TPTZ-Fe（Ⅱ）復合物來評價樣品的還原能力，結果表明，菌株具有較好的還原能力，其中胞外分泌組效果最好。Ng等[23]用長乳桿菌發酵臺灣銀線蘭的根、莖和葉后，其產品的還原能力在700 nm波長處達到0.3，效果明顯。王曦等[10]通過自由基清除能力和還原能力，從35 株乳酸菌中篩選出抗氧化能力較高的菌株La5和La29。另外，過渡金屬離子，如Fe2+及Cu2+，能夠催化活性氧（如·OH和O2-·），是機體出現氧化損傷和食物發生氧化的一種重要原因。與Fe2+螯合能力相比，此株植物乳桿菌Cu2+螯合能力低得多。過去已發現許多乳酸菌都可作為金屬螯合劑，如王剛等[14]在研究乳酸菌的抗氧化作用時發現，植物乳桿菌CCFM8661和干酪乳桿菌CCFM1566是通過金屬離子螯合作用和自由基清除作用來提高整體抗氧化水平的。Kai等[24]研究也證實，乳酸菌菌株L. fermentum ME-3也是通過螯合金屬離子和抑制脂質過氧化作用來實現的。

綜上所述，對比相關研究發現，乳酸菌的抗氧化活性具有顯著的菌株特異性，甚至同一菌株發揮其抗氧化作用的活性物質存在的部位也不相同。其原因可能是由于起抗氧化作用的活性物質成分、處理方式或濃度不同造成的。同時，由于不同的菌株其自由基清除能力、還原能力、金屬離子螯合能力、T-AOC、GSH-Px和T-SOD酶活性的能力不同，導致其抗氧化成分、抗氧化機制存在較大的差異。

4 結 論

乳酸菌具有廣泛的抗氧化功效，其抗氧化模式包括清除自由基、螯合銅鐵金屬離子、抑制脂質過氧化、調控黃嘌呤氧化酶及抗氧化酶系及在發酵食品中發揮抗氧化作用。實驗表明，此株植物乳桿菌NDC75017具有抗氧化活性，其抗氧化本質可能與其作為電子供體、螯合金屬離子和清除自由基等作用模式有關。

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Antioxidant Activity of Lactobacillus plantarum NDC75017

SONG Xiao-chen1, PENG Xin-yan1,*, LI Feng-mei1, JIANG Yu-jun2, YU Hai-yang3
(1. College of Food Engineering, Ludong University, Yantai 264025, China; 2. National Research Center of Dairy Engineering and Technology, Harbin 150086, China; 3. Department of Food Engineering, Shandong Business Institute, Yantai 264670, China)

Objective: The antioxidant activity of Lactobacillus plantarum NDC75017 isolated from traditional yoghurt was investigated in different systems. Methods: Free radical-scavenging ability, total antioxidant capacity (T-AOC), glutathione peroxidase (GSH-Px) activity, total superoxide dismutase (T-SOD) activity, reducing power, and metal ion chelating capability were determined in the intact cells, cell-free extract, extracellular secretion, and inactive cells. Results: The strain had resistance to hydrogen peroxide, the cell-free extract indicated the strongest superoxide anion and DPPH radical scavenging capacity, and the extracellular secretion showed the best hydroxyl radical scavenging capacity. Both the latter two samples exhibited the most potent T-AOC (P ＜ 0.05), showing a signif i cant difference from two other samples. The extracellular secretion displayed the highest GSH-Px and T-SOD enzyme activities, signif i cantly higher than those of the cell free extract and inactive cell groups (P ＜ 0.05). All these four samples possessed reducing power and metal ion chelating capability, more effective for Fe2+than Cu2+. Conclusion: Lactobacillus plantarum NDC75017 has good antioxidant activity as a metal ion chelator, electron provider, and radical stabilizer for inhibiting oxidation.

Lactobacillus plantarum NDC75017; antioxidant activity; action mechanism

TS201

A

1002-6630（2014）21-0106-07

10.7506/spkx1002-6630-201421021

2014-06-26

山東省高等學校科技計劃項目（J13LE55）；中國博士后基金面上資助項目（2012M510911）；魯東大學橫向課題（2012HX042）；山東省成人高等教育特色課程項目（20131206）；國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2011AA100902）；黑龍江省科研機構創新能力提升專項計劃項目（YC13D005）

宋曉辰（1992—），女，本科生，研究方向為食品科學。E-mail：1806979149@qq.com

*通信作者：彭新顏（1976—），女，副教授，博士，研究方向為抗氧化活性物質開發及食品營養與安全。E-mail：pengxinyan2006@163.com