中華鱉腿肉蛋白質體內外消化研究

張 丹，王錫昌*

（上海海洋大學食品學院，上海 201306）

中華鱉腿肉蛋白質體內外消化研究

張 丹，王錫昌*

（上海海洋大學食品學院，上海 201306）

通過測定氨基酸組成、體內外蛋白質消化率及經蛋白質消化率校正的氨基酸評分（protein digestibilitycorrected amino acid scores，PDCAAS）等指標，評價熱處理前后中華鱉腿肉蛋白質的營養價值。結果表明：中華鱉腿肉熱處理前后必需氨基酸含量分別為36.84%、34.55%（以干質量計），占氨基酸總量的41.12%、40.20%，其構成符合聯合國糧農組織/世界衛生組織推薦的理想模式。熱處理前，測得中華鱉腿肉蛋白質體外消化率為83.68%，體內消化率為95.05%；熱處理后，測得其體外消化率為87.04%，體內消化率為96.18%，熱處理后消化率顯著提高（P＜0.05）。結合氨基酸評分及真實消化率，計算得到熱處理前其PDCAAS為100%，由于蒸煮過程營養物質的流失，測得熱處理后Trp氨基酸評分最低為80，熱處理后其PDCAAS為76.94%。

中華鱉；體內消化；體外消化；經蛋白質消化率校正的氨基酸評分

中華鱉（Trionyx sinensis），俗稱甲魚、團魚等，是我國特色水產品。據聯合國糧農組織漁業統計數據，2012年全球中華鱉養殖產量已達到33.6萬 t，其中98.77%產自中國[1]。中華鱉腿肉蛋白質含量高達18.20%[2]，是人體攝取蛋白質的良好來源。蛋白質的營養價值，一方面取決于其含量，另一方面在很大程度上取決于其氨基酸組成及消化率。蛋白質消化率反映了蛋白質在消化道內被分解的程度，消化率越高，則被機體利用的可能性越大，營養價值越大[3]。目前消化率的研究主要包括體外消化實驗及體內消化實驗兩種方法[4]。1991年聯合國糧農組織（The Food and Agriculture Organization of United States，FAO）/世界衛生組織（World Health Organization，WHO）蛋白質品質評價專家委員會公布并推薦通過蛋白質消化率校正的氨基酸評分（protein digestibility-corrected amino acid scores，PDCAAS）這一指標來衡量蛋白質質量[5]。PDCAAS綜合考慮氨基酸評分及真實消化率，能較好地評價蛋白質品質，為測定蛋白質品質的首選方法[6-7]。

前人關于中華鱉蛋白質營養價值的研究，主要從蛋白質含量、蛋白質組成、氨基酸組成及功能性蛋白方面進行[2,8-9]。對于中華鱉蛋白質的消化率及通過真實消化率來計算的PDCAAC尚未見報道。本實驗從體外、體內消化實驗及PDCAAS的角度，分析評價熱處理前后中華鱉腿肉的蛋白質營養特性，一方面對熱處理對蛋白質品質的影響進行初步探討，另一方面為中華鱉腿肉蛋白質更全面的營養價值評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中華鱉由上海尚達水產科技發展有限公司提供，體質量為550～750 g，樣品數量20 只。飼料由南通特洛菲飼料科技有限公司按照美國AIN-93標準生產。實驗大鼠由上海湯寶生物科技服務社提供，清潔級，雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質量為50～70 g。

胃蛋白酶（P7000）、胰酶（V900486） 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Kieltel 8400凱氏定氮儀 丹麥福斯公司；L-8800氨基酸自動分析儀 日本日立公司；970CRT熒光分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將鮮活的中華鱉宰殺，取腿部肌肉攪碎后分成3 部分。一部分直接分裝，于-20 ℃條件下保存；一部分進行冷凍干燥處理，得到生中華鱉粉；最后一部分進行蒸煮處理（溫度100 ℃、時間15 min、料液比1∶1.5）后，再進行冷凍干燥獲得熟中華鱉粉。

1.3.2 飼料加工

飼料配方如表1所示。

表1 蛋白質體內消化實驗飼料配方Table1 Feed formulations used for in vivo protein digestion trials g/100 g

1.3.3 氨基酸組成的測定

使用氨基酸自動分析儀測定除色氨酸外的17 種氨基酸含量[10]，色氨酸含量采用熒光分光光度法[11]測定。

1.3.4 蛋白質體外消化實驗

參照Akeson等[12]建立的胃蛋白酶-胰酶體外消化模型進行實驗，并略作修改。

1.3.4.1 模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）消化實驗

稱取0.5 g攪拌均勻的腿肉于三角燒瓶中，添加15 mL模擬胃液（0.1 g胃蛋白酶溶于1 L 0.1 mol/L鹽酸，pH 1.5），在恒溫振蕩水浴鍋中37 ℃水浴3 h進行消化。1.3.4.2 模擬腸液（simulated intestinal fl uid，SIF）消化實驗

用0.2 mol/L的NaOH將1.3.4.1節消化液pH值調整到8.0。之后在反應體系中加入7.5 mL含有0.005 mol/L NaN3的模擬腸液（0.533 g胰酶溶于1 L pH 8.0的磷酸鹽緩沖液），繼續在恒溫振蕩器水浴鍋中37 ℃水浴加熱24 h。

模擬腸液消化實驗結束后，向反應體系中添加10 mL 20%的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）終止反應。

1.3.4.3 體外蛋白質消化率計算

模擬胃液消化率（protein digestibility in gastric fl uid，PDG）、模擬腸液消化率（protein digestibility in intestinal fluid，PDI）及總消化率（total protein digestibility，PDT）按照公式（1）～（3）進行計算。

式中：P0為樣品中的蛋白質含量/（g/100 g）；P1為模擬胃液消化后剩余蛋白質含量/（g/100 g）；P2為模擬腸液消化后剩余蛋白質含量/（g/100 g）。

1.3.5 蛋白質體內消化實驗

1.3.5.1 體內消化實驗

參照AOAC 991.29《True Protein Digestibility of Foods and Food Ingredients》及Wong等[13]的方法，采用大鼠糞氮平衡實驗進行蛋白質體內消化研究。實驗室飼養SD大鼠2 d后，隨機分成4 組：標準酪蛋白組、無氮飼料組、生中華鱉粉組及熟中華鱉粉組。其中酪蛋白飼料（蛋白質含量10%）為對照組，無氮飼料為空白組，生中華鱉粉及熟中華鱉粉飼料（蛋白質含量10%）為實驗組。每組8只，每只大鼠在代謝籠中單籠飼養。飼養實驗分為4 d的預備期和5 d的平衡期。在5 d的平衡期中，每天收集未攝食的飼料殘渣及老鼠糞便、尿液，并分裝在不同的容器中。飼料殘渣收集后風干3 d，之后進行稱質量。大鼠糞便及殘渣經100 ℃干燥、稱質量、研磨后進行蛋白質含量的測定。整個實驗過程，保證大鼠自由飲水，限制每只大鼠攝食量為15 g/d。

1.3.5.2 評價指標計算

蛋白質真實消化率（true digestibility，TD）、生物價（biological value，BV）、凈蛋白利用率（net protein utilization，NPU）以及蛋白質消化率校正的氨基酸評分分別根據公式（4）～（7）計算[14]。

式中：Ni為攝入氮含量/（mg/d）；Fn為糞氮含量/（mg/d）；Fk為糞代謝氮含量/（mg/d）；Un為尿氮含量/（mg/d）；Uk為尿內源氮含量/（mg/d）；LAAS為最低限制性氨基酸評分（limiting amino acids score）。

1.4 數據處理

數據采用SPSS 20.0進行單因素方差顯著性分析，統計值用±s表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 氨基酸組成分析

表2 熱處理前后中華鱉腿肉的氨基酸組成（x±s，n＝3）Table2 Amino acid composition of Chinese soft-shelled turtle muscle protein (x±s,n= 3)

由表2可知，熱處理前后樣品中均檢測出18 種氨基酸，其中谷氨酸含量最高，分別為14.00%、13.21%。熱處理過程中由于營養物質流失到蒸煮液中，中華鱉腿肉氨基酸總量（total amino acids，TAA）、必需氨基酸總量（total essential amino acids，TEAA）均低于熱處理前的樣品。熱處理前后，兩者TEAA/TAA、TEAA/非必需氨基酸總量（total nonessential amino acids，TNEAA）均符合FAO/WHO推薦的TEAA/TAA為40%左右、TEAA/TNEAA在60%以上這一理想氨基酸組成模式[15]，為優質蛋白質來源。

表3 熱處理前后中華鱉腿肉必需氨基酸含量及其評分Table3 Contents and amino acid scores of essential amino acids in Chinese soft-shelled turtle meat

由表3可知，熱處理前后樣品必需氨基酸總量均高于FAO/WHO推薦的32.0[6]，但低于雞蛋中的49.0。根據氨基酸評分（amino acid scores，AAS），Trp的AAS在熱處理前、后的樣品中均表現最低，分別為115、80。熱處理前中華鱉腿肉必需氨基酸評分均高于100，與湯崢嶸等[16]的研究結果一致，氨基酸組成十分均衡，為優質蛋白質來源。

2.2 體外消化實驗

表4 熱處理前后中華鱉腿肉蛋白質體外消化率（x±s，n＝3）Table 4in vitro digestibility of Chinese soft-shelled turtle protein (x±s, n= 3) %

前期實驗測得，熱處理前中華鱉腿肉蛋白質含量為18.20%，熱處理后腿肉蛋白質含量為24.36%[2]。由表4可知，經過整個蛋白質體外消化過程，熱處理前其腿肉蛋白質消化率為83.68%，高于帶魚[17]的80.96%、牛肉[12]的80%等肉類。在胃液中，胃蛋白酶能水解含芳香族氨基酸、蛋氨酸、亮氨酸等氨基酸殘基的蛋白質，把蛋白質分解成多肽。但由于胃蛋白酶的消化作用較弱，食物在胃中停留時間較短，所有蛋白質在胃中的消化很不完全。食糜進入小腸后，蛋白質的不完全水解產物會在腸液中進一步被分解[18]。整個消化過程中，71.79%的蛋白質在模擬胃液中被分解，在模擬腸液中有11.89%的蛋白質及前者的不完全分解產物被進一步消化。

對比熱處理前后中華鱉腿肉蛋白質消化率，可以發現經過熱處理后的PDG、PDI及PDT值均高于熱處理前，且PDG、PDT值差異顯著（P＜0.05），這個結論與Sun Minjie等[19]關于熱處理對蛋白質消化率影響的研究結論類似。消化率的提高可能是熱處理使蛋白質發生了不同程度的變性，比如蛋白質的伸展、重組，分子間氫鍵、二硫鍵部分斷裂等，最終蛋白質結構的改變導致其消化率發生變化[20]。

2.3 體內消化實驗

表5 體內消化實驗中大鼠的攝食及體質量增加結果（x±s，n＝8）Table5 Food intake and weight gain in rats from in vivo digestion trials (x±s,n= 8) g/d

表5是酪蛋白組與實驗組大鼠攝食量（Fi）、蛋白攝入量（Pi）及體質量增量（weight gain，Wg）的結果，對照組（酪蛋白組）與實驗組在攝食、蛋白攝入量、體質量增量上沒有顯著性差異（P＞0.05）。理論上通過體內消化實驗評估蛋白質品質，如果實驗組蛋白質品質低于酪蛋白組，動物的攝食就會減少。如果實驗組與酪蛋白組的攝食量出現顯著性差異，導致實驗組攝入的蛋白質部分用于能量及蛋白組織的合成，則實驗結果將會受到影響[21]。

表6 熱處理前后中華鱉蛋白質體內消化實驗營養評價指標（x±s，n＝8）Table6 Nutritional assessment indicators showing the in vivo digestibility of Chinese soft-shelled turtle protein (x±s,n= 8)

體外消化實驗數據說明中華鱉腿肉蛋白質具有較好的消化性，且經過熱處理中華鱉腿肉蛋白質的消化率呈現出顯著性提升。為此，實驗又進一步通過體內消化實驗對結果進行了驗證。實驗結果如表6所示。熱處理后中華鱉粉蛋白質消化率為96.18%，顯著高于熱處理前的95.05%，與體內消化率研究結果相同，進一步驗證了熱處理可以提高蛋白質消化率這一結論。對比酪蛋白組消化率，熟中華鱉粉與酪蛋白之間的消化率差異不顯著，但兩者均顯著高于生中華鱉粉，說明熱處理后的中華鱉腿肉蛋白質品質與酪蛋白相當，但低于牛肉的98%[5]。蛋白質生物價（BV）是反映食物蛋白質消化吸收后被機體利用程度的指標，BV值越高，說明被機體利用程度較高。中華鱉腿肉熱處理前，其BV值為94.50%，略高于酪蛋白93.78%，差異不顯著，但明顯高于魚肉（83%）、牛肉（76%）、豬肉（74%）[3]等肉類蛋白質。蛋白質凈利用率（NPU）在BV的基礎上，進一步考慮了在消化過程中未吸收而丟失的氮，將生物價乘以消化率。熱處理前后中華鱉腿肉的NPU值與酪蛋白組均沒有顯著性差異。綜上所述，中華鱉腿肉的TD、BV、NPU 3 個評價指標均表明其蛋白質具有較高的營養價值，可作為優質蛋白的來源。2.4 蛋白質消化率校正的氨基酸評分

PDCAAS是基于氨基酸組成與消化率的蛋白質評價指標，該指標綜合考慮氨基酸評分及真實消化率，能較好的評價蛋白質品質。PDCAAS最大為100%，當PDCAAS大于100%時則認定為100%，表示蛋白質在消化后能夠提供給機體需求的100%氨基酸[6,22]。由表3的氨基酸評分及表6的TD值分析得出，熱處理前其PDCAAS為100%，熱處理后中華鱉腿肉PDCAAS為76.94%。熱處理前中華鱉腿肉蛋白質的PDCAAS與乳清蛋白、酪蛋白、雞蛋蛋白、大豆蛋白等優質蛋白一致，高于牛肉92%[5]，表明其營養價值高，易于消化吸收[23]。

3 結 論

中華鱉腿肉氨基酸組成、體內外消化實驗及PDCAAS等研究結果均表明其蛋白質為優質蛋白質來源。中華鱉腿肉各必需氨基酸評分均高于100，且其PDCAAS得分為100%。熱處理后的腿肉蛋白質由于蒸煮過程，一部分營養物質流失到湯汁中，總氨基酸含量減少，PDCAAS得分為76.94%。雖然熱處理前后氨基酸組成發生了變化，但其TEAA/TAA、TEAA/TNEAA比值均符合FAO/WHO推薦的理想模式。

體外消化實驗通過胃蛋白酶-胰酶消化模型模擬了食物在人體消化道內的消化過程，實驗先后測定熱處理前后中華鱉腿肉蛋白質在模擬胃液、模擬腸液消化率及總消化率。結果表明，中華鱉腿肉消化率為83.68%，熱處理后其消化率顯著提高（87.04%）。體內消化實驗又通過大鼠糞氮平衡實驗進一步對結果進行驗證，熱處理后蛋白質體內消化率96.18%高于熱處理前蛋白質消化率95.05%。體內外消化消化實驗表明熱處理能提高中華鱉腿肉蛋白質消化率，更容易被人體消化吸收。

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Digestibility in vitro and in vivo of Chinese Soft-Shelled Turtle Protein

ZHANG Dan, WANG Xi-chang*
(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The nutritional value of Chinese soft-shelled turtle leg muscle protein before and after heat treatment was evaluated based on amino composition, in vitro and in vivo digestibility and protein digestibility-corrected amino acid score (PDCAAS). The results showed that the contents of essential amino acids were 36.84% and 34.55%, respectively before and after heat treatment. The ratios of total essential amino acids to total amino acids (TEAA/TAA) were 41.12% and 40.20%, respectively, meeting the FAO/WHO standard. The in vitro and in vivo digestibility of Chinese soft-shelled turtle protein were 83.68% and 95.05%, and increased to 87.04% and 96.18%, respectively after heat treatment. These results suggested that heat treatment signif i cantly increased the in vitro and in vivo digestibility (P ＜ 0.05). The PDCAAS of Chinese softshelled turtle, as calculated by multiplying the limiting amino acid score by protein digestibility, reduced from 100% to 76.94% due to the nutrient losses during cooking.

Chinese soft-shelled turtle; in vitro digestibility; in vivo digestibility; protein digestibility-corrected amino acid scores (PDCAAS)

TS254.1

A

1002-6630（2014）21-0113-05

10.7506/spkx1002-6630-201421022

2014-06-30

上海市科委工程中心建設項目（11DZ2280300）；上海市教委重點學科建設項目（J50704）；上海高校知識服務平臺《上海海洋大學水產動物遺傳育種中心》項目（ZF1206）

張丹（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品營養與安全。E-mail：546392607@qq.com

*通信作者：王錫昌（1964—），男，教授，博士，研究方向為食品營養與安全。E-mail：xcwang@shou.edu.cn